特制牛肉湯對腦缺血大鼠外周血白細胞介素-1β和干擾素-γ的影響

李丹丹 王 辛 馬 茜 蔣 立 王愛紅

(南京醫(yī)科大學康達學院，江蘇 連云港 222002)

特制牛肉湯對腦缺血大鼠外周血白細胞介素-1β和干擾素-γ的影響

李丹丹1王 辛1馬 茜1蔣 立1王愛紅1

(南京醫(yī)科大學康達學院，江蘇 連云港 222002)

目的研究特制牛肉湯對腦缺血大鼠外周血白細胞介素(IL)-1β及干擾素(IFN)-γ的影響。方法將96只雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表分為假手術組、模型組、特制牛肉湯組和肌肽組，每組24只。模型組、特制牛肉湯組和肌肽組采用線栓法制備永久性大腦中動脈閉塞模型(pMCAO)，于術后清醒2 h內首次灌胃給藥，特制牛肉湯組予600 mg·kg-1·d-1特制牛肉湯，肌肽組予600 mg·kg-1·d-1肌肽水溶液。假手術組與模型組予等量無菌生理鹽水，每日2次，各組大鼠分別于造模后1 d，3 d和7 d處死，各組各時點8只大鼠。采用Longa評分法進行神經功能缺損評分，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測定腦梗死體積分數(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測外周血中IL-1β、IFN-γ表達。結果腦缺血后，各時點模型組大鼠神經功能評分顯著上升；與模型組相比，予特制牛肉湯7 d后，腦缺血大鼠神經功能評分顯著下降(Plt;0.05)。腦缺血后，模型組、特制牛肉湯組和肌肽組均可見大腦中動脈供血區(qū)梗死灶。與模型組相比，予特制牛肉湯和肌肽1 d和3 d后，腦梗死體積分數(shù)有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯7 d后，腦梗死體積分數(shù)顯著降低(Plt;0.01)。腦缺血后，各時點模型組大鼠外周血IL-1β水平顯著上升(Plt;0.05)，與模型組相比，予特制牛肉湯7 d后，IL-1β水平明顯下降(Plt;0.05)；予肌肽7 d后，IL-1β有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(Pgt;0.05)。腦缺血后3 d和7 d，模型組大鼠外周血IFN-γ水平顯著上升(Plt;0.05)，與模型組相比，予特制牛肉湯和肌肽7 d后，IFN-γ水平明顯下降(Plt;0.01)。結論特制牛肉湯通過下調促炎細胞因子IL-1β、IFN-γ表達，從而減輕腦缺血大鼠炎癥反應，改善神經功能缺損癥狀，對腦起保護作用。

特制牛肉湯；腦缺血；白細胞介素-1β；干擾素-γ

炎性損傷在腦缺血后繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用，白細胞介素(IL)-1β與干擾素(IFN)-γ作為主要促炎介質，放大復雜信號級聯(lián)效應，誘導其他傷害性分子〔誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6等〕釋放，加重腦缺血損傷〔1,2〕。本課題組前期依據(jù)“藥食同源”理念制備的特制牛肉湯經游離氨基酸檢測，肌肽含量豐富。既往研究表明，肌肽可以通過抑制腦缺血后炎癥反應，調節(jié)機體免疫功能，對腦起保護作用〔3〕。故本實驗設置肌肽水溶液為陽性對照藥，觀察特制牛肉湯和肌肽對腦缺血后大鼠促炎性細胞因子IL-1β、IFN-γ表達和腦梗死體積的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠96只，SPF級，體質量(300±20)g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，合格證號：201500397，許可證號：SCXK(蘇)2013-0003。飼養(yǎng)溫度(22±3)℃，光照∶黑暗=12 h∶12 h，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d，自由進食、飲水，造模前12 h禁食，不禁水。

1.2主要試劑與儀器 肌肽(Sigma公司，美國)；大鼠IL-1β血清檢測ELISA試劑盒(建成生物公司，南京)；大鼠IFN-γ血清檢測ELISA試劑盒(Raybiotech公司，美國)；線栓(沙東生物技術有限公司，北京)；腦切片模具(瑞沃德，深圳)；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀(亞榮儀器有限公司，上海)；VICTORTMX3多標記檢測系統(tǒng)(PerkinElmer公司，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1熬制特制牛肉湯 參照前期方法熬制特制牛肉湯〔4〕。購精選牛腿肉，去油脂和筋膜后使用電子天平準確稱重1 kg，切成2 cm3方塊狀碎肉，使用電動絞肉機絞成肉糜狀，放入鍋中慢燉12 h。靜置片刻去浮油，過濾取上清，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮牛肉湯原液約至60 ml，經氨基酸分析儀營養(yǎng)成分檢測，特制牛肉湯中肌肽含量約為36.34 mg/ml。

1.3.2動物分組及給藥 按隨機數(shù)字表將大鼠分為假手術組，模型組，特制牛肉湯組和肌肽組，每組再分為1 d，3 d和7 d三個亞組，每個亞組各8只。特制牛肉湯劑量的確定以湯中肌肽含量為標準，故特制牛肉湯組給予600 mg·kg-1·d-1特制牛肉湯灌胃，肌肽組給予600 mg·kg-1·d-1肌肽水溶液灌胃，假手術組和模型組給予等量無菌生理鹽水灌胃，每組的三個亞組干預時間為1 d、3 d和7 d，每天早晚2次。

1.3.3腦缺血模型制備 參照Longa等〔5〕報道的方法，采用線栓法復制大鼠右側永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)模型：10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，頸部備皮、消毒，取頸正中切口，暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，結扎CCA和ECA的近端，用動脈夾夾閉ICA后在CCA游離段上剪一小口，并在小口下系一松結，將制備好的尼龍線栓經CCA分支處順I(yè)CA走向緩慢推進入顱，線栓標記處(18 mm)進入CCA與ICA分叉處，系緊小口下松結。模型成功標志：大鼠蘇醒后提尾懸拉出現(xiàn)左上肢蜷縮屈曲，爬行時向左側轉圈或跌倒，若符合上述癥狀但有蛛網膜下腔出血及術后死亡者，予以剔除并用同一批次大鼠隨機補足。假手術組不插入線栓，僅切開皮膚分離右側CCA、ECA和ICA后縫合。

1.3.4神經行為學評分 參照Bederson五級四分法在相應時間點分別進行評分。0分：無神經功能缺損癥狀；1分:輕微神經功能缺損，提尾倒懸時不能完全伸展左側前爪；2分：中度神經功能缺損，爬行時向左側轉圈；3分：重度神經功能缺損：身體向左側傾倒；4分：不能自發(fā)爬行，意識水平下降。

1.3.5腦切片TTC染色 術后相應時間點，用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，斷頭取腦，置于-20℃冰箱速凍20 min，去嗅球和低位腦干，自額極后間隔2 mm連續(xù)取冠狀切片5片，并將切片放至2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，避光孵育30 min，為保證染色均勻，每隔15 min翻轉一次。待孵育結束后，將腦切片放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，拍照，紅色區(qū)域為正常腦組織，蒼白區(qū)域為梗死區(qū)。使用Image Pro-Plus6.0(IPP)圖像處理軟件，計算梗死灶體積和腦片對側正常半球的體積，腦梗死體積分數(shù)(%)=患側梗死體積/對側半球體積×100%。

1.3.6血清IL-1β和IFN-γ檢測 術后1 d、3 d和7 d，各組大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉后，經心臟采血，留取血液標本，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-1β、IFN-γ含量，具體步驟按試劑盒說明書操作。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析、LSD法、DunnettT3法、Kruskal-WallisH檢驗及Wilcoxon秩和檢驗。

2 結 果

2.1特制牛肉湯對腦缺血大鼠神經功能缺損評分的影響 各時點假手術組均未出現(xiàn)神經功能缺損癥狀，神經功能評分均為0分。與假手術組比較，腦缺血后1 d、3 d和7 d，模型組均表現(xiàn)出明顯的肢體癱瘓。與模型組相比，予肌肽或特制牛肉湯1 d和3 d未改善神經功能缺損癥狀(Pgt;0.05)，予肌肽7 d后，神經功能評分有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯7 d后，神經功能評分顯著下降(Plt;0.05)，見表1。

2.2特制牛肉湯對腦缺血大鼠腦梗死體積分數(shù)的影響 假手術組未見白色梗死灶，模型組、特制牛肉湯組和肌肽組右側大腦中動脈供血區(qū)域均可見明顯梗死灶，見圖1。表2可見，與模型組相比，予特制牛肉湯和肌肽1 d及3 d后，腦梗死體積分數(shù)有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯7 d后，腦梗死體積分數(shù)顯著下降(Plt;0.01)，予肌肽7d后，腦梗死體積分數(shù)呈下降趨勢，但無明顯統(tǒng)計學差異(Pgt;0.05)。

表1 各組各時點神經功能缺損評分比較〔M(Q25，Q75)，n=8〕

與模型組比較：1)Plt;0.05

圖1 各組術后7 d腦組織大體觀察(TTC染色)

組別缺血后1d缺血后3d缺血后7d假手術組000模型組35.70±20.6649.43±16.7248.20±20.59特制牛肉湯組29.79±22.1532.01±12.5619.85±10.301)肌肽組27.30±20.5140.64±6.3730.58±17.61F值P值0.2500.7821.3430.2914.3910.032

與模型組比較：1)Plt;0.01

2.3特制牛肉湯對腦缺血大鼠外周血IL-1β水平的影響 假手術組外周血有低水平IL-1β蛋白表達。與假手術組比較，模型組腦缺血后1 d，外周血IL-1β水平顯著增加，3 d達到高峰，7 d 略微下降，均有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。與模型組相比，予肌肽后，各時點外周血IL-1β表達均有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(Pgt;0.05)；予特制牛肉湯1 d和3 d后，外周血IL-1β表達雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異(Pgt;0.05)，予特制牛肉湯7 d后，外周血IL-1β表達下降顯著(Plt;0.05)，見表3。

表3 各組各時點腦缺血大鼠外周血IL-1β水平比較

與假手術組比較：1)Plt;0.05；與模型組比較：2)Plt;0.05

2.4特制牛肉湯對腦缺血大鼠外周血IFN-γ水平的影響 假手術組外周血有低水平IFN-γ蛋白表達。與假手術組相比，模型組各時點外周血IFN-γ水平迅速上升，但僅腦缺血3 d和7 d后有統(tǒng)計學差異(Plt;0.05)。與模型組相比，予肌肽組和特制牛肉湯后，各時點外周血IFN-γ水平有下降趨勢，但僅在腦缺血7 d后有統(tǒng)計學差異(Plt;0.01)，見表4。

表4 各組各時點腦缺血大鼠外周血IFN-γ水平比較

與假手術組比較：1)Plt;0.05；與模型組比較：2)Plt;0.01

2.5腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ的相關性 腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ均呈正相關(r=0.946、r=0.867，均Plt;0.01)，見圖2。

圖2 腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ的相關性

3 討 論

在急性缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中，均伴有小膠質細胞活化導致的神經元壞死，既往研究證實〔6，7〕，這與炎癥機制密不可分。該機制以炎癥細胞因子、黏附分子和轉錄因子等為要素發(fā)揮腦組織破壞效應，其中促炎細胞因子IL-1β、IFN-γ發(fā)揮不可忽視的作用。IL-1β啟動IL-1受體介導的信號轉導系統(tǒng)，激活NF-κB等信號通路，調控IL-6、IL-8等促炎癥因子基因的轉錄，加速神經元死亡〔8〕；IFN-γ誘導小膠質細胞合成IL-1β等促炎癥細胞因子，促進抗原提呈細胞(巨噬細胞、樹突細胞)表達MHC-Ⅱ分子，激發(fā)缺血后免疫炎癥級聯(lián)反應，進一步加重腦缺血程度。二者形成惡性循環(huán)，導致炎癥反應持續(xù)存在，腦組織損傷無法恢復〔9〕。因此，調節(jié)其異常表達、阻斷缺血后炎癥級聯(lián)反應對減輕腦損傷至關重要。本研究顯示，腦缺血早期，IL-1β、IFN-γ分泌水平顯著升高，表明永久性腦缺血損傷后，激活相關信號轉導通路，誘導促炎細胞因子IL-1β、IFN-γ釋放，炎性反應失控，這與以往研究結果一致〔10，11〕。另外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)腦梗死體積與IL-1β和IFN-γ存在顯著正相關，提示可以通過聯(lián)合檢測IL-1β和IFN-γ濃度早日識別、評估腦梗死病變發(fā)展的風險，指導臨床相關治療。特制牛肉湯原料為牛肉，牛肉素有“肉中驕子”的美稱，《丹溪心法》曰：牛肉“全重厚和順之性，潤枯澤槁”，是以正氣存內、邪不可干?，F(xiàn)代營養(yǎng)學亦證實，牛肉富含多種有益成分，如B族維生素、礦物質(鐵、鋅)及必需氨基酸等〔12〕。本課題組運用氨基酸分析儀檢測其成分，發(fā)現(xiàn)特制牛肉湯中肌肽含量豐富，這與Guiott等〔13〕研究一致。肌肽是一種結構最為簡單的生物活性肽，不僅具有抗氧化、增強免疫力和神經傳導等生理功能，且可通過抑制炎性反應，延緩神經元凋亡〔14，15〕。本研究顯示，特制牛肉湯組腦保護作用可能是通過調節(jié)促炎細胞因子分泌，進而制約炎癥反應，達到機體內環(huán)境的動態(tài)平衡，發(fā)揮腦保護作用。但特制牛肉湯在抑制炎性因子釋放，改善神經功能障礙，減輕腦組織損傷等方面優(yōu)于肌肽。因此推測除肌肽外，特制牛肉湯中其他成分發(fā)揮協(xié)同抗炎作用，至于哪些成分及具體機制有待進一步探討。目前，肌肽大都采用β-丙氨酸或β-丙氨酸前體和L-組氨酸等原料人工合成，成本高、效率低，且影響脂類的氧化反應及其產物檢測〔16〕。特制牛肉湯制備簡單，口感、療效均優(yōu)于單一制劑肌肽，可作為輔助食療方應用于臨床腦缺血患者飲食治療。

1Zhao J,Zhang X,Dong L,etal.The many roles of statins in ischemic stroke〔J〕.Curr Neuropharmacol,2014;12(6):564-74.

2張廣惠，何明利.血壓變異性與腦卒中風險的關系〔J〕.中國神經醫(yī)學雜志，2014;13(7):749-52.

3Bae ON,Serfozo K,Baek SH,etal.Safety and efficacy evaluation of carnosine an endogenous neuroprotective agent for ischemic stroke〔J〕.Stroke,2013;44(1):205-12.

4馬 茜，朱 潔，王 辛，等.牛肉水煮液對腦缺血大鼠外周血白細胞介素-6和腫瘤壞死因子α的影響〔J〕.中國神經免疫學和神經病學雜志，2015;22(1)：62-6.

5Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

6Iadecola C,Anrather J.The immunology of stroke:from mechanisms to translation〔J〕.Nat Med,2011;17(7):796-808.

7倪光夏，石學敏，王占奎，等.醒腦開竅針刺法對缺血再灌注大鼠大腦皮層IL-1RI和TNFR-1的mRNA表達的影響〔J〕.南京中醫(yī)藥大學學報，2012;28(6):538-40.

8Gabay C,Lamacchia C,Palmer G,etal.IL-1 pathways in inflammation and human diseases〔J〕.Nat Rev Rheumatol,2010;6(4):232-41.

9Schroder K,Hertzog PJ,Ravasi T,etal.Interferon-gamma:an overview of signals,mechanism and functions〔J〕.J Leukoc Biol,2004;75(2)：163-89.

10Denes A,Wilkinson F,Bigger B,etal.Central and haematopoietic interleukin-1 both contribute to ischaemic brain injury in mice〔J〕.Dis Model Mech,2013;6(4):1043-8.

11Yilmaz G,Arumugam TV,Stokes KY,etal.Role of T lymphocytes and interferon-gamma in ischemic stroke〔J〕.Circulation,2006;113(17):2105-12.

12Nicklas TA,O'Neil CE,Zanovec M,etal.Contribution of beef consumption to nutrient intake,diet quality,and food patterns in the diets of the US population〔J〕.Meat Sci,2012;90(1):152-8.

13Guiott OA,Calderan A,Ruzza P,etal.Carnosine and carnosine related antioxidants:review〔J〕.Curr Med Chem,2005;12(20):2293-315.

14Wang JP,Yang ZT,Liu C,etal.L-carnosine inhibits neuronal cell apoptosis through signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway after acute focal cerebral ischemia〔J〕.Brain Res,2013;1507(1):125-33.

15朱 潔，馬 茜，王 辛，等.肌肽對局灶性腦缺血大鼠bcl-2、bax表達的影響〔J〕.天津醫(yī)藥，2015;43(3)：259-62.

16Lee TS,Yook JS,Yook CH,etal.Method for simple preparing L-carnosine and there of with high yield and high purity without purification step〔P〕.KR2007050319,2007.

〔2016-08-25修回〕

(編輯 曹夢園)

R743.3

A

1005-9202(2017)22-5525-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.017

江蘇省優(yōu)勢學科項目資助項目(No.YSHL0201-26)；江蘇省青藍工程項目資助

1 南京中醫(yī)藥大學

王愛紅(1971-)，女，副教授，主要從事心腦血管疾病研究。

李丹丹(1992-)，女，碩士，主要從事心腦血管疾病研究。