微生物誘變育種技術(shù)

李翔

摘 要：介紹了微生物誘變育種的各種方法，對(duì)經(jīng)典的誘變技術(shù)、復(fù)合誘變和新型的誘變技術(shù)等處理方法進(jìn)行了比較。對(duì)離子注入法和等離子體誘變育種等新型誘變育種技術(shù)的機(jī)理進(jìn)行了闡述，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)以及潛在的研究方向進(jìn)行了論述。

關(guān)鍵詞：微生物誘變；離子注入法；等離子體誘變

中圖分類號(hào)：TB 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.34.091

微生物誘變育種是一種基因突變技術(shù)，通過(guò)技術(shù)手段改變微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而篩選出具有特定性狀的，優(yōu)良突變型微生物。這種育種方式，具有較高的微生物變異率，變異速度快，效率高等優(yōu)點(diǎn)，是食品加工和醫(yī)藥生產(chǎn)等工業(yè)的首選方法。

常用的微生物誘變育種方法包括物理法、化學(xué)法和生物法等，其中物理法誘變包括：紫外誘變、X射線誘變和γ射線誘變等，化學(xué)法誘變包括烷基磺酸鹽和烷基硫酸鹽、亞硝基烷基化合物、次乙胺和環(huán)氧乙烷類和芥子氣類），生物法包括基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子誘變等。復(fù)合誘變是指采用兩種及以上的誘變方法，對(duì)微生物進(jìn)行誘變，制的目標(biāo)菌株。通常僅采用一種方法進(jìn)行誘變，會(huì)使微生物產(chǎn)生抗性，從而降低突變率，復(fù)合誘變具有補(bǔ)充不同誘變方法之間缺陷的優(yōu)勢(shì)。

近些年涌現(xiàn)出一批創(chuàng)新的誘變技術(shù)，如離子注入誘變法、大氣壓冷等離子誘變，其中離子注入誘變法具有與復(fù)合誘變相似的特性，日趨成為研究誘變技術(shù)的主流方向。

原生質(zhì)體是包含細(xì)胞膜和膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)及其他具有生命活性細(xì)胞器的生物質(zhì)，對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)即去除細(xì)胞壁的細(xì)胞。原生質(zhì)體也可以作為誘變的對(duì)象，其對(duì)外界敏感度很高，因此變異率也很高。

1 經(jīng)典誘變技術(shù)

1.1 物理誘變

1.1.1 紫外誘變

DNA由以嘌呤和嘧啶為堿基的核苷酸組成，紫外線誘變可以使嘧啶形成二聚體，DNA在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄時(shí)，因存在嘧啶二聚體而不能分離，進(jìn)而發(fā)生變異。該方法簡(jiǎn)單、操作安全且誘變率高，其缺點(diǎn)：誘變?cè)砗?jiǎn)單，引起的突變單一，形成的突變體類型較少，而對(duì)于基因損傷及其修復(fù)的研究卻很有意義?，F(xiàn)在，對(duì)于細(xì)菌、酵母菌或霉菌的紫外誘變往往是對(duì)其原生質(zhì)體的誘變，缺少了細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞的保護(hù)，紫外線可以更直接的作用于DNA，提高突變率，從而產(chǎn)生更多的突變體和表現(xiàn)型。

1.1.2 激光誘變

該方法是利用了激光輻射的光、電、熱、壓力、磁的綜合效應(yīng)對(duì)生物遺傳物質(zhì)引起突變，使細(xì)胞中DNA分子吸收、積聚能量并進(jìn)行能量再分配，導(dǎo)致DNA處于易突變狀態(tài)，繼而發(fā)生一系列斷鍵、聚合、交聯(lián)等變化，從而引起DNA的損傷和突變。該方法優(yōu)點(diǎn)包括變異類型較豐富、遺傳較穩(wěn)定，缺點(diǎn)是成本較高。

1.2 化學(xué)誘變

1.2.1 烷化劑

烷化劑類化學(xué)誘變劑是化學(xué)誘變常用方法之一，且種類很多，如硫芥、氮芥、乙撐亞胺類、環(huán)氧衍生物類、硫酸（磺酸）酯類等。哈霞等以甲基磺酸乙酯（EMS）為誘變劑，對(duì)大豆疫霉菌進(jìn)行誘變，建立了包含640個(gè)單卵孢子系的突變體庫(kù)，50%的誘變菌系在形狀和菌落形態(tài)方面發(fā)生了明顯變化，在卵孢子產(chǎn)量方面，8.13%的菌系有增加，20.41%的菌系減少，27.82%的菌系極少或者沒(méi)有卵孢子產(chǎn)生，43.64%的菌系卵孢子產(chǎn)量類似野生型。并估算甲基磺酸乙酯對(duì)大豆疫菌霉的誘變頻率至多每115kb發(fā)生一個(gè)核苷酸變異。

1.2.2 堿基類似物

堿基類似物主要有嘧啶類似物和嘌呤類似物兩大類。

1.2.3 移碼誘變劑

該類化學(xué)誘變劑能引起DNA分子中遺傳物質(zhì)堿基發(fā)生移位的一類化學(xué)劑。顧真榮等利用吖啶橙誘變枯草芽孢桿菌G3，得到的突變株抗真菌活性提高，合成伊枯草菌素A的能力也增強(qiáng)。

2 復(fù)合誘變

該誘變方法是將上述幾種誘變方法進(jìn)行結(jié)合，如激光可與紫外結(jié)合做復(fù)合誘變，取得了良好的效果，韓文霞等首次利用15W的He-Ne激光輻照天麻素合成菌華根霉LN-A的原生質(zhì)體20min，再用紫外輻照150s得到的突變株，轉(zhuǎn)化率和天麻素得率都顯著提高，與出發(fā)菌株相比，天麻素得率提高20%以上。祝子坪等利用He-Ne激光與紫外線復(fù)合誘變桑黃菌原生質(zhì)體，篩選出5株變異株S1-S5，且其菌絲發(fā)酵產(chǎn)量比出發(fā)菌株均有不同程度的提高，具有穩(wěn)定遺傳性，估算表明此復(fù)合誘變優(yōu)于單純紫外誘變?；瘜W(xué)誘變之間也可以做復(fù)合誘變，湯衛(wèi)華等為選育高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的木葡糖酸醋桿菌突變菌株，選用硫酸二乙酯和氯化鋰為誘變劑進(jìn)行復(fù)合誘變，得到一株產(chǎn)細(xì)菌纖維素能力最高的突變菌株 GO2，其細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為 9.91 g/L，比出發(fā)菌株提高 36.5%。還有物理與化學(xué)誘變相結(jié)合的復(fù)合誘變，Ellaiah 等人通過(guò)將紫外險(xiǎn)和亞硝基胍進(jìn)行復(fù)合誘變，得到的頭孢菌素高產(chǎn)突變株 C 產(chǎn)量較原始菌提高2. 4 倍。

實(shí)際上，單純的物理誘變或化學(xué)誘變都可能由于產(chǎn)生的變異種類過(guò)于單一或只能產(chǎn)生單個(gè)堿基的突變，而沒(méi)能得到效果好的菌株或得到的突變株不能穩(wěn)定遺傳，而復(fù)合誘變由于誘變種類不同，至少產(chǎn)生兩種不同的變異類型，從一定程度上彌補(bǔ)了單一誘變的缺陷，因此應(yīng)用非常廣泛。

3 誘變創(chuàng)新技術(shù)

3.1 離子注入誘變法

該誘變法本是材料表面改性的一種傳統(tǒng)方法，應(yīng)用時(shí)，離子產(chǎn)生器產(chǎn)生的離子在真空環(huán)境中（真空可以減少離子碰撞）經(jīng)適當(dāng)?shù)募铀俸秃Y選，帶有相同能量的離子被導(dǎo)入反應(yīng)室，離子和目標(biāo)物便開(kāi)始反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)能量，將離子大致分為五個(gè)等級(jí)：熱離子（<1eV）、過(guò)熱離子（1-100eV）、低能離子（0.1-10keV）、中能離子（10-500keV）和高能離子（>500keV）。

3.1.1 離子注入誘變的基本原理

離子注入的對(duì)象如果是晶體，離子對(duì)其表面的原子作用的宏觀現(xiàn)象以及微觀過(guò)程的研究都可以很清楚，而生物體是由固液氣組成的復(fù)雜體系，而且不斷變化，無(wú)論是宏觀現(xiàn)象還是微觀過(guò)程，都很難作出準(zhǔn)確的判定，但還是有規(guī)律可循的。生物系統(tǒng)中的功能性分子包括DNA、蛋白質(zhì)、多肽、脂類和激素等，離子的注入對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響首先要對(duì)這些生物小分子產(chǎn)生作用，而離子對(duì)它們不僅有物理的作用和化學(xué)的作用，還有生物的效應(yīng)，不僅有直接的作用，還有間接的作用即次級(jí)效應(yīng)。次級(jí)效應(yīng)是注入的離子與生物分子反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物與生物分子的反應(yīng)。當(dāng)活的細(xì)胞受到上述產(chǎn)生的粒子或輻射作用時(shí)，這種復(fù)雜的效應(yīng)往往會(huì)導(dǎo)致多數(shù)細(xì)胞死亡，但在少數(shù)未死亡的細(xì)胞中如果其DNA的損傷以SOS機(jī)制修復(fù)，則極有可能會(huì)引起基因突變，這些突變?nèi)绻荒軐?dǎo)致細(xì)胞死亡，就會(huì)被保留下來(lái)。生物體就是由于這些物理的、化學(xué)的和生物的作用造成DNA的損傷和再修復(fù)的過(guò)程完成變異的。endprint

3.1.2 離子注入對(duì)細(xì)胞的影響

離子注入對(duì)細(xì)胞誘變的機(jī)理從一定程度上闡述了其對(duì)遺傳物質(zhì)的影響，然而它對(duì)細(xì)胞的其他部分也有相當(dāng)大的影響。離子注入首先導(dǎo)致的是物理?yè)p傷，對(duì)于植物或微生物的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，首當(dāng)其沖的就是細(xì)胞壁，即細(xì)胞壁表面的刻蝕，L.D. Yu等通過(guò)離子束對(duì)植物和微生物細(xì)胞壁的刻蝕，研究基因遷移的機(jī)理，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁上的類似納米孔洞的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可以作為生物大分子轉(zhuǎn)移的通道。為了研究離子注入對(duì)細(xì)胞通透能力的影響，T.Vilaithong等將低能Ar+離子注入多種植物細(xì)胞組織以及大腸桿菌，并測(cè)試對(duì)臺(tái)盼藍(lán)（細(xì)胞染料，簡(jiǎn)稱TB）染料和質(zhì)粒這類外生大分子的轉(zhuǎn)移作用，結(jié)果表明20keV的Ar離子注入能使TB留在細(xì)胞壁中，而30keV的Ar離子注入能使TB進(jìn)入細(xì)胞，這說(shuō)明一個(gè)合適的劑量能使細(xì)胞壁的通透能力大大加強(qiáng)。

離子對(duì)細(xì)胞壁的刻蝕可以增加其通透性，能量稍大的離子可以穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生進(jìn)一步反應(yīng)。如果注入的離子為N+，則N+與水反應(yīng)可生成HCN和氨基酸，這些都是有機(jī)體成分的重要前體。將CO2+或CH4+離子注入氨水或N+注入水中所形成的氨基化合物中，就會(huì)形成大量的有機(jī)物，其中包括胞嘧啶、D-核糖、D-2-脫氧核糖和NH4H2PO4，而且通過(guò)HPLC和1H-NMR分析法可以得到5'-CMP和5'-dCMP。因此，可得出離子與胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生的反應(yīng)會(huì)很復(fù)雜，形成多種有機(jī)物，由于細(xì)胞內(nèi)成分非常復(fù)雜，而且多變，對(duì)于具體的產(chǎn)物及其產(chǎn)生過(guò)程的研究非常有難度，這方面內(nèi)容還鮮有報(bào)道。

離子進(jìn)入細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞影響最大的是與其遺傳物質(zhì)的反應(yīng)，這是直接影響到細(xì)胞存活與否和后代性狀的根本因素。Yong Zhao等用能量為30ekV，密度為2×1010 - 8.2×1013 ions/cm2的低能N+離子轟擊在鋁片表面涂成的pGEM-3Zf（-）質(zhì)粒膜，質(zhì)粒中DNA鏈（包括單鏈、雙鏈和多鏈）經(jīng)電泳檢測(cè)均出現(xiàn)DNA碎片。Chanisorn Ngaojampa等用不同能量和不同速率的N+離子轟擊裸DNA，并用分子模擬來(lái)得出DNA分子中的鍵長(zhǎng)不同也使離子注入對(duì)DNA造成的傷害有一定的特異性。這也驗(yàn)證了離子注入可以直接作用于遺傳物質(zhì)，并對(duì)其造成傷害。

3.1.3 離子注入細(xì)胞誘變的實(shí)際應(yīng)用

離子注入基于以上優(yōu)勢(shì)，使其在誘變育種中得到廣泛應(yīng)用。He Song等人采用劑量為7×1015ions/cm2，能量為10keV的N+離子注入Arthrobacter NG-1菌誘變，進(jìn)而制得cAMP高產(chǎn)菌株，與原始菌株相比，產(chǎn)出的cAMP濃度高出41.7%，高達(dá)9.79g/L且性狀較穩(wěn)定。劉國(guó)生等以3×1015 ions/cm2劑量的N+離子照射枯草芽孢桿菌，獲得兩株肌苷高產(chǎn)株產(chǎn)量分別為14.83g/L和14.38g/L，與原始菌株相比，分別提高16.3%和12.8%。

雖然該方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是也存在不足之處：該方法對(duì)環(huán)境嚴(yán)格要求真空，微生物中由于含有大量的水分，在抽真空時(shí)，水分的大量蒸發(fā)，不僅破壞離子束真空，也使細(xì)胞急劇冷卻或過(guò)度失水而導(dǎo)致失活；離子的高速運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致高溫，注入時(shí)可能因細(xì)胞過(guò)熱而失活。微生物還未開(kāi)始誘變，就已經(jīng)大量死亡，這種誘變方法為了適用于微生物的誘變育種，還需要繼續(xù)探索改進(jìn)。

3.2 等離子體誘變育種

等離子體是物質(zhì)的第四態(tài)，由大量相互作用的但仍處于非束縛狀態(tài)下的帶電微粒組成的宏觀體系，它具有特殊的光、熱、聲、電和磁等物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)在臭氧合成、紫外光源設(shè)備、高功率CO2激光器的制造、碳材料的表面改性等許多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在前人的許多研究中等離子體作為一種物理滅菌手段，具有快速、低溫、操作簡(jiǎn)便、無(wú)毒性及殺滅效果好等優(yōu)點(diǎn)。等離子體誘變是在其滅菌原理基礎(chǔ)上，近幾年才起步發(fā)展的一種誘變方法。在誘變育種的應(yīng)用中，由于生物的熱敏性只能采用冷等離子，該方法既避免了化學(xué)方法的變異專一性和高污染性，也解決了傳統(tǒng)物理誘變的變異率低、遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。與近年興起的離子注入誘變技術(shù)相比，此誘變技術(shù)對(duì)真空腔的要求不高，不會(huì)由于真空產(chǎn)生的低溫而損傷細(xì)胞，也不會(huì)由于離子束產(chǎn)生高溫而損傷細(xì)胞，因此等離子誘變可以很大的提高細(xì)胞的存活率，增大誘變效率。因此是很適合于微生物誘變育種的方法。

等離子體誘變的機(jī)理解釋并未發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道，但等離子體與離子注入的產(chǎn)生源是非常相似的，它們都會(huì)產(chǎn)生離子，不同之處在于離子注入可以產(chǎn)生高速離子來(lái)刻蝕細(xì)胞壁和膜以便離子等進(jìn)入細(xì)胞，而等離子體產(chǎn)生高速電子也可對(duì)細(xì)胞起到相似的作用。由于目前關(guān)于等離子體誘變的機(jī)理未見(jiàn)報(bào)道，但其誘變機(jī)理與滅菌機(jī)理是相通的，可以利用滅菌機(jī)理來(lái)反映誘變機(jī)理。Hongxia Liu等研究了氧等離子體滅菌的影響和機(jī)理，分析了電子、離子和氧自由基對(duì)大腸桿菌殺菌的影響，首先電子和離子刻蝕細(xì)胞膜，然后氧自由基破壞細(xì)胞膜上的多元不飽和脂肪酸，這是氧等離子體滅菌的主要原理，其中紫外線對(duì)細(xì)胞的損傷是微乎其微的。從這里可以知道，等離子體誘變中少了高速離子轟擊對(duì)DNA的影響，取而代之的是高速電子與細(xì)胞作用，以及作用產(chǎn)生的自由基及其他次級(jí)反應(yīng)與DNA的作用成為誘變的主要原理。

等離子體誘變是一種比較新的誘變育種方法，研究尚不成熟，目前應(yīng)用還不多。董曉宇等人用大氣壓冷等離子介質(zhì)阻擋放電法，對(duì)產(chǎn)1，3-丙二醇的克雷伯氏菌進(jìn)行誘變，結(jié)果表明，誘變菌株比出發(fā)菌株1，3-丙二醇的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率提高了23%，對(duì)數(shù)期比生長(zhǎng)速率提高了18%。批式流加發(fā)酵過(guò)程中，1，3-PD 濃度在發(fā)酵 36 h 時(shí)達(dá)到 70.5 g/L，甘油的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為 0.57 g/g，分別比野生菌提高47%和58%。等離子體誘變有變異范圍廣、變異穩(wěn)定，且對(duì)條件要求低，必然會(huì)成為一種應(yīng)用廣泛的誘變方法。

4 結(jié)論與展望

傳統(tǒng)的誘變方法由于其變異率低、變異范圍窄且遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，復(fù)合誘變成為一種很好的選擇，但操作繁雜。因此克服了以上誘變?nèi)秉c(diǎn)的新型誘變方法成為受人們青睞的方法。但離子注入法又因?yàn)橐髼l件較嚴(yán)格，目前不太適用于微生物的誘變育種；而等離子體誘變則克服了這一缺點(diǎn)，因此更有應(yīng)用價(jià)值，但由于這種方法的應(yīng)用條件和誘變機(jī)理尚未完全研究清楚，應(yīng)用也未廣泛，關(guān)于此誘變方法還需進(jìn)一步研究。

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