• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    綠側(cè)花???Anthopleura anjunae)寡肽制備的關(guān)鍵技術(shù)與抗前列腺癌作用研究*

    2017-12-09 01:21:20吳宗澤丁國芳楊最素余方苗唐云平賈盈露鄭媛媛
    海洋與湖沼 2017年5期
    關(guān)鍵詞:???/a>抑制率前列腺癌

    吳宗澤 丁國芳① 楊最素 余方苗 唐云平賈盈露 鄭媛媛 陳 銳

    (1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心 舟山 316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316021)

    綠側(cè)花海葵(Anthopleura anjunae)寡肽制備的關(guān)鍵技術(shù)與抗前列腺癌作用研究*

    吳宗澤1,2丁國芳1,2①楊最素1余方苗1唐云平1賈盈露1鄭媛媛1陳 銳1

    (1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心 舟山 316022;2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 舟山 316021)

    本文探討綠側(cè)花???Anthopleura anjunae)抗前列腺癌酶解寡肽制備與工藝優(yōu)化。以綠側(cè)花??鉃樵线M(jìn)行酶解,篩選最佳蛋白酶,通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件,并通過超濾、陰離子交換層析、G-25凝膠過濾和反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化,通過LC-MS和氨基酸序列測定鑒定寡肽的氨基酸序列,并以MTT法檢測產(chǎn)物對(duì)前列腺癌細(xì)胞系DU-145增殖抑制率,以確定活性最強(qiáng)組分,最后通過倒置顯微鏡觀察純化肽的抗前列腺癌活性。結(jié)果表明,堿性蛋白酶為最佳酶種;工藝條件為:最適料液比1︰5、最適pH=11、最適加酶量2000U/g、最適溫度35oC、最適酶解時(shí)間6h;經(jīng)高效液相純化得到由五個(gè)氨基酸組成的綠側(cè)花海葵抗前列腺癌寡肽,其氨基酸序列為:Tyr-Val-Pro-Gly-Pro (AAP-H);倒置顯微鏡結(jié)果顯示經(jīng)AAP-H作用24h后的DU-145細(xì)胞具有明顯的凋亡形態(tài)學(xué)特征。結(jié)論:采用堿性蛋白酶酶解并通過超濾和色譜分離技術(shù)能從綠側(cè)花海葵肉中制備抗腫瘤活性肽;且AAP-H對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制作用呈時(shí)間與劑量依賴關(guān)系,作用后細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學(xué)特征。因此,AAP-H能明顯抑制前列腺癌細(xì)胞DU-145增殖,可以誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

    綠側(cè)花???酶解;抗腫瘤;寡肽;工藝

    前列腺癌(Prostate,PCa)一種早期難被發(fā)現(xiàn)、卻高危性的疾病,相比歐美國家,我國前列腺癌發(fā)病率要低得多,但是近年來由于人們飲食不均衡和環(huán)境污染,發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(景奕文等,2014),并成為威脅我國男性健康的重要因素。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與宿主免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤失去調(diào)控有關(guān),如果得不到及時(shí)有效的治療將發(fā)展為雄性激素非依賴性前列腺癌,加上晚期骨轉(zhuǎn)移,給治療帶來極大的難度(Michalakiet al,2004)。因此,尋找既能提高人體免疫能力又能有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的活性物就顯得尤其重要。

    ???sea anemone)屬于原始海洋生物,六放珊瑚亞綱的一目,有6科、37種,分布廣泛,常見于熱帶和溫帶海底巖石和泥沙中(胡波,2011)。目前,各國科學(xué)家對(duì)??舅?張均順等,1998)鉀離子通道和鈉離子通道活性進(jìn)行了大量的研究(Rodríguezet al,2014);另外,其降血壓(Shkrobet al,2005)、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)(Chiet al,2011)和抗腫瘤(Solettiet al,2008)的研究也有大量報(bào)道。但是由于??舅睾繕O少、提取困難,嚴(yán)重制約生理學(xué)和病理學(xué)方面的研究(Monroy-Estradaet al,2007)。參考海洋生物活性肽的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)用酶解法制備生物活性肽已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn),提取得到的活性肽既能補(bǔ)充機(jī)體營養(yǎng)成分,又具有抗氧化、抗凝血、降血壓、抗腫瘤等活性(張巖等,2012)。

    據(jù)竇光宇(2003)報(bào)道,在眾多???數(shù)量最多的為綠側(cè)花???Anthopleura anjunae)。在我國東海部分海域,每平方米綠側(cè)花??臄?shù)量可達(dá)數(shù)百個(gè)。實(shí)驗(yàn)前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)在舟山海域,綠側(cè)花??麛?shù)量龐大,在部分海水養(yǎng)殖區(qū),綠側(cè)花海葵與其它水產(chǎn)品(如貽貝等)形成競爭共生,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成一定的危害。雖然綠側(cè)花海葵資源豐富,但到目前為止,對(duì)綠側(cè)花??难芯繀s鮮有報(bào)道,而利用酶法開發(fā)??钚噪纳形匆娪袌?bào)道。本實(shí)驗(yàn)以綠側(cè)花??鉃樵?采用酶解法制備具有抗前列腺癌的活性肽,通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解條件,并通過超濾、陰離子交換層析、G-25凝膠過濾層析和高效液相分離純化,以MTT法檢測產(chǎn)物對(duì)前列腺癌細(xì)胞系DU-145增殖抑制率為指標(biāo)篩選活性肽;最后通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),檢驗(yàn)純化肽的抗前列腺癌活性,旨在為綠側(cè)花海葵抗腫瘤藥物和保健品的開發(fā)提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    綠側(cè)花海葵:采集舟山海域野生???經(jīng)浙江海洋大學(xué)趙盛龍教授鑒定為綠側(cè)花???Anthopleura anjunae)。堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶:亞太恒信生物科技有限公司;甲醇、乙腈:色譜純,德國默克公司;聚凝胺:上海博普生物技術(shù)有限公司;F12培養(yǎng)基:美國Gibco公司;無支原體胎牛血清(FBS):杭州四季青生物制品有限公司。

    CF16RN型高速冷凍離心機(jī)、L8900氨基酸自動(dòng)分析儀:日立儀器有限公司;Agilent-1260型高效液相色譜儀:美國安捷倫公司;ALPHA1-4/LDplus超濾系統(tǒng):德國默克密理博公司;Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo公司;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS公司;酶標(biāo)儀:美國BioRad科技公司。

    1.2 材料預(yù)處理

    實(shí)驗(yàn)參考??馄?李霞等,2004)及營養(yǎng)成分分析(朱春曉等,2011)并稍作修改,取新鮮野生綠側(cè)花海葵置于室溫干凈海水中養(yǎng)一天,清洗除去雜質(zhì)。用剪刀從中間剖開后,在大燒杯中加水覆蓋,置于–20oC下冷凍12h,室溫自然解凍后,反復(fù)操作三次。擠出觸手毒液,沖洗至得到白色???。然后高速勻漿(10000r/min,5min),將勻漿液浸泡于異丙醇中去脂,每4h更換一次,連續(xù)換3次,再用純水將異丙醇沖洗干凈,置于通風(fēng)櫥中瀝干,最后分裝標(biāo)記,置于–20oC保存?zhèn)溆?。凍融液參?Anderluhet al,2002)海葵毒素的提取方法處理,收集??舅?。

    1.3 綠側(cè)花海葵相關(guān)指標(biāo)測定

    1.3.1 基礎(chǔ)成分測定 參考GB 5009.3-2016測定水分;參考 GB5009.4-2016測灰分;參考 GB50095-2016測粗蛋白含量;參考GB5009.6-2016測定??獾拇种竞?。

    1.3.2 ??被峤M成及含量分析 參考GB5009.124-2016,稱取??鈩驖{樣品經(jīng)6mol/L鹽酸水解后,用日立L8900氨基酸自動(dòng)分析儀測定氨基酸的組成及含量。

    1.4 酶種的篩選

    分別取10g預(yù)處理后的??鈩驖{加50mL純水,加酶量為1000U/g,根據(jù)酶試劑盒上的說明調(diào)節(jié)最佳pH和溫度(表1),置于恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解。期間勻速緩慢攪拌,結(jié)束后煮沸滅活 15min,然后用三層紗布過濾除去粗雜質(zhì),濾液在4oC、12000r/min離心10min,連續(xù)離心兩次。收集上清液用0.45μm針式濾膜過濾,調(diào)節(jié)pH=7并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行旋蒸濃縮和冷凍干燥。產(chǎn)物分裝置于–20oC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 酶解條件Tab.1 The conditions for enzymolysis reaction

    1.5 MTT法檢測產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制活性及倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

    前列腺癌細(xì)胞系DU-145用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液于37oC、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長至70%—80%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)。

    MTT法參考張國梅等(2015)并稍作修改,將DU-145細(xì)胞接種于96孔板中,設(shè)置空白對(duì)照組及藥物組,藥物組加入含不同劑量酶解產(chǎn)物的培養(yǎng)液,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24h后加入200μL含有10% MTT的 PBS緩沖液,并孵育 4h。棄 MTT培養(yǎng)液,加入DMSO震蕩反應(yīng),酶標(biāo)儀檢測吸光度A值,計(jì)算抑制率(IR),計(jì)算公式為:IR=(對(duì)照組A值–藥物組A值)/對(duì)照組A值×100%

    在六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞,并按照產(chǎn)物的IC50加藥處理 24h,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),分析產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞增殖抑制的原因。

    1.6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化綠側(cè)花??鼓[瘤酶解寡肽的制備工藝

    通過方法 1.4確定最佳的蛋白酶后,以 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化綠側(cè)花??鼓[瘤酶解寡肽的制備工藝,以確定最佳的溫度、時(shí)間、pH、加酶量和料液比,產(chǎn)物經(jīng)濃縮冷凍干燥并采用 MTT法檢測對(duì)DU-145增殖抑制活性,正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平如表2所示。

    表2 正交實(shí)驗(yàn)中各酶解反應(yīng)的條件Tab.2 The conditions of enzymolysis reaction in orthogonal experiments

    1.7 最優(yōu)酶解產(chǎn)物分離與純化

    1.7.1 海葵酶解液超濾 按照1.6確定的最佳酶解條件進(jìn)行酶解,制備綠側(cè)花??鼓[瘤寡肽(Anthopleura anjunaeAnti-tumor Peptide,AAP),用ALPHA1-4/LDplus超濾系統(tǒng)8kDa和20kDa的濾膜分級(jí),并按分子量由小到大命名為AAP-I (MW<8kDa)、AAP-II (8kDa ≤ MW < 20kDa)、AAP-III (MW ≥20kDa)。MTT法篩選活性最好組分。

    1.7.2 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析提前活化、平衡交換柱(2cm×35cm),上樣濃度為30mg/mL溶液,超聲 5min,0.45μm 針式濾膜過濾,每次上樣3mL,分別以純水、0.1、0.3、0.5、0.8mol/L的 NaCl溶液梯度洗脫,各梯度分別洗脫 30min,流速為1mL/min,用DBS-100-LCD電腦全自動(dòng)部分收集器每4min收集一管,于280nm檢測吸光度,并根據(jù)吸光度曲線合并洗脫峰。產(chǎn)物濃縮冷凍干燥,分裝保存于–20oC冰箱中備用。MTT法篩選活性最好組分。

    1.7.3 SephadexG25凝膠層析法分離純化 將對(duì)DU-145增殖抑制率最高的AAP-I-1采用G-25凝膠層析繼續(xù)分離純化,將樣品配制成 30mg/mL溶液,超聲5min,然后用0.45μm針式濾膜過濾,每次加3mL到處理好的Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm),用超純水洗脫,流速為1.0mL/min,用DBS-100-LCD電腦全自動(dòng)部分收集器每4min收集一管,于280 nm檢測吸光度,并根據(jù)吸光度曲線合并洗脫峰,產(chǎn)物濃縮冷凍干燥。MTT法篩選活性最好組分。

    1.7.4 反相高效液相色譜分離純化 將AAP-I-1-2配制成 0.5mg/mL溶液經(jīng) 0.22μm針式濾膜過濾后用反相高效液相色譜分離純化。進(jìn)樣前平衡 Agilent 1260 ZORBAX SB-C18 (9.4mm×250mm)柱,柱溫30oC;洗脫液用乙腈超純水混合液按 1mL/min洗脫,0—15min 乙腈(20%—50%),15—30min:乙腈(50%);檢測波長為280 nm。純品采用PPSQ-31A蛋白質(zhì)測序儀測定肽鏈氨基酸序列。

    1.8 AAP-H活性檢測

    采用倒置顯微鏡觀察AAP-H抗前列腺癌活性。DU-145細(xì)胞接種在六孔板中培養(yǎng)至 80%—90%的匯合度后加藥(1、5和10mg/mL),24h后終止培養(yǎng),于倒置顯微鏡下觀察并拍照分析。

    1.9 統(tǒng)計(jì)分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPASS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,并采用*±s表示,*表示P<0.05,具有顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 綠側(cè)花海葵基礎(chǔ)成份檢測結(jié)果

    綠側(cè)花??獾幕A(chǔ)成分檢測結(jié)果見表3,含有豐富的粗蛋白占(19.76%)和較低的粗脂肪(僅為0.89%),表明綠側(cè)花??且环N高蛋白,低脂肪的海產(chǎn)品。

    綠側(cè)花??獾陌被峤M成及含量見表4,發(fā)現(xiàn)其包含常見的 17種氨基酸,種類比較齊全,其中七種必需氨基酸含量占 24.31%,低于太平洋側(cè)花???37.37% (朱春曉等,2011);鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)高達(dá) 50.58%,高于太平洋側(cè)花???45.45%),這可能也是綠側(cè)花??兜栗r美的原因之一。

    表3 綠側(cè)花海葵肉基礎(chǔ)成分分析(g/100g,濕重)Tab.3 Basic components of A.anjunae flesh (g/100g,wet weight)

    表4 綠側(cè)花海葵肉的氨基酸組成及含量(g/100g,干重)Tab.4 Composition and content of amino acids of A.anjunae flesh (g/100g,dry weight)

    根據(jù)FAO/WHO對(duì)氨基酸評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),綠側(cè)花??匦璋被嶂g比值與理想的人體氨基酸比值有一定的差異(結(jié)果見表5),但研究表明,親水性多肽(含有 Asp、Thr、Ser、Glu、Arg、Lys、His和Gln 等親水性氨基酸)可通過靜電吸引方式,特異性作用于腫瘤細(xì)胞,導(dǎo)致其細(xì)胞膜迅速破裂,細(xì)胞內(nèi)容物滲漏,最終引起腫瘤細(xì)胞死亡(謝書越等,2015)。然而綠側(cè)花??饷附猱a(chǎn)物的親水性氨基酸占總氨基酸含量的49.3%,親水性氨基酸的高比例可為今后開發(fā)抗癌藥物或者功能食品提供依據(jù)。

    2.2 MTT活性測試結(jié)果

    將不同提取方法所得產(chǎn)物與前列腺癌細(xì)胞系DU-145共同培養(yǎng)24h后,進(jìn)行MTT活性測試,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有產(chǎn)物的抑制率都表現(xiàn)出劑量依賴性,中劑量(5mg/mL)的胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物以及毒素對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率分別是(24.98±6.04)%、(28.55±5.29)% 、 (31.66±4.04)% 、 (73.7±4.31)% 和(99.12±3.96)%,對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制活性順序由大到小分別是:毒素>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶,所以確定堿性蛋白酶為最優(yōu)酶種。胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物和毒素的 IC50分別是:12.57、12.40、10.66、3.87和0.76mg/mL。

    表5 綠側(cè)花??鞍踪|(zhì)營養(yǎng)評(píng)價(jià)Tab.5 Nutrition evaluation on protein of A.anjunae

    圖1 不同產(chǎn)物作用24h后對(duì)DU145細(xì)胞增殖抑制效果Fig.1 Effects on proliferative inhibition to DU-145 cells after 24h with different enzymatic hydrolysates

    2.3 對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞形態(tài)的影響

    圖2顯示不同酶解產(chǎn)物作用 24h對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞形態(tài)的影響,空白對(duì)照組細(xì)胞生長良好,細(xì)胞間排列緊密,細(xì)胞形態(tài)飽滿;經(jīng)酶解產(chǎn)物作用后,B組到 E組細(xì)胞之間的間隙增大,細(xì)胞膜收縮變圓,并有較多細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁,即細(xì)胞死亡,同時(shí)相對(duì)空白組細(xì)胞數(shù)目明顯減少;經(jīng)毒素作用后的F組細(xì)胞出現(xiàn)破碎,被裂解成碎片。

    雖然無論是毒素還是酶解產(chǎn)物都能促進(jìn) DU-145細(xì)胞死亡,但是從細(xì)胞形態(tài)變化初步判斷其作用機(jī)制不同。??舅啬茉诩?xì)胞上形成特異穿孔,使細(xì)胞破碎造成溶解(Marinoet al,2004)。而細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征主要是細(xì)胞染色質(zhì)固縮,凝聚與核邊緣,呈塊狀、環(huán)狀或者新月狀(馬嵐,2006)。因此初步推斷,酶解法制備的活性肽肽很可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞增殖。

    2.4 Alcalase正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以料液比、溫度、pH值、加酶量和時(shí)間5個(gè)因素,以IR值作為指標(biāo),檢測堿性蛋白酶產(chǎn)物抑制前列腺癌細(xì)胞DU-145增殖活性的最優(yōu)條件,結(jié)果見表6。采用極差法進(jìn)行分析,從Rj值大小可以看出,A(料液比)>E(時(shí)間)>D(溫度)>C(加酶量)>B(pH 值)。而 IR值最大時(shí)的水解條件為A4B4C3D1E3,即料液比為1︰5、pH為11、加酶量為2000U/g、溫度為35oC和時(shí)間為6h。并且按該條件酶解產(chǎn)物得率為10.32%±0.69%。

    圖2 不同產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞形態(tài)的影響,24h,倒置顯微鏡(×200)Fig.2 Morphologic changes in DU-145 cells affected by different enzymatic hydrolysates in 24h,inverted microscope(×200)

    2.5 初步分離結(jié)果

    將堿性蛋白酶酶解液超濾后,初步分離得到三種組分,并命名為AAP-I、AAP-II和AAP-III,經(jīng)MTT法活性篩選(圖3)后,發(fā)現(xiàn)三種組分皆可對(duì)DU-145增殖產(chǎn)生抑制作用,并表現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),當(dāng)劑量為10mg/mL時(shí),三個(gè)組分幾乎可以完全抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)劑量為5mg/mL時(shí),抑制率分別是 87.18±1.41%、74.36±2.30%和83.05±2.03%,綜合三個(gè)劑量的抑制率,以及到作為藥品和保健品開發(fā)原材料分子量的適用性問題,AAP-I是最好的選擇,所以采用陰離子交換層析對(duì)AAP-I進(jìn)一步分離。

    表6 堿性蛋白酶酶解法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 The results of L16(45)orthogonal test using Alcalase

    圖3 超濾后不同分子量產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制Fig.3 Effects on proliferative inhibition in different molecular weights to DU-145 cells

    2.6 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)果

    將超濾得到的 AAP-I用 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析得到三個(gè)峰產(chǎn)物(圖4),分別命名為AAP-I-1、AAP-I-2和AAP-I-3。將每個(gè)峰產(chǎn)物濃縮冷凍干燥,同樣采用MTT法檢測產(chǎn)物對(duì)DU-145的增殖抑制活性。結(jié)果(圖5)顯示三種組分都能抑制DU-145細(xì)胞增殖,都呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng),并且在每一劑量下,三種組分的抑制率皆表現(xiàn)為AAP-I-1 >AAP-I-2 > AAP-I-3。對(duì)于中劑量組(5mg/mL),抑制率分別是37.12±1.70%、34.78±2.20%和24.21±1.61%,因此選取細(xì)胞增殖抑制率最高的 AAP-I-1進(jìn)一步分離純化。

    圖4 AAP-I的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析曲線圖Fig.4 The elution curve of AAP-I in anion exchange chromatography

    圖5 陰離子交換柱洗脫后三個(gè)峰產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制Fig.5 Effects on proliferative inhibition with three products after elution to DU-145 cells

    2.7 Sephadex G-25凝膠層析分離結(jié)果

    將 AAP-I-1采用 Sephadex G-25凝膠層析分離,結(jié)果得到三個(gè)峰(圖6),分別命名為AAP-I-1-1、AAP-I-1-2和AAP-I-1-3,收集后冷凍干燥,分裝于–20oC冰箱保存。采用MTT法檢測抑制活性,結(jié)果(圖7)顯示三種組分都能抑制 DU-145細(xì)胞增殖,都呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,濃度越高抑制率越高。在較低濃度(1和5mg/mL)時(shí),三種組分的抑制率 AAP-I-1-2 >AAP-I-1-3 > AAP-I-1-1,但是在高濃度組(10mg/mL),抑制率為AAP-I-1-2 > AAP-I-1-1 > AAP-I-1-3。對(duì)于中劑量(5mg/mL)時(shí),三個(gè)組分的抑制率分別是 30.01±2.16%、46.14±2.29%和40.53±1.76%,結(jié)果表明,三個(gè)組分的產(chǎn)物對(duì)于劑量增加的敏感性有所不同,但是對(duì)于各個(gè)濃度,AAP-I-1-2對(duì)DU-145增殖的抑制率最好。

    圖6 AAP-I-1 G-25凝膠過濾洗脫曲線Fig.6 Elution curve of AAP-I-1 in gel filtration chromatography

    圖7 G-25各洗脫峰產(chǎn)物DU-145細(xì)胞增殖活性示意圖Fig.7 Effects on the proliferative inhibition with different elution from gel filtration to DU-145 cells

    2.8 AAP-I-1-2經(jīng)高效液相分離結(jié)果、產(chǎn)物質(zhì)譜及肽鏈序列

    將 AAP-I-1-2經(jīng) HPLC純化后結(jié)果如圖8所示,收集主峰產(chǎn)物濃縮冷凍干燥,并命名為AAP-H,進(jìn)行MTT活性測試,24h、5mg/mL對(duì)DU-145增殖抑制率為49.14%±2.29%,比同等時(shí)間和劑量的AAP-I-1-2(46.14%±2.29%)略微偏高,因此推斷主峰 AAP-H 是AAP-I-1-2的主要活性物,AAP-H經(jīng)高效液相檢測基本單一樣品,純度大于95%,符合氨基酸序列測定要求,AAP-H高效液相檢測如圖9所示。

    圖8 AAP-I-1-2的C18- HPLC圖Fig.8 C18 HPLC chromatogram of AAP-I-1-2

    圖9 AAP-H的C18- HPLC圖Fig.9 C18 HPLC chromatogram of AAP-H

    將 AAP-H進(jìn)行氨基酸測序,見圖 10。結(jié)果為:Tyr-Val-Pro-Gly-Pro,分子式為:C26H37N5O7,分子量為531.68Da,與質(zhì)譜的 532.27Da基本吻合。因此推斷,AAP-H是比較純的單一組分,且是測序檢測到的Tyr-Val-Pro-Gly-Pro寡肽。

    2.9 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

    倒置顯微鏡觀察結(jié)果如圖11所示,經(jīng)AAP-H作用 24h后,空白對(duì)照組(A)的細(xì)胞生長良好,細(xì)胞間排列緊密,形態(tài)飽滿。隨著AAP-H濃度增加,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,如 1mg/mL組(B)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大,輪廓模糊,相對(duì)比空白組死細(xì)胞明顯增多;5mg/mL組(C)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞收縮,間隙增大,胞膜出現(xiàn)空泡(C);10mg/mL組(D)的高劑量組,細(xì)胞收縮變圓,胞間間距增大,細(xì)胞數(shù)量明顯減少。表明AAP-H改變細(xì)胞形態(tài)同時(shí)抑制細(xì)胞增殖。

    3 討論

    我國海域幅員遼闊,??Y源豐富,常見的種類有:中華仙影海葵(Cereus sinensisVerrill)、太平洋側(cè)花???A.pacifica)、黃側(cè)花???A.xanthogrammica)、縱條磯???Haliplanella luciaeHand)和綠側(cè)花???A.anjunae)等。目前對(duì)??难芯恐饕呛?舅?從??|手毒素中分離出多種具有細(xì)胞毒、神經(jīng)毒作用的多肽和蛋白質(zhì);另外,也有研究表明,??羞€有豐富的甘油酯、神經(jīng)酰胺、嘧啶、甾醇和生物堿等活性物(張均順等,1998)。這些毒素具有多種生物活性,如抗菌、降血壓、中樞神經(jīng)抑制和鎮(zhèn)痛等,另外海葵抗腫瘤活性物的研究也取得一定的進(jìn)展,如Tejuca等(2009)研究的三種??舅赝ㄟ^使細(xì)胞膜成孔而抑制細(xì)胞增值。但是到目前為止對(duì)??难芯炕径歼€停留在實(shí)驗(yàn)研究階段,并不能轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品,其中重要的原因一方面是因?yàn)楹?舅睾可?提取困難;另一方面由于??舅囟拘詮?qiáng),在應(yīng)用中副作用大,這些因素都嚴(yán)重制約了??难芯窟M(jìn)展。因此尋找新的途徑開發(fā)海葵資源就顯得尤為重要。

    圖10 AAP-H質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectrogram of AAP-H

    圖11 AAP-H作用DU-145細(xì)胞24h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(×400)Fig.11 Cellular morphology of DU-145 under inverted microscope after treated with APP-H for 24h (×400)注:A:空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿,生長情況良好;B:1mg/mL的APP-H作用DU-145細(xì)胞后,細(xì)胞開始收縮變圓(圓圈所示);C:5mg/mL的AAP-H作用于DU-145細(xì)胞后,細(xì)胞出現(xiàn)收縮變圓現(xiàn)象更明顯,同時(shí)出現(xiàn)空泡(圓圈所示);D:10mg/mL的AAP-H作用于DU-145細(xì)胞后,視野中細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞間間隙增大,部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁(圓圈所示)

    目前制備海洋生物活性肽比較常用的方法有三種:一是化學(xué)合成方法制備生物活性肽;二是以生物體或者組織為原料通過各種分離手段直接分離提取;三是采用酶解法降解生物組織或者大分子產(chǎn)物制備生物活性肽(黃芳芳,2011)。由于蛋白酶酶解法生產(chǎn)生物活性肽具有安全性高、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率相對(duì)較高的優(yōu)點(diǎn),因此該方法已經(jīng)成為近年來制備活性肽的研究熱點(diǎn)。海洋生物生長環(huán)境獨(dú)特于陸生生物,有的甚至生長在極高壓或極低溫等環(huán)境中,造成海洋生物在生長過程中形成結(jié)構(gòu)獨(dú)特,功能新穎的活性肽。這種活性肽部分以天然狀態(tài)存在,部分作為蛋白質(zhì)大分子的結(jié)構(gòu)域,蛋白酶通過對(duì)特定的點(diǎn)位剪切,可以得到活性比蛋白質(zhì)更好的肽鏈,這些生物活性肽在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌、抗血栓、抗高血壓、調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)、清除自由基、抗病毒、促進(jìn)礦物元素吸收和抗癌方面發(fā)揮重要的作用(黎觀紅等,2004)。根據(jù)Samaranayaka等(2011)的研究表明:肽鏈的生物活性主要受氨基酸組分和肽鏈分子量大小影響,活性肽比蛋白質(zhì)、多聚肽和單純的氨基酸具有更強(qiáng)的生物活性。另外肽鏈中的Trp、Tyr、Met、Gly、Lys、His和Pro等芳香族氨基酸或者疏水性氨基酸能很好地增強(qiáng)肽鏈的生物活性(Saitoet al,2003;Guoet al,2009)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合舟山實(shí)際情況,以綠側(cè)花??鉃樵?通過酶解法制備??鼓[瘤肽,旨在為??Y源的開發(fā)提供參考依據(jù)。

    4 結(jié)論

    通過實(shí)驗(yàn)確定堿性蛋白酶為最佳酶種,采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化酶解法提取??鼓[瘤肽的最佳工藝條件為:料液比為1︰5 (W/V)、pH=11、加酶量為2000U/g、酶解溫度為35oC和最佳酶解時(shí)間為6h。通過超濾、陰離子交換層析、G-25凝膠層析和反向高效液相等方法分離純化,以產(chǎn)物對(duì)DU-145增殖抑制率為指標(biāo),最終純化獲得寡肽且氨基酸序列為:Tyr-Val-Pro-Gly-Pro,并且 Tyr、Pro和Gly結(jié)構(gòu)可能是產(chǎn)物具有抗腫瘤活性的重要原因之一。綜上所述,綠側(cè)花??馐且环N蛋白含量很高脂肪含量很低的天然食品,通過酶解法制備的寡肽,具有抗前列腺癌的活性。

    馬 嵐,2006.槐定堿對(duì)人肝癌 HepG-2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用及其基因調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.蘭州:蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文,16—31

    朱春曉,王遠(yuǎn)紅,呂志華,2011.太平洋側(cè)花??臓I養(yǎng)成分分析.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào),41(S1):365—368

    李 霞,賈玉妹,李雅娟,2004.黃??馄蕦W(xué)和主要器官組織學(xué)的研究.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),19(3):171—175

    張 巖,吳燕燕,李來好等,2012.酶法制備海洋活性肽及其功能活性研究進(jìn)展.生物技術(shù)通報(bào),28(3):42—48

    張國梅,楊最素,丁國芳等,2015.沙蠶活性蛋白酶誘導(dǎo)人肺癌 SPC-A-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.現(xiàn)代食品科技,31(3):6—11

    張均順,張培軍,1998.海葵多肽神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)與功能研究新進(jìn)展.海洋與湖沼,29(2):212—218

    胡 波,2011.??芗?xì)胞素Gigantoxin-4的分離、鑒定和功能研究.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)碩士論文,8—30

    黃芳芳,2011.烏賊墨寡肽酶解工藝及抗前列腺癌機(jī)制研究.舟山:浙江海洋學(xué)院碩士學(xué)位論文,20—33

    景奕文,楊最素,黃芳芳等,2014.烏賊墨多肽誘導(dǎo)人前列腺癌 DU-145細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.現(xiàn)代食品科技,30(9):1—6

    謝書越,穆利霞,廖森泰等,2015.抗腫瘤活性肽的研究進(jìn)展.食品工業(yè)科技,36(2):368—372

    竇光宇,2003.勝似鮮花的海洋動(dòng)物——???森林與人類,(8):38—38

    黎觀紅,樂國偉,施用暉,2004.動(dòng)物蛋白質(zhì)營養(yǎng)中小肽的吸收及其生理作用.生物學(xué)通報(bào),39(1):20—22

    Anderluh G,Ma?ek P,2002.Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa:Actiniaria).Toxicon,40(2):111—124

    Chi V,Pennington M W,Norton R Set al,2011.Development of a sea anemone toxin as an immunomodulator for therapy of autoimmune diseases.Toxicon,59(4):529—546

    Guo H,Kouzuma Y,Yonekura M,2009.Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein.Food Chemistry,113(1):238—245

    Gutiérrez-Aguirre I,Barli? A,Podlesek Zet al,2004.Membrane insertion of the N-terminal α-helix of equinatoxin II,a sea anemone cytolytic toxin.Biochemical Journal,384(2):421—428

    Marino A,Valveri V,Muià Cet al,2004.Cytotoxicity of the nematocyst venom from the sea anemoneAiptasia mutabilis.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology &Pharmacology,139(4):295—301

    Michalaki V,Syrigos K,Charles Pet al,2004.Serum levels of IL-6 and TNF-α correlate with clinicopathological features and patient survival in patients with prostate cancer.British Journal of CancerImmunology Letters,90(12):2312—2316

    Monroy-Estrada H I,Segura-Puertas L,Galván-Arzate Set al,2007.The crude venom from the sea anemoneStichodactyla helianthusinduces haemolysis and slight peroxidative damage in rat and human erythrocytes.Toxicology in Vitro,21(3):398—402

    Rodríguez A A,Salceda E,Garateix A Get al,2014.A novel sea anemone peptide that inhibits acid-sensing ion channels.Peptides,53:3—12

    Saito K,Jin D H,Ogawa Tet al,2003.Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial chemistry.Journal of Agricultural and Food Chemistry,51(12):3668—3674

    Samaranayaka A G P,Li-Chan E C Y,2011.Food-derived peptidic antioxidants:a review of their production,assessment,and potential applications.Journal of Functional Foods,3(4):229—254

    Shkrob M A,Yanushevich Y G,Chudakov D Met al,2005.Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein fromActinia equina.Biochemical Journal,392(3):649—654

    Soletti R C,de Faria G P,Vernal Jet al,2008.Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity by sea anemone pore-forming proteins in human glioblastoma cells.Anti-cancer drugs,19(5):517—525

    Tejuca M,Anderluh G,Serra M D,2009.Sea anemone cytolysins as toxic components of immunotoxins.Toxicon,54(8):1206—1214

    ENZYMATIC PREPARATION OF OLIGOPEPTIDE FROMANTHOPLEURA ANJUNAEAND ITS ANTI-CANCER ACTIVITY OF PROSTATE CANCER CELLS

    WU Zong-Ze1,2, DING Guo-Fang1,2, YANG Zui-Su1, YU Fang-Miao1, TANG Yun-Ping1,JIA Ying-Lu1, ZHENG Yuan-Yuan1, CHEN Rui1
    (1.School of Food Science and Pharmacy of Zhejiang Ocean University,Zhejiang Provincial Key Engineering Technology Research Center of Biomedical Products,Zhoushan316022,China;2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang,Zhoushan316021,China)

    The enzymatic preparation of anti-prostate cancer oligopeptide fromAnthopleura anjunaeand its process optimization was investigated.Taking the flesh ofA.anjunaeas the material,the best protease for enzymatic hydrolysis was screened and the reactions were optimized in orthogonal experiments.The active oligopeptide was purified by using ultrafiltration,anion exchange chromatography,G-25 gel chromatography and high performance liquid chromatography.All the active components were detected in methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)assay on prostate cancer DU-145 cells.Morphologic changes of the cells were observed in inverted microscopy.The optimum alkaline enzymatic hydrolysis conditions were determined as:temperature 35°C,pH 11,solid to liquid ratio 1︰5,amount of enzyme 2000U/g,and hydrolysis time 6h.The anti-prostate cancer oligopeptide was obtained and identified as Tyr-Val-Pro-Gly-Pro (AAP-H)by N-terminal amino-acid sequencing.The results demonstrate that AAP-H suppressed the proliferation of DU-145 cells in a time- and dose-dependent manner and the apoptosis morphological features of cells occurred.The anti-prostate cancer oligopeptide was obtained from the enzymatic hydrolysates of green sea anemone using ultrafiltration and chromatographic separation techniques.Our findings suggest that AAP-H can inhibit the proliferation of prostate cancer DU-145 cells and induces apoptosis.

    Anthopleura anjunae;enzymatic hydrolysis;anti-tumor efficacy;oligopeptide;technology

    Q816

    10.11693/hyhz20161200268

    * 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,81001393號(hào),2015GA700044號(hào);國家海洋重大計(jì)劃項(xiàng)目,201586-2號(hào);浙江省科技廳重大專項(xiàng),2013C03036號(hào);浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目,21136001115號(hào)。吳宗澤,碩士研究生,E-mail:zongze461@sina.com

    ① 通訊作者:丁國芳,教授,碩士生導(dǎo)師,E-mail:dinggf2007@163.com

    2016-12-02,收修改稿日期:2017-02-16

    猜你喜歡
    ???/a>抑制率前列腺癌
    中藥單體對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    血栓彈力圖評(píng)估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    ??图木有?/a>
    前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的治療
    關(guān)注前列腺癌
    認(rèn)識(shí)前列腺癌
    前列腺癌,這些蛛絲馬跡要重視
    兒童故事畫報(bào)·智力大王(2018年5期)2018-10-30 03:11:12
    娃娃樂園·綜合智能(2018年13期)2018-07-26 09:58:44
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    亚洲天堂国产精品一区在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 又爽又黄a免费视频| 人人妻人人看人人澡| 国产av码专区亚洲av| 日本黄大片高清| 又大又黄又爽视频免费| 青春草亚洲视频在线观看| 在线免费十八禁| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美日韩在线观看h| 2018国产大陆天天弄谢| 精品久久久久久久末码| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品无大码| 男女国产视频网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人a区在线观看| av天堂中文字幕网| 亚洲欧洲国产日韩| 国精品久久久久久国模美| 国产成年人精品一区二区| 综合色av麻豆| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 精品少妇久久久久久888优播| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲丝袜综合中文字幕| 两个人的视频大全免费| 国产男人的电影天堂91| 日韩免费高清中文字幕av| 国产久久久一区二区三区| 黄色配什么色好看| 日韩中字成人| 国产精品久久久久久av不卡| 中文字幕免费在线视频6| 内射极品少妇av片p| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品一区在线观看国产| 免费黄色在线免费观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲欧美清纯卡通| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久99热这里只有精品18| 色播亚洲综合网| 18禁动态无遮挡网站| 国产毛片在线视频| 欧美日韩在线观看h| 国产综合精华液| 成人二区视频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产精品人妻久久久影院| 一区二区三区乱码不卡18| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产欧美在线一区| 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人a区在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 日韩av免费高清视频| 一级毛片我不卡| 在线观看美女被高潮喷水网站| www.av在线官网国产| 搞女人的毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 一个人看的www免费观看视频| 我的老师免费观看完整版| 国产极品天堂在线| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲av免费在线观看| 久久ye,这里只有精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费观看无遮挡的男女| 丝袜脚勾引网站| 青春草视频在线免费观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产男女内射视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 日本与韩国留学比较| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产一区有黄有色的免费视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av免费在线看不卡| 亚洲国产色片| 在线精品无人区一区二区三 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 内地一区二区视频在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲av福利一区| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费看光身美女| 亚洲欧洲国产日韩| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人a区在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产综合懂色| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲av二区三区四区| 精品一区二区免费观看| 亚洲av免费高清在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久99热这里只频精品6学生| 午夜精品国产一区二区电影 | 嫩草影院新地址| 久久久久久久大尺度免费视频| av福利片在线观看| 欧美精品国产亚洲| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲最大成人中文| 99热网站在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 看黄色毛片网站| 亚洲欧美精品专区久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久热这里只有精品99| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久精品久久精品一区二区三区| 伊人久久国产一区二区| 午夜福利高清视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 熟妇人妻不卡中文字幕| 熟女电影av网| 激情 狠狠 欧美| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费黄色在线免费观看| 国产毛片a区久久久久| 七月丁香在线播放| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲欧洲日产国产| 极品教师在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | av国产免费在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成年女人在线观看亚洲视频 | 内地一区二区视频在线| 1000部很黄的大片| 91精品一卡2卡3卡4卡| 一区二区三区精品91| 午夜福利视频精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 国内精品宾馆在线| 国产精品不卡视频一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 久久精品国产亚洲网站| 看十八女毛片水多多多| 九色成人免费人妻av| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久国产网址| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 麻豆乱淫一区二区| 国产男女超爽视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 下体分泌物呈黄色| 天天一区二区日本电影三级| 最近最新中文字幕免费大全7| 精品人妻熟女av久视频| 国产欧美亚洲国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 老司机影院成人| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99热网站在线观看| a级毛色黄片| h日本视频在线播放| 精品久久久久久久久av| 中文字幕亚洲精品专区| 我的老师免费观看完整版| 国产综合精华液| 在线观看人妻少妇| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 成人黄色视频免费在线看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 人人妻人人看人人澡| 视频区图区小说| 好男人在线观看高清免费视频| 搞女人的毛片| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产永久视频网站| 欧美成人a在线观看| 久久这里有精品视频免费| 26uuu在线亚洲综合色| 成年人午夜在线观看视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲精品第二区| 男女无遮挡免费网站观看| 成人亚洲精品一区在线观看 | 白带黄色成豆腐渣| 亚洲精品日韩av片在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 国产高清三级在线| 国产精品一区二区在线观看99| 少妇被粗大猛烈的视频| 深爱激情五月婷婷| 国产 精品1| 欧美潮喷喷水| 男的添女的下面高潮视频| 久久6这里有精品| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲欧洲国产日韩| 青春草国产在线视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 激情 狠狠 欧美| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲国产成人一精品久久久| freevideosex欧美| 高清欧美精品videossex| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产男人的电影天堂91| 日本三级黄在线观看| freevideosex欧美| 久久久色成人| av福利片在线观看| 久久久久久久精品精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| eeuss影院久久| 精品人妻熟女av久视频| 高清午夜精品一区二区三区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品久久久久久精品电影| 久久人人爽人人片av| 国产精品久久久久久久电影| 六月丁香七月| 欧美激情久久久久久爽电影| 青青草视频在线视频观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产成人91sexporn| 色视频www国产| 国内精品美女久久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 亚洲av免费高清在线观看| 大香蕉久久网| 久久久久久久精品精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 高清av免费在线| 亚洲国产精品国产精品| 日本色播在线视频| 久久久久性生活片| 国产精品一区二区性色av| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产探花极品一区二区| 精品久久国产蜜桃| 天堂网av新在线| 亚洲美女视频黄频| 美女视频免费永久观看网站| 中文欧美无线码| 男人爽女人下面视频在线观看| 看十八女毛片水多多多| 久久久久久久精品精品| 熟女av电影| 国产男女内射视频| 精品久久久噜噜| 国产精品av视频在线免费观看| 人妻系列 视频| 永久免费av网站大全| videossex国产| 亚洲国产日韩一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 日韩视频在线欧美| 日韩三级伦理在线观看| 直男gayav资源| 哪个播放器可以免费观看大片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产熟女欧美一区二区| 国产av国产精品国产| 久久亚洲国产成人精品v| 少妇的逼好多水| videos熟女内射| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲人与动物交配视频| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av在线观看美女高潮| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 美女国产视频在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 国产 一区精品| 国产美女午夜福利| 国产免费一级a男人的天堂| 一区二区三区乱码不卡18| 日本黄色片子视频| av在线观看视频网站免费| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产精品伦人一区二区| 日本与韩国留学比较| 狂野欧美激情性bbbbbb| 永久免费av网站大全| 日本一二三区视频观看| 国产精品久久久久久久电影| 禁无遮挡网站| 欧美三级亚洲精品| 国产亚洲精品久久久com| 在线a可以看的网站| 欧美激情在线99| 精品少妇黑人巨大在线播放| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 综合色av麻豆| 欧美日本视频| 偷拍熟女少妇极品色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 草草在线视频免费看| 免费看日本二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产乱来视频区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产黄色视频一区二区在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 水蜜桃什么品种好| 男人舔奶头视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久久午夜欧美精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美区成人在线视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品成人在线| 一级av片app| 欧美日韩在线观看h| 色视频www国产| 一区二区三区精品91| 三级国产精品片| 久久久午夜欧美精品| 少妇 在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产乱来视频区| 国产精品国产三级专区第一集| 韩国av在线不卡| 中文字幕av成人在线电影| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品一区二区性色av| 久久久色成人| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 男的添女的下面高潮视频| 久久99热这里只频精品6学生| 涩涩av久久男人的天堂| 91aial.com中文字幕在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 另类亚洲欧美激情| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产视频内射| 黄色一级大片看看| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩人妻高清精品专区| 丝袜美腿在线中文| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲av日韩在线播放| 精品久久久久久久久av| 男插女下体视频免费在线播放| 久热这里只有精品99| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲av日韩在线播放| 国产免费视频播放在线视频| 精品一区二区三卡| 精华霜和精华液先用哪个| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美另类一区| videos熟女内射| 精品久久久久久久久亚洲| 51国产日韩欧美| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产黄片视频在线免费观看| 欧美潮喷喷水| 国产精品久久久久久精品电影| 成人鲁丝片一二三区免费| 91久久精品电影网| 亚洲国产最新在线播放| 天天一区二区日本电影三级| 丰满乱子伦码专区| 特级一级黄色大片| 精品久久久久久久末码| 三级国产精品欧美在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲av国产av综合av卡| 香蕉精品网在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美精品国产亚洲| 免费av观看视频| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久久久久久免费av| 久久国内精品自在自线图片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 内射极品少妇av片p| av国产精品久久久久影院| 亚洲av二区三区四区| 亚洲精品国产av成人精品| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美xxxx性猛交bbbb| av播播在线观看一区| 中文字幕亚洲精品专区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 嫩草影院新地址| 一个人看的www免费观看视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 在线看a的网站| 少妇 在线观看| 国产一区二区三区av在线| 免费黄网站久久成人精品| av免费在线看不卡| 成人午夜精彩视频在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 韩国av在线不卡| 亚洲成人中文字幕在线播放| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 五月玫瑰六月丁香| 在线播放无遮挡| 免费观看性生交大片5| av天堂中文字幕网| 国产精品一区www在线观看| 男女边摸边吃奶| 国产一级毛片在线| 亚洲av男天堂| 色视频www国产| 久久国产乱子免费精品| 97在线人人人人妻| 国产黄a三级三级三级人| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 免费看日本二区| 免费av毛片视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 波野结衣二区三区在线| 简卡轻食公司| 精华霜和精华液先用哪个| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品久久久久久久久av| 免费看光身美女| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日本av手机在线免费观看| .国产精品久久| 亚洲国产色片| 成人黄色视频免费在线看| 97在线人人人人妻| 激情五月婷婷亚洲| 欧美人与善性xxx| 精品少妇久久久久久888优播| 99re6热这里在线精品视频| 综合色av麻豆| 亚洲精品一二三| 中国国产av一级| 亚洲欧美日韩东京热| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜精品国产一区二区电影 | 日本三级黄在线观看| 午夜激情久久久久久久| 日本熟妇午夜| 亚洲四区av| 国产极品天堂在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 在线 av 中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久久精品精品| 99re6热这里在线精品视频| 一级毛片我不卡| 亚洲精品aⅴ在线观看| 成人二区视频| 日韩大片免费观看网站| av在线亚洲专区| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 99久久人妻综合| 一级毛片电影观看| 黄色日韩在线| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产精品久久久久久精品古装| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩在线高清观看一区二区三区| av卡一久久| 日韩欧美 国产精品| 香蕉精品网在线| 亚洲av福利一区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 97超碰精品成人国产| 欧美成人a在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲av福利一区| 免费看光身美女| 热99国产精品久久久久久7| 一区二区三区精品91| 久久久久久久久久久丰满| 国产亚洲最大av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲国产av新网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品亚洲一区二区| 又爽又黄a免费视频| 久久影院123| 国产高清不卡午夜福利| 国产视频内射| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲在久久综合| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 成人美女网站在线观看视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产高潮美女av| 亚洲人成网站在线播| 欧美精品国产亚洲| 五月开心婷婷网| 51国产日韩欧美| 亚洲国产av新网站| 国产伦理片在线播放av一区| 日本一二三区视频观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 青春草视频在线免费观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 男的添女的下面高潮视频| 免费黄网站久久成人精品| av一本久久久久| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久性生活片| 成人国产av品久久久| 少妇丰满av| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲精品视频女| 伊人久久国产一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 在线看a的网站| 中文字幕亚洲精品专区| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一级爰片在线观看| av国产精品久久久久影院| 在线观看av片永久免费下载| 97在线人人人人妻| 日韩成人av中文字幕在线观看| 在线看a的网站| 一级av片app| 日日撸夜夜添| 亚洲三级黄色毛片| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久久久国产网址| 97精品久久久久久久久久精品| av免费在线看不卡| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 视频中文字幕在线观看| 亚洲色图av天堂| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品久久久久久精品古装| 我的老师免费观看完整版| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩人妻高清精品专区| 女人被狂操c到高潮| 最新中文字幕久久久久| 亚洲四区av| av线在线观看网站| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久精品欧美日韩精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 春色校园在线视频观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 婷婷色av中文字幕| 九草在线视频观看| 舔av片在线| 女人久久www免费人成看片| 国产在视频线精品| 看非洲黑人一级黄片| 少妇的逼水好多|