太平洋真寬水蚤(Eurytemorapacifica)熱休克蛋白70(HSP70)基因克隆及在金屬脅迫下的表達(dá)分析*

李 彬 景 斐 武敏敏 張建設(shè)

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

太平洋真寬水蚤(Eurytemorapacifica)熱休克蛋白70(HSP70)基因克隆及在金屬脅迫下的表達(dá)分析*

李 彬 景 斐 武敏敏 張建設(shè)①

(浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

熱休克蛋白 70(HSP70)是生物體內(nèi)一種重要的機(jī)體與細(xì)胞保護(hù)性蛋白。本文利用 RT-PCR以及RACE技術(shù)首次克隆獲得太平洋真寬水蚤(Eurytemorapacifica)HSP70簡(jiǎn)稱Ep.HSP70 cDNA的全長(zhǎng)序列,序列全長(zhǎng)為2252bp (KY807149),開放閱讀框(ORF)長(zhǎng) 1947bp,編碼 649個(gè)氨基酸,5′端99bp,3’端206bp;預(yù)測(cè)蛋白分子量為70.81kDa,等電點(diǎn)為5.16,為一種親水性蛋白,不存在信號(hào)肽及跨膜區(qū),含有豐富的α螺旋結(jié)構(gòu)(37.60%),β折疊(18.80%)。同源氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),與其他甲殼動(dòng)物的同源基因保守性較高,尤其是 HSP70家族典型的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)序列在甲殼類動(dòng)物中具有高度保守性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,太平洋真寬水蚤和安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)進(jìn)化關(guān)系最近;橈足類種內(nèi)同源性要高于蝦蟹類,與蝦類同源性高于蟹類。熒光定量數(shù)據(jù)分析表明,不同濃度銅、鎘、鋅脅迫下太平洋真寬水蚤HSP70基因表達(dá)水平具有顯著的時(shí)間效應(yīng)與濃度效應(yīng)的特征,三種金屬對(duì)Ep.HSP70抑制效應(yīng)呈現(xiàn)Cu＞Cd＞Zn的趨勢(shì)。Ep.HSP70基因的成功克隆及金屬脅迫下的表達(dá)分析為深入研究HSP70蛋白生物學(xué)功能具有重要意義。

太平洋真寬水蚤;熱休克蛋白70;基因克隆;金屬脅迫;表達(dá)分析

熱休克蛋白又稱熱激蛋白,在生物體內(nèi)按照其分子量的大小基本上分成小分子的 HSP、HSP60、HSP70、HSP90以及HSP100幾種(陳曦,2011)。其中HSP70基因(Mayeretal,2005;Shuetal,2011)在其結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性,這種特殊的結(jié)構(gòu)為其在啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄之后能夠快速產(chǎn)生成熟的 mRNA,以便 HSP70快速大量表達(dá)。HSP70作為非特異性的細(xì)胞保護(hù)蛋白,主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊,多肽的合成,保證蛋白質(zhì)按照通路進(jìn)行,通過以 ATP形式與為未折疊疏水區(qū)相結(jié)合從而穩(wěn)定蛋白未折疊下的穩(wěn)定狀態(tài),并通過有控制的釋放幫助其折疊。目前來看,HSP70功能的研究主要包括在參與細(xì)胞耐熱和細(xì)胞保護(hù)、分子伴侶、抗細(xì)胞凋亡與抗氧化、以及腫瘤免疫幾個(gè)方面。研究表明 HSP70在機(jī)體面臨氧化損傷時(shí)可以通過促使機(jī)體內(nèi)源性抗氧化劑的合成與釋放增加,從而使之具有抗氧化的活性,并且其結(jié)合物可以激活蛋白激酶 C來增強(qiáng)蛋白酶的活性,從而起到促進(jìn) ATF水解生成超氧化物歧化酶來使細(xì)胞抵御氧化傷害(陳蘭英等,2004;任寶波等,2005)。目前對(duì)HSP70已經(jīng)相繼在多種甲殼類動(dòng)物中克隆,同時(shí) HSP70基因在甲殼類動(dòng)物面臨不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)也有了少量報(bào)道(Kimetal,2014;Petkeviciuteetal,2015),但橈足類 HSP70基因克隆以及在重金屬脅迫中的研究相對(duì)不足。

隨著海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)要求的提高,海洋生物標(biāo)志物的研究逐漸興盛開來,有研究表明 HSP70可以作為海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)與預(yù)警的有效生物標(biāo)志物(Mayeretal,2005;Dakappagarietal,2010)。太平洋真寬水蚤作為我國近海海洋浮游生物的重要組成部分,在我國海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與防控以及維持近海海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮著舉足輕重的作用,而目前對(duì)太平洋真寬水蚤 HSP70基因的克隆與重金屬脅迫下的表達(dá)研究尚未見報(bào)道。本研究以太平洋真寬水蚤為實(shí)驗(yàn)材料,通過RACE方法獲得HSP70基因序列,利用生物學(xué)信息方法,鑒定太平洋真寬水蚤熱休克蛋白70基因,從分子水平解析Ep.HSP70基因的基本結(jié)構(gòu)和金屬脅迫下表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用太平洋真寬水蚤采集自浙江省舟山市長(zhǎng)峙島附近海域,體長(zhǎng)為1.20—1.40mm,經(jīng)解剖鏡下篩選純化,實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng) 7天后取樣實(shí)驗(yàn),暫養(yǎng)條件:水溫(20±0.5)℃,海水鹽度 28,光暗周期 12h:12h,24小時(shí)充氧,餌料為海水小球藻。實(shí)驗(yàn)時(shí),選取子代中外觀形態(tài)與附肢完整,生命活性強(qiáng)的健康的太平洋真寬水蚤的成體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象;實(shí)驗(yàn)樣品處理后,由液氮速凍后,置于–80℃保存?？寺〔牧蠟閷?duì)照組太平洋真寬水蚤,qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)材料為不同金屬脅迫處理后的太平洋真寬水蚤的總 RNA,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組下個(gè)體重復(fù)3次。

1.2 試劑

OMEGA Total RNA Kit II購自美國Omega公司;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa公司;3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTases試劑盒、pMDTM18-T Vector Cloning Kit等購自TaKaRa公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)引物由上海華大生物科技合成。

1.3 RACE獲得目的基因全長(zhǎng)序列

根據(jù)已知橈足類 HSP70全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物獲得太平洋真寬水蚤 Ep.HSP70基因的中間片段,再采用 RACE技術(shù),設(shè)計(jì) HSP70基因特異性引物進(jìn)行5’cDNA 和3’cDNA 末端的克隆。5’RACE 和3’RACE的操作按照TaKaRa的RACE試劑盒說明書進(jìn)行,將獲得的目的片段經(jīng)分離純化后鏈接到pMD18-T載體上,然后轉(zhuǎn)化到 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑選陽性克隆送往上海美吉生物技術(shù)有限公司測(cè)序。實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。

表1 本研究中普通PCR以及RACE所用引物Tab.1 Primers used for the PCR and RACE in this study

1.4 太平洋真寬水蚤Ep.HSP70序列分析

用 DNAMAN 8.0 軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,得到太平洋真寬水蚤HSP70基因的全長(zhǎng)cDNA 序列。編碼區(qū)及非編碼區(qū)的預(yù)測(cè)利用 NCBI在線網(wǎng)站 ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)來預(yù)測(cè)。分子量和等電點(diǎn)在Expasy 網(wǎng)站(http://web.expasy.org/compute pi/)進(jìn)行分析,使用SignalP 4.1 Server網(wǎng)址為與TMHMM Server v.2.0 分別對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽以及跨膜區(qū)的預(yù)測(cè);使用 Swissport在線軟件對(duì) HSP70基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析 http://swissmodel.expasy.org/;用SMS在線序列處理工具包對(duì)Ep.HSP70基因氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性多重比對(duì),使用 MEGA6.0以鄰位相連法(Neighborjoining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)表達(dá)分析

利用Prime primer 5.0軟件在HSP70基因編碼區(qū)范圍內(nèi)設(shè)計(jì)熒光定量 PCR所需的特異性引物,內(nèi)參引物為18S rRNA,見表2。實(shí)驗(yàn)所用引物由上海華大生物公司合成,采用PAGE純化方式。樣品經(jīng)過三種重金屬銅、鎘、鋅半致死濃度LC50(馬楨紅等,1999),以及 1/2LC50、1/4LC50、1/8LC50以及 1/16LC50暴露處理,提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 模板進(jìn)行熒光定量PCR。目的基因與內(nèi)參基因設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)與3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以未金屬脅迫組太平洋真寬水蚤為對(duì)照,排除每 3個(gè)重復(fù)中差異較大的數(shù)據(jù),其余數(shù)據(jù)采用 2–ΔΔCT法(Livaketal,2001)進(jìn)行 HSP70基因相對(duì)表達(dá)分析,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(張?zhí)K江等,2003)以及顯著性差異分析,當(dāng)P＜0.05時(shí)為顯著差異。

表2 研究中熒光定量PCR所用引物Tab.2 Primers used for the qRT-PCR in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 太平洋真寬水蚤Ep.HSP70全長(zhǎng)的獲得

以太平洋真寬水蚤RNA反轉(zhuǎn)錄后cDNA為模版,以 DP-HSP70.F/R為引物擴(kuò)增獲得 492bp目的片段,根據(jù)該終極那序列設(shè)計(jì)RACE引物,采用RACE方法獲得HSP70基因863bp的5’端序列以及1425bp的3’端序列(圖1)。

2.2 太平洋真寬水蚤 Ep.HSP70 cDNA全長(zhǎng)的序列特征

利用DNAMAN 8.0軟件將擴(kuò)增得到的長(zhǎng)度為的492bp的核心片段以及 863bp的 3’RACE和1425bp的5’RACE序列片段進(jìn)行拼接,得到太平洋真寬水蚤Ep.HSP70基因的 cDNA序列全長(zhǎng)(KY807149)為2252bp,ORF長(zhǎng) 1947bp,編碼 649個(gè)氨基酸(aa),5’UTR與3’UTR分別由99bp、206bp的核苷酸組成,具有典型的polyA尾巴以及AATAAA加尾信號(hào)(圖2)。

2.3 太平洋真寬水蚤 Ep.HSP70氨基酸序列比對(duì)以及同源性分析

使用在線分析軟件 SMS多重序列同源性比對(duì),將 Ep.HSP70基因編碼的氨基酸序列與目前已經(jīng)公布的部分甲殼類的 HSP70基因進(jìn)行比對(duì)(圖3),并通過 DNAMAN8.0軟件對(duì)所有序列與太平洋真寬水蚤 HSP70蛋白序列之間的同源相似性進(jìn)行計(jì)算(表3)。結(jié)果顯示,太平洋真寬水蚤(Eurytemora pacifica)與安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)相似度最高為92.14%,與其他水蚤如日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)相似度為88.37%,與矮小擬鏢水蚤(Paracyclopinanana)為85.67%等,表明Ep.HSP70基因?yàn)閷儆贖SP70家族基因成員。

圖1 RNA、Ep.HSP70核心片段以及5’/3’RACE電泳圖片F(xiàn)ig.1 The electrophoresis image of RNA,core sequences,and 5’/3’RACE of Ep.HSP70

圖2 Ep.HSP70 cDNA序列及編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Ep.HSP70

使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹,計(jì)算方法采用 Bootstrap法(陳紅等,1997)重復(fù)計(jì)算 1000次。NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹中所用物種名及GenBank的登錄號(hào)等相關(guān)信息在表4列出。結(jié)果如圖4所示,太平洋真寬水蚤HSP70基因與安氏偽鏢水蚤(P.annandalei)位于同一進(jìn)化枝,氨基酸序列相似度最高,表明親緣關(guān)系最近;總體上,橈足類(Copepods)與蝦類(Shrimps)系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹聚為一簇,與蟹類的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 太平洋真寬水蚤 Ep.HSP70基因的生物信息學(xué)分析

圖3 Ep.HSP70基因氨基酸序列多重比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of the deduced amino acid sequence of Ep.HSP70 gene

表3 用于序列分析的HSP70家族基因Tab.3 HSP70 family neuropeptide for sequence analysis

表4 Ep.HSP70蛋白酶切位點(diǎn)分析表Tab.4 The Restriction Sites analysis of Ep.HSP70

圖4 Ep.HSP70的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-Joining phylogenetic tree analysis of Ep.HSP70

分析結(jié)果如下:太平洋真寬水蚤Ep.HSP70基因編碼蛋白包括341個(gè)親水性氨基酸和305個(gè)疏水性氨基酸,氨基酸疏水性最大為2.64,最小為–3.88,平均親水系數(shù)(GRAVY)-0.407,親水性氨基酸多于疏水性氨基酸,為親水性蛋白(圖5);此外,蛋白的消光系數(shù)為29380 M–1cm–1,脂肪系數(shù) 79.83,帶負(fù)電殘基總數(shù)(Asp+Glu)為100,帶正電殘基總數(shù)(Arg+Lys)為83。Compute pI/Mw結(jié)果顯示其等電點(diǎn)/理論蛋白分子質(zhì)量(pI/Mw)為5.16/70812.197;Peptide cutter進(jìn)行蛋白酶切位點(diǎn)分析結(jié)果如表4所示。SignalP 4.1 Sever對(duì)HSP70蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)(圖6),TMHMM蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白無跨膜區(qū)(圖7)。GOR方法對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示該蛋白由 α-螺旋 23.74%,延伸鏈 23.02%,無規(guī)則卷曲 53.24%組成(圖8)。Swiss model蛋白的3D立體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖9所示,該蛋白具有明顯的11個(gè)α-螺旋以及6個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)組成(b、c、d),C末端(MET1)以及N末端(GLU555)。

圖5 Ep.HSP70氨基酸疏水性分析Fig.5 Hydrophobic amino acid analysis of Ep.HSP70

圖6 Ep.HSP70信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 The signal peptide prediction of Ep.HSP70

圖7 Ep.HSP70氨基酸序列跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Transmembrane region analysis of Ep.HSP70 amino acid sequence

Swiss-PdbViewer4.0.4蛋白功能位點(diǎn)模式(prosite patterns)分析顯示存在10個(gè)蛋白翻譯后修飾位點(diǎn),PS00001N糖基化位點(diǎn)N-{P}-[ST]-{P},PS00004環(huán)磷酸鳥苷-環(huán)磷酸腺苷蛋白激酶[RK](2)-x-[ST],PS00005蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn)[ST]-x-[RK],PS00006磷酸化位點(diǎn)[ST] -x(2)-[DE],PS00007酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)[RK]-x(2,3)-[DE]-x(2,3)-Y,PS00008?；稽c(diǎn)G-{EDRKHPFYW}-x(2)-[STAGCN]-{P},PS00342微體 c端靶信號(hào)[STAGCN]-[RKH]-[LI VMAFY],以及熱休克蛋白 HSP70家族信號(hào) PS00297 [IV]-D-LG-T-[ST]-x-[SC],PS00329 [LIVMF]-[LIVMFY]-[DN]-[LIVMFS]-G-[GSH]-[GS]-[AST]-x(3)-[ST]-[LIVM]-[L IVMFC],PS0 1036[LIVMY]-x-[LIVMF]-x-G-G-x-[ST]-x-[LIVM]-P-x-[LIVM]-x-[DEQKRSTA]。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示該蛋白具有HSP70家族結(jié)構(gòu)特征:9—16位氨基酸IDLGTTYS,198—211位氨基酸IFDLGGGTF DVSIL,335—349位氨基酸IVLVGGSTRIPKIQ,131—136位氨基酸處AEAYLG的ATP/GTP機(jī)構(gòu)域,247—275位氨基酸處核信號(hào)位點(diǎn)序列 KRKHKKDI KGNKRA LRRLRTACERAKRTL,646—649位氨基酸處HSP70羧基末端保守區(qū)域EEVD(圖2)。

2.5 太平洋真寬水蚤 Ep.HSP70基因在重金屬脅迫下的表達(dá)分析

通過real time PCR方法對(duì)Ep.HSP70基因在重金屬銅鎘鋅脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),以太平洋真寬水蚤18S rRNA基因作為內(nèi)參基因,選取正常組下太平洋真寬水蚤的表達(dá)量作為參照,每個(gè)處理下做了 3個(gè)重復(fù),采用 2–ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量,并用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ep.HSP70基因在三種重金屬脅迫下均有表達(dá),但不同時(shí)間段以及不同濃度下的表達(dá)量高低有所不同(圖10,圖11,圖12),24、48、96h銅脅迫各濃度下,48、120h鎘脅迫以及鋅脅迫各時(shí)間具有顯著差異(P＜0.05)。

圖8 Ep.HSP70蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure model of Ep.HSP70

圖9 Ep.HSP70蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.9 The 3-dimensional structures of Ep.HSP70 domain predicted by Cn3D-4.1

圖10 銅暴露下Ep.HSP70 mRNA表達(dá)量水平Fig.10 The mRNA expression levels of Ep.HSP70 under Cu exposure

圖11 鎘暴露下Ep.HSP70 mRNA表達(dá)量水平Fig.11 The mRNA expression levels of Ep.HSP70 under Cd exposure

分析結(jié)果如下:Ep.HSP70基因mRNA表達(dá)水平銅脅迫下24、48h低量表達(dá),72h上升于96h各濃度下達(dá)到峰值,隨后降低(圖 10);鎘脅迫下,與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比,24h各濃度低量表達(dá),48h的1/16、1/8及1/4LC50低濃度表達(dá)量峰值,72h的1/2LC50與LC50高濃度達(dá)到峰值(圖11)。鋅脅迫下,除半致死濃度LC50在48h表達(dá)量到達(dá)峰值外,各濃度下基因表達(dá)量在24h達(dá)到峰值,隨后基因總體表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖12)。Ep.HSP70基因在三種金屬脅迫下表達(dá)量結(jié)果表明:銅對(duì) HSP70表達(dá)的抑制作用要明顯的高于鎘與鋅;金屬脅迫下Ep.HSP70基因在低濃度下的表達(dá)量高于高濃度下的表達(dá)量,高濃度組金屬脅迫對(duì)基因的表達(dá)抑制性較強(qiáng),表明重金屬離子對(duì) Ep.HSP70表達(dá)水平的抑制率高濃度高于低濃度;金屬脅迫下,濃度效應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)趨勢(shì)明顯。

圖12 鋅暴露下Ep.HSP70 mRNA表達(dá)量水平Fig.12 The mRNA expression levels of EpHSP70 under Zn exposure

3 討論

HSP70熱休克蛋白是生物體保留下來的可用于對(duì)抗外界損害并能夠進(jìn)行自我保護(hù)的重要機(jī)制之一,在應(yīng)激的不利條件下,提高細(xì)胞的抵抗力,起到應(yīng)激保護(hù)作用?？寺〉玫降?252bp的Ep.HSP70 cDNA序列,氨基酸分析發(fā)現(xiàn)無跨膜結(jié)構(gòu)與信號(hào)肽,因此不屬于細(xì)胞內(nèi)分泌的蛋白,但能有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白的表達(dá),充當(dāng)分子伴侶參與相關(guān)功能免疫以及蛋白折疊表達(dá)。此外,氨基酸序列中存在多個(gè)磷酸化的位點(diǎn),在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。保守結(jié)構(gòu)域分析表明Ep.HSP70及其同源蛋白結(jié)構(gòu)中均具有HSP70家族基因的保守簽名序列以及結(jié)構(gòu)特征,包括HSPA1-2_6-8-like_NBD結(jié)構(gòu)域以及 DNAK結(jié)構(gòu)域,ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn),核定位信號(hào)等,其中核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域富含賴氨酸和精氨酸,為選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)HSP70s進(jìn)入核中而發(fā)揮其功能。其親疏水性、等電位點(diǎn)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)、蛋白二級(jí)以及三維結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與其他相關(guān)HSP70研究結(jié)果相似(吳圣楠等,2017)。螺旋結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性與多重折疊也說明了 HSP70基因功能的多樣性,在參與細(xì)胞耐熱和細(xì)胞保護(hù)、分子伴侶、抗細(xì)胞凋亡與抗氧化、以及腫瘤免疫幾個(gè)方面發(fā)揮著重要作用(張靜,2007)。同源性分析表明 HSP70作為生物體內(nèi)相對(duì)保守的一類蛋白在各物種內(nèi)廣泛存在,其與橈足類、蝦蟹類等甲殼類中具有較高的相似性,為HSP70s家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化顯示整個(gè)HSP70系統(tǒng)發(fā)育樹Ep.HSP70基因與十足目蝦蟹類的HSP70分為兩個(gè)大支,三個(gè)小支。兩大支中MEGA 6.0將蝦類(Shrimps)與橈足類(Copepods)或分到一個(gè)大支,將蟹類(Crabs)單獨(dú)到一個(gè)分支,從外觀形態(tài)以及游泳形式來看蝦類與橈足類的相似性較近一些,而分子序列同源性上也相對(duì)較近(表4)。

熒光定量PCR法(Heidetal,1996)對(duì)Ep.HSP70基因在金屬脅迫下表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn),Ep.HSP70基因的表達(dá)在不同的金屬暴露下表達(dá)不同;同種金屬脅迫下,Ep.HSP70表達(dá)量具有一定的時(shí)間效應(yīng)與濃度效應(yīng)表達(dá)模式。銅脅迫下,Ep.HSP70表達(dá)在96h內(nèi)成遞增表達(dá)趨勢(shì),并96h表達(dá)量達(dá)到峰值,120h表達(dá)量下降。其中在24h表達(dá)差異性顯著(P＜0.05)低于對(duì)照組的表達(dá)水平,這可能是源于太平洋真寬水蚤初期機(jī)體受到重金屬的暴露性損傷而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)相關(guān)的蛋白功能受到抑制,熱休克蛋白無法短時(shí)間內(nèi)高量表達(dá)所造成的(Jiangetal,2016),鎘暴露中表達(dá)規(guī)律幾近一致;鋅暴露下Ep.HSP70基因在24h高量表達(dá)(Shuetal,2011)。這種差異性的與三種金屬的生理毒性相關(guān),本實(shí)驗(yàn)前期半致死以及產(chǎn)卵孵化變化中結(jié)果顯示的毒性強(qiáng)弱:Cu＞Cd＞Zn具有一致性。而隨后的表達(dá)量逐漸上升,說明了在經(jīng)受了一定時(shí)間的暴露后,Ep.HSP70蛋白開始發(fā)揮其功能且表達(dá)量遞增并在一定時(shí)間段內(nèi)達(dá)到表達(dá)的最高值(Jiangetal,2016),但由于海洋生物對(duì)不同重金屬的耐受性不同以及海洋污染重金屬生物毒性的大小也存在差異(Rheeetal,2009),因此在本實(shí)驗(yàn)研究中,銅離子對(duì)Ep.HSP70的抑制脅迫作用要強(qiáng)于鎘離子與鋅離子。此外,Ep.HSP70最高表達(dá)量峰值出現(xiàn)在1/8LC50濃度下Ep.HSP70表達(dá)量從濃度1/8LC50開始降低,在低濃度實(shí)驗(yàn)組中(即濃度低于 1/8LC50時(shí))表達(dá)量水平呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì);在較高濃度實(shí)驗(yàn)組中,Ep.HSP70表達(dá)量變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出隨著濃度升高表達(dá)量逐漸降低的特點(diǎn)。因此推斷,在重金屬暴露下Ep.HSP70表達(dá)量特點(diǎn)為:在一定的濃度范圍內(nèi),重金屬污染濃度越高,應(yīng)激和免疫相關(guān)基因的表達(dá)越高。然而,當(dāng)表達(dá)量在達(dá)到一定的表達(dá)峰值之后,其基因的表達(dá)量不僅不會(huì)隨著濃度升高不斷上升,反而會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(Kimetal,2014)。HSP70表達(dá)水平的上下波動(dòng)變化反映了生物有機(jī)體提高自身對(duì)外來環(huán)境脅迫閾值與自我保護(hù)的機(jī)制需要,也表明 HSP70在抵御外界環(huán)境脅迫與機(jī)體調(diào)控中起著重要作用。此外,鑒于生物體內(nèi)HSP70對(duì)海洋重金屬污染的敏感性與抗逆性,HSP70被用作一種較為穩(wěn)定而方便的海洋水環(huán)境監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物(蔡中華等,2012),在海洋水體污染的監(jiān)測(cè)與前期預(yù)防發(fā)揮重要作用。因此,研究浮游橈足類太平洋真寬水蚤體內(nèi) HSP70在海洋環(huán)境重金屬暴露中的表達(dá)特征,為海洋污染對(duì)浮游生物的總體影響提供較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)與判斷,為HSP70作為海洋污染監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物理論提供支撐。

4 結(jié)論

本研究通過 RACE技術(shù)首次克隆獲得太平洋真寬水蚤HSP70基因全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)其序列生物學(xué)特征進(jìn)行了分析與探討,采用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了重金屬脅迫下 HSP70基因在太平洋真寬水蚤體內(nèi)的差異表達(dá),研究結(jié)果為進(jìn)一步探討太平洋真寬水蚤HSP70蛋白相關(guān)功能性研究和HSP70家族其他基因的克隆奠定了基礎(chǔ),為其他橈足類HSP70基因的研究及系統(tǒng)演化與分類系統(tǒng)提供借鑒;同時(shí)為HSP70作為海洋水體污染監(jiān)測(cè)與防控的有效生物標(biāo)志物以及橈足類在海洋污染指示生物中的研究?jī)r(jià)值與研究意義等提供借鑒。

馬楨紅,馬良才,1999.生物測(cè)定中LC50或LD50的Excell運(yùn)算方法.醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制,15(11):612—614

任寶波,王玉艷,王純凈等,2005.HSP70家族的分類及基因結(jié)構(gòu)與功能.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,26(1):98—101

吳圣楠,隗黎麗,李海軍等,2017.三角帆蚌熱休克蛋白70基因克隆及其表達(dá)分析.水生生物學(xué)報(bào),41(1):50—55

張 靜,2007.鉛誘導(dǎo)熱應(yīng)激蛋白 70基因表達(dá)的研究.天津:天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文

張?zhí)K江,陳慶波,2003.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件 SPSS的應(yīng)用(四)——廣義因素方差分析(GLM-General Factorial ANOVA).畜牧與獸醫(yī),35(8):24—26

陳 紅,吳匯川,1997.Bootstrap方法及其應(yīng)用.青島大學(xué)學(xué)報(bào),12(3):78—83

陳 曦,2011.熱休克蛋白及熱休克蛋白 70家族進(jìn)化保守性的系統(tǒng)分析.大連:遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文

陳蘭英,朱泮民,李冰冰等,2004.HSP70的結(jié)構(gòu)、特性和功能研究進(jìn)展.平頂山工學(xué)院學(xué)報(bào),13(2):41—43

蔡中華,陳艷萍,周 進(jìn)等,2012.生物標(biāo)志物(Biomarkers)在海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中的研究與進(jìn)展.生命科學(xué),24(9):1035—1048

Dakappagari N,Neely L,Tangri Setal,2010.An investigation into the potential use of serum Hsp70 as a novel tumour biomarker for Hsp90 inhibitors.Biomarkers,15(1):31—38

Heid C A,Stevens J,Livak K Jetal,1996.Real time quantitative PCR.Genome Research,6(10):986—994

Jiang X Y,Guan X T,Yao L Letal,2016.Effects of single and joint subacute exposure of copper and cadmium on heat shock proteins in common carp (Cyprinuscarpio).Biological Trace Element Research,169(2):374—381

Kim B M,Rhee J S,Jeong C Betal,2014.Heavy metals induce oxidative stress and trigger oxidative stress-mediated heat shock protein (hsp)modulation in the intertidal copepodTigriopus japonicus.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology &Pharmacology,166:65—74

Livak K J,Schmittgen T D,2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCTmethod.Methods,25(4):402—408

Mayer M P,Bukau B,2005.Hsp70 chaperones:cellular functions and molecular mechanism.Cellular and Molecular Life Sciences,62(6):670—684

Petkeviciute E,Kania P W,Skovgaard A,2015.Genetic responses of the marine copepodAcartiatonsa(Dana)to heat shock and epibiont infestation.Aquaculture Reports,2:10—16

Rhee J S,Raisuddin S,Lee K Wetal,2009.Heat shock protein(Hsp)gene responses of the intertidal copepodTigriopus japonicusto environmental toxicants.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology &Pharmacology,149(1):104—112

Shu Y H,Du Y,Wang J W,2011.Molecular characterization and expression patterns ofSpodopteralituraheat shock protein 70/90,and their response to zinc stress.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular &Integrative Physiology,158(1):102—110

CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 GENE INEURYTEMORAPACIFICAUNDER METAL STRESS

LI Bin, JING Fei, WU Min-Min, ZHANG Jian-She
(Marine Science College of Zhejiang Ocean University,National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture,Zhoushan316022,China)

Heat shock protein 70 (HSP70)is an important protective protein in organism and cells.The full length sequences cDNA of HSP70 inEurytemorapacifica(short named Ep.HSP70)was cloned for the first time using the RT-PCR and RACE techniques.The sequence length is 2252bp,the GenBank accession number is KY807149;the open reading frame (ORF)is 1947bp encoding 649 amino acids,the 5′terminal 99bp and the 3' terminal 206bp.The predicted protein molecular weight is 70.81kDa,isoelectric point is 5.16,and it is a hydrophilic protein with no signal peptide and transmembrane domain.In addition,it is rich in alpha helical structure (37.60%)and beta fold (18.80%).Multiple homologous amino acid sequence alignment showed high conservatism between Ep.HSP70 and others HSP70 of crustaceans;especially,the conserved signature sequences of HSP70 family are highly conserved in crustaceans.Phylogenetic analysis showed that the evolutionary relationships betweenE.pacificaandPseudodiaptomusannandaleiis the nearest than others,and the intraspecific homology of copepods is higher than shrimp and crab.Moreover,the homology with shrimps is higher than crabs.Fluorescent quantitative PCR showed that the expression level of Ep.HSP70 had significant time effect and concentration effect under different concentrations stresses of Cu,Cd and Zn.The order of inhibition effect of the three metals on Ep.HSP70 were Cu＞Cd＞Zn.The successful cloning of Ep.HSP70 gene and expression analysis under heavy metal stresses are of great significance for the further study on the biological function of HSP70 protein.

Eurytemorapacifica;heat shock protein 70;gene cloning;metal stress;expression analysis

Q789;Q955

10.11693/hyhz20170400100

* 海洋科學(xué)浙江省重中之重學(xué)科開放課題資助,20140104號(hào);國家海洋局公益性行業(yè)科研專項(xiàng),201505025號(hào)。李 彬,碩士研究生,E-mail:13957206952@163.com

① 通訊作者:張建設(shè),副教授,E-mail:zhangjianshe@zjou.edu.cn

2017-04-23,收修改稿日期:2017-05-22