益氣活血顆粒質量標準研究

翁燕，陸超，蔡云珊，劉志輝*

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029)

益氣活血顆粒質量標準研究

翁燕1，2，陸超1，蔡云珊2，劉志輝1*

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029)

目的建立益氣活血顆粒的質量控制方法。方法以對照藥材為對照，選用薄層色譜法(TLC)定性鑒別制劑中黃芪/炙黃芪、五味子、牡丹皮、莪術、丹參；分別采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)和高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)法對益氣活血顆粒中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮苷進行定量測定。結果處方中5味藥材均能通過薄層色譜法檢出，且斑點清晰，分離良好。黃芪甲苷和毛蕊異黃酮苷分別在進樣量為2.32 ～37.04 μg、19.62～314 ng呈良好線性關系，平均回收率分別為91.25%、93.59%，RSD分別為2.27%(n=6)、1.90%(n=6)。結論研究建立的方法可有效用于益氣活血顆粒的定性、定量控制。

益氣活血顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮苷

益氣活血顆粒是江蘇省中醫(yī)院的有效經(jīng)驗方，由莪術、五味子、黃芪、炙黃芪、牡丹皮等10味中藥組成，具有益氣滋陰、活血祛瘀之功能，臨床上在改善冠心病心絞痛發(fā)作頻率、心絞痛程度、持續(xù)時間等方面具有良好的療效。本實驗根據(jù)醫(yī)療機構制劑申報的要求，采用薄層色譜法，定性鑒別莪術、五味子、黃芪、牡丹皮等飲片。對于黃芪/炙黃芪的有效成分黃芪甲苷和毛蕊異黃酮苷分別采用HPLC-ELSD和HPLC-UV法進行含量測定，以對該顆粒的質量進行有效控制，為患者的用藥提供安全、有效的質量保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀、2998 PDA檢測器；Waters 2998二極管陣列檢測器；Alltech-ELSD 2000型蒸發(fā)光散射檢測器；BP-211D型電子分析天平(德國，Sartorius公司)。

1.2 試藥

黃芪對照藥材、五味子對照藥材、牡丹皮對照藥材、莪術(溫郁金)對照藥材、丹參對照藥材、黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為120974-201311、120922-201309、121490-201102、121304-200902、120923-201414、110781-201213)；毛蕊異黃酮苷對照品(批號：141118，寧歧醫(yī)藥科技公司)；益氣活血顆粒(批號分別為160122、160123、160125，10 g/袋，江蘇省中醫(yī)院)；甲醇、乙腈為色譜純，供高效液相色譜分析用；其他試劑為分析純，供薄層色譜分析用；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪/炙黃芪的TLC鑒別 取益氣活血顆粒15 g，以100 mL水溶解后，每次加入40 mL水飽和正丁醇溶液萃取，共4次。用氨試液洗滌合并的正丁醇液2次，每次40 mL。待分層，棄氨液，取正丁醇液蒸干，殘渣以甲醇1 mL使全部溶解，得供試品溶液[1-2]。取缺黃芪/炙黃芪制劑，同法制得黃芪/炙黃芪陰性供試品。取4 g黃芪對照藥材，加50 mL甲醇，超聲處理30 min后，將濾液蒸干，加入15 mL水溶解全部殘渣。按供試品溶液制備方法，自“每次加入40 mL水飽和正丁醇溶液萃取”起操作，得黃芪對照藥材溶液。

照TLC(《中華人民共和國藥典》四部0502)試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，點于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，以10%硫酸乙醇液顯色，于105 ℃恒溫加熱直至斑點清晰，日光下檢視[1-2]。在相同色譜位置上供試品與對照藥材均顯紅棕色斑點，陰性供試品無干擾。黃芪/炙黃芪TLC圖見圖1。

注：1.供試品；2.黃芪對照藥材；3.制劑黃芪/炙黃芪陰性。圖1 黃芪的薄層鑒別

2.1.2 五味子的TLC鑒別 取益氣活血顆粒5 g，以三氯甲烷30 mL加熱回流提取30 min后，濾過，濾液水浴蒸干，以1mL三氯甲烷溶解全部殘渣，得供試品溶液[1]。取缺五味子制劑，同法操作，得五味子陰性供試品。取五味子對照藥材1 g，按供試品溶液方法操作，得五味子對照藥材溶液。

照TLC(《中華人民共和國藥典》四部0502)試驗，吸取上述3種溶液各2 μL，點于硅膠GF254薄層板上，將石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(12∶5∶1)的上層溶液作為展開劑展開，晾干后，置紫外光燈光下(254 nm)檢視[1]。結果，在相同色譜位置上供試品與對照藥材斑點相同，陰性樣品無干擾。五味子TLC圖見圖2。

注：1.供試品；2.五味子對照藥材；3.制劑五味子陰性。圖2 五味子的薄層鑒別

2.1.3 牡丹皮的TLC鑒別 取益氣活血顆粒8 g，以50 mL水溶解后，每次加入20 mL水飽和正丁醇萃取，共3次，蒸干合并的正丁醇液，以1 mL甲醇溶解全部殘渣，得供試品溶液[3]。取缺牡丹皮制劑，同法操作，得牡丹皮陰性供試品。取1 g牡丹皮對照藥材，以10 mL甲醇超聲處理15 min后，濾過，濾液濃縮至1 mL，得牡丹皮對照藥材溶液。

照TLC(《中華人民共和國藥典》四部0502)試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，將三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)作為展開劑，噴以5%香草醛硫酸溶液顯色后，105 ℃恒溫加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視[3]。在相同色譜位置上，供試品與對照藥材顯相同的紫色斑點，陰性樣品無干擾。牡丹皮TLC圖見圖3。

注：1.供試品；2.牡丹皮對照藥材；3.制劑牡丹皮陰性。圖3 牡丹皮的薄層鑒別

2.1.4 醋莪術的TLC鑒別 取益氣活血顆粒10 g，以50 mL水溶解后，每次加入20 mL石油醚(30～60 ℃)萃取，共3次。合并石油醚液，蒸干，殘渣以無水乙醇1 mL溶解，得供試品溶液[4]。取缺醋莪術制劑，同法操作，得醋莪術陰性供試品。取醋莪術對照藥材0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入石油醚(30～60 ℃)10 mL，超聲處理20 min后，濾過，揮干濾液，殘渣加1 mL無水乙醇使溶解，得醋莪術對照藥材溶液。

照TLC(《中華人民共和國藥典》四部0502)試驗，吸取上述溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，將石油醚(30～60 ℃)-丙酮-乙酸乙酯(94∶5∶3)作為展開劑，以1%香草醛硫酸溶液為顯色劑，并于105 ℃恒溫加熱至斑點顯色清晰[1]，于日光下檢視。在相同色譜位置上，供試品與對照藥材顯相同的淡紅色斑點，陰性樣品無干擾。醋莪術TLC圖見圖4。

注：1.供試品；2.醋莪術對照藥材；3.制劑醋莪術陰性。圖4 醋莪術的薄層鑒別

2.1.5 丹參的TLC鑒別 取益氣活血顆粒12 g，以50 mL水溶解后，加入鹽酸1 mL于溶液中。以乙酸乙酯萃取2次，每次40 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣以1 mL甲醇溶解，得供試品溶液。取缺丹參制劑，同法操作，得丹參陰性供試品。取丹參對照藥材0.5 g，向其中加入水10 mL、乙酸乙酯10 mL、鹽酸1 mL后，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加入甲醇1 mL溶解，作為丹參對照藥材溶液。

照TLC(《中華人民共和國藥典》四部0502)試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶6∶1)作為展開劑，以2%三氯化鐵乙醇溶液為顯色劑，于105 ℃恒溫加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視[5]。供試品與對照藥材在相同色譜位置上，日光下均藍色斑點，陰性無干擾。丹參TLC圖見圖5。

注：1.供試品；2.丹參對照藥材；3.制劑丹參陰性。圖5 丹參的薄層鑒別

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件 HederaC18ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(33∶67)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；蒸發(fā)光散射檢測器；漂移管溫度：103 ℃；載氣流量：2.8 L·min-1[1]。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量于量瓶中，以甲醇定容，得質量濃度為1.852 mg·mL-1黃芪甲苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取益氣活血顆粒15 g，以100 mL水溶解后，每次加入30 mL水飽和正丁醇溶液萃取，共4次。合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次30 mL，取正丁醇液蒸干，殘渣以甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶中[6-9]。

2.2.4 陰性溶液制備 取缺黃芪/炙黃芪陰性制劑，按2.2.3項下的方法操作，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液，注入高效液相色譜儀，按2.2.1項下色譜條件測定，見圖6。結果顯示，供試品與對照品在相同保留時間處均有較大吸收，陰性無雜質干擾，理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計大于5000。

注：a.對照品；b.供試品；c.陰性樣品。圖6 黃芪甲苷HPLC-ELSD圖

2.2.6 線性關系考察 精密吸取上述黃芪甲苷對照品溶液，加甲醇依次稀釋至濃度為1.852、0.962、0.463、0.232、0.116 mg·mL-1，按2.2.1項下色譜條件測定。以進樣量的自然對數(shù)為橫坐標(X)，響應值的自然對數(shù)為縱坐標(Y)，得回歸方程Y=1.737 4X+11.71(r=0.998 1)。結果顯示，黃芪甲苷的檢測進樣量線性范圍為2.32～37.04 μg。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取0.926 mg·mL-1黃芪甲苷對照品，重復進樣6次，按2.2.1項下條件測定，以黃芪甲苷峰面積計，RSD為0.47%。

2.2.8 重復性試驗 取益氣活血顆粒(批號：160122)約5.2 g，共6份，依2.2.3項下方法制備供試品，按2.2.1項下條件測定，計算得黃芪甲苷平均含量為1.27 mg·g-1，RSD為2.86%(n=6)。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批號的益氣活血顆粒(批號：160122)，依2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下條件分別于第0、2、4、6、8、12 h進樣，測定，以黃芪甲苷峰面積計，RSD為1.03%。

2.2.10 加樣回收試驗 精密稱定6份已知含量的益氣活血顆粒(批號：160122)各2.6 g，并精密加入0.628 mg·mL-1黃芪甲苷對照品溶液適量，依2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件測定，結果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率實驗結果(n=6)

2.2.11 樣品含量測定 分別稱取益氣活血顆粒(批號分別為160122、160123、160125)3批各適量，依2.2.3項下操作制備供試品，按2.2.1項下條件測定，計算3批樣品中的含量，以黃芪甲苷計分別為1.31、1.17、1.25 mg·g-1。

2.3 毛蕊異黃酮苷含量測定

2.3.1 色譜條件 HederaC18ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫[10-11]：0～20 min 20%～40%A，20～30 min 40% A，30～32 min 40%～20% A；檢測波長260 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱定毛蕊異黃酮苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度為31.4 μg·mL-1的毛蕊異黃酮苷對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取益氣活血顆粒0.53 g，置10 mL容量瓶中，加入甲醇適量使溶解，并定容至刻度，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性溶液制備 取黃芪/炙黃芪陰性制劑，依2.2.3項下方法制備黃芪/炙黃芪陰性溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗 分取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液，按2.3.1項下條件測定，見圖7。供試品與對照品在相同位置均有較大吸收，且陰性無雜質干擾。

注：a.對照品；b.供試品；c.陰性樣品。圖7 毛蕊異黃酮苷系統(tǒng)適應性圖譜

2.3.6 線性關系考察 精密吸取質量濃度為31.4 μg·mL-1毛蕊異黃酮苷對照品溶液，加甲醇稀釋成質量濃度依次為15.7、7.85、0.463、3.925、1.963、0.981 μg·mL-1的溶液，按2.3.1項下條件測定，經(jīng)線性回歸，得方程Y=14 664X-65.996(r=0.999 8)。表明，毛蕊異黃酮葡苷在19.62～314 ng響應值與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.3.7 精密度試驗 精密吸取質量濃度為15.7 μg·mL-1的毛蕊異黃酮苷對照品溶液，按2.3.1項下條件重復進樣6次，以毛蕊異黃酮苷峰面積計，RSD為0.67%。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取益氣活血顆粒(批號：160122)，依2.3.3項下操作制備供試品溶液，按2.3.1項下條件，分別于第0、2、4、6、8、12 h進樣，測定毛蕊異黃酮苷峰面積，RSD為1.22%。

2.3.9 重復性試驗 分取6份益氣活血顆粒(批號：160122)各約0.53 g，依2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下條件測定并計算，毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量為0.689 mg·g-1，RSD為 1.30%(n=6)。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取0.26 g已知含量的益氣活血顆粒(批號：160122)，共6份，并精密加入質量濃度為31.4 μg·mL-1的毛蕊異黃酮苷對照品溶液適量，依2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下條件測定，計算，結果見表2。

表2 毛蕊異黃酮苷加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3.11 樣品含量測定 分取3批益氣活血顆粒(批號分別為160122、160123、160125)各適量，分別依2.3.3項下操作制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件測定，3批樣品中毛蕊異黃酮苷的含量分別為0.691、0.647、0.730 mg·g-1。

3 討論

益氣活血顆粒處方中含有10味藥材，成分極其復雜，不同的中藥可能含有相同的化學成分。因此，僅僅以化學物質作為對照，難以區(qū)分鑒別各個飲片，特別是對照品為其非專屬性成分時，更加難以鑒別所顯示的點是否屬于該飲片，故目前多采用對照藥材作為對照進行薄層鑒別。本文采用的薄層鑒別方法，均使用對照藥材，使定性鑒別的成分信息更加豐富、全面，增強了定性鑒別的準確性與可靠性，能較好地控制益氣活血顆粒的質量檢測。

黃芪為益氣活血顆粒方中的君藥，功能補脾養(yǎng)血、益氣生津。具有雙向調節(jié)血壓，提高心肌耐缺氧能力等功能。故本文選其代表成分進行含量測定。方法學考察表明，所采用的方法重復性好、專屬性強，為益氣活血顆粒質量標準的建立提供了重要依據(jù)，為醫(yī)院申報新制劑奠定了堅實基礎。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部 [S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 陸超，吳磊，錢芳，等.胃瘤安合劑的質量標準研究[J].中國藥房，2015，26(3)：396-399.

[3] 戴涌，喬蓉霞，羅定強.金嗓開音膠囊質量標準改進[J].西北藥學雜志，2011，26(6)：415-417.

[4] 陸超，吳磊，錢芳，等.胃瘤安合劑的質量標準研究[J].中國藥房，2015，26(3)：396-399.

[5] 陳旭，董暉，范寅根，等.痛得安散質量標準提高研究[J].解放軍藥學學報，2016，32(2)：134-137.

[6] 李爽，賈媛，范玲，等.芪葵顆粒定性定量方法研究[J].藥物分析雜志，2012，32(9)：1564-1577.

[7] 姜勇，金芳，鮑忠，等.不同來源黃芪藥材中黃芪甲苷的定量分析[J].中國中藥雜志，2006，31(11)：930-933.

[8] 吳怡，鄒佳欣，王光函，等.化胃舒顆粒供試品制備方法對其黃芪甲苷含量的影響[J].中國藥師，2014，17(1)：29-31.

[9] 劉和平，彭招華，張潤容，等.黃芪藥材中黃芪甲苷UPLC-ELSD含量測定方法的優(yōu)化[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21(5)：37-40.

[10] 李翔.黃芪藥材色譜指紋圖譜研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學，2005.

[11] 胡芳弟，趙健雄，封士蘭，等.黃芪的高效液相色譜指紋圖譜及主成分含量測定[J].中藥材，2004，27(11)：831-834.

StudyonQualityStandardofYiqihuoxueGranules

WENGYan1，2，LUChao1，CAIYunshan2，LIUZhihui1*

(1.AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210029，China；2.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210029，China)

Objective：To establish the quality standards for Yiqihuoxue Granules.MethodsAstragali Radix/Astragali Radix Praeparata Cum Melle，Schisandrae Chinensis Fructus，Moutan Cortex，Curcumae Rhizoma and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma were identified by TLC.The content of Astragaloside Ⅳ and calycosin-7-glucosidde were determined by HPLC-ELSD and HPLC-UV.ResultsFive herbs could be identified by TLC，the spots were clear and well-separated.The linear range of Astragaloside Ⅳ was 2.32-37.04 μg，the average recovery was 91.25%，RSD=2.27%(n=6).The linear range of calycosin-7-glucoside was 19.62-314 ng，the average recovery was 93.59-%，RSD=1.90%(n=6).ConclusionThe method is simple and accurate，it can be used for the quality control of Yiqihuoxue Granules.

Yiqihuoxue Granules；TLC；HPLC；Astragaloside Ⅳ；Calycosin-7-glucoside

*

劉志輝，主任中藥師，研究方向：中藥制劑研發(fā)；E-mail：liuzh1008@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.026

2017-02-20)