瑞舒伐他汀預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后E選擇素的影響

黃云達(dá)，楊 波，王洪雄，黃 偉

（大理大學(xué)第六附屬醫(yī)院，昆明 650011）

瑞舒伐他汀預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后E選擇素的影響

黃云達(dá)，楊 波，王洪雄，黃 偉*

（大理大學(xué)第六附屬醫(yī)院，昆明 650011）

目的：觀察瑞舒伐他汀預(yù)處理對(duì)SD大鼠心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中E選擇素的影響。方法：取健康的雄性SD大鼠共36只，隨機(jī)分為3組（n=12），即假手術(shù)組；缺血再灌注組：先缺血30 min，再灌注180 min；瑞舒伐他汀預(yù)處理組：給予瑞舒伐他汀10 mg∕kg，灌胃給藥1次∕d，連續(xù)3 d，于末次灌胃后，先缺血30 min，再灌注180 min。三組大鼠再灌注180 min后取缺血心肌組織，檢測(cè)缺血區(qū)心肌細(xì)胞E選擇素的表達(dá)水平。結(jié)果：瑞舒伐他汀預(yù)處理組大鼠心肌細(xì)胞E選擇素的表達(dá)水平均明顯低于缺血再灌注組（P＜0．01）。結(jié)論：瑞舒伐他汀預(yù)處理可以對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)減少大鼠心肌細(xì)胞E選擇素的表達(dá)，從而減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

瑞舒伐他??；大鼠；心肌缺血再灌注損傷；E選擇素

急性心肌梗死是心肌組織供血中斷后引起的心肌缺血性壞死，盡快恢復(fù)血供是搶救瀕臨死亡心肌的最有效方法，目前臨床上采用溶栓治療或PCI（冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)）治療實(shí)現(xiàn)再通，雖然能獲得明顯的效果，但不容忽視的是再灌注后不僅不能使器官、組織功能恢復(fù)，反而加重器官、組織的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，造成心肌更為嚴(yán)重和持久的損害。目前我國(guó)急性心肌梗死的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)〔1〕。因此，如何防治心肌梗死后的心肌缺血再灌注損傷成為近年來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)。目前已知的心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞凋亡、氧自由基生成增加、能量代謝障礙、鈣超載等等，其中炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用〔2〕。近年來(lái)大量臨床及動(dòng)物試驗(yàn)均證實(shí)他汀類藥物不僅可以降低血脂，減少心血管事件的發(fā)生率，并且具有調(diào)脂以外的心肌保護(hù)作用。大量研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物的非降脂心肌保護(hù)作用主要包括減輕血管內(nèi)皮損傷、抗炎、抑制心肌凋亡、清除氧自由基、抗氧化作用、逆轉(zhuǎn)心肌肥大等〔3〕。他汀類藥物的這些保護(hù)作用對(duì)于治療心肌缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義，尤其對(duì)急性心肌梗死（AMI）、急性冠脈綜合征（ACS）、冠脈血管重建術(shù)后存在心肌缺血再灌注損傷的患者更應(yīng)盡早應(yīng)用，減少冠脈事件再發(fā)生率及死亡率〔4〕。

前期研究已證實(shí)，瑞舒伐他汀預(yù)處理具有心肌保護(hù)作用，如心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)〔5-6〕，本研究立足于瑞舒伐他汀的抗炎作用。目前E選擇素在心血管疾病中的作用已成為臨床研究熱點(diǎn)之一。E選擇素水平的表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化等許多炎癥情況的表達(dá)有關(guān)，目前認(rèn)為E選擇素水平的變化反映了細(xì)胞表面成分的翻轉(zhuǎn)及蛋白質(zhì)的水解，可作為疾病活動(dòng)的標(biāo)志〔7〕。故研究E選擇素在心肌缺血再灌注損傷中是否表達(dá)，從而闡述心肌缺血再灌注損傷中炎癥發(fā)生的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1．1大鼠灌胃給藥SD雄性大鼠購(gòu)買(mǎi)自昆明醫(yī)科大學(xué)（合格證號(hào)：SCXK（滇）2005-0009），體重介于120～200 g，共36只，將其隨機(jī)分配為3組，每組12只，分別是：假手術(shù)組，缺血再灌注組，瑞舒伐他汀預(yù)處理組。假手術(shù)組及缺血再灌注組每只大鼠分別按20 mL∕kg給予生理鹽水灌胃；瑞舒伐他汀預(yù)處理組按10 mg∕kg灌胃給藥；連續(xù)給藥3 d后進(jìn)行缺血再灌注損傷模型構(gòu)建。

1．2大鼠心肌缺血再灌注模型的構(gòu)建按體重3 mL∕kg以100 g∕L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，并將其固定于仰臥位，與心電圖機(jī)連接（心電圖機(jī)為昆明醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室提供），記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中心電圖的變化。剔除心前區(qū)體毛后進(jìn)行常規(guī)消毒，經(jīng)左側(cè)第4肋間切口逐層分離皮下組織、開(kāi)放胸腔暴露心臟。找到左冠狀動(dòng)脈，于左心耳下緣1 mm處以6-0無(wú)菌線完全結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，心電圖上顯示ST段明顯弓背向上抬高（≥0．2 mV），表示結(jié)扎成功，缺血30 min后，松解結(jié)扎線進(jìn)行再灌注180 min。假手術(shù)組只分離埋線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，其余同手術(shù)組。

1．3缺血區(qū)心肌組織的確定再灌注180 min經(jīng)腔靜脈注入1%Evans blue液3 mL進(jìn)行左室心肌染色后，處死大鼠，迅速取出心臟，以磷酸緩沖液（PBS，pH 7．4）沖洗，用濾紙吸干表面水分，置于-20℃冰箱中快速冷卻30 min后，將心臟剪去心耳和右心室，切成2 mm厚的薄片，于1%TTC溶液中37℃溫孵15 min，所得心肌組織切片藍(lán)色部分為非缺血區(qū)，磚紅色部分為缺血未梗死區(qū)，灰白色部分為梗死區(qū)。

1．4 E選擇素（E-selectin）的含量檢測(cè)E選擇素ELSIA試劑盒購(gòu)于武漢華美生物科技公司。取出試劑盒，室溫（18～25℃）下放置至少30 min，按照說(shuō)明書(shū)配制好所需試劑備用。將缺血區(qū)心肌組織勻漿，加樣：取出96孔板，根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量選擇所需的板條數(shù)，冷藏處理剩余板條。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔（7個(gè)濃度）、待測(cè)樣品孔和空白對(duì)照孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL輕輕晃動(dòng)混勻，空白對(duì)照孔加入100 μL的蒸餾水，覆上板貼，置于37℃溫育2 h；棄去液體，甩干，洗滌3次；每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，貼上新的板貼，置于37℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，300 μL∕孔，甩干；每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，貼上新的板貼，置于37℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，300 μL∕孔，甩干。顯色：依序每孔加底物溶液90 μL，37℃避光顯色15～30 min（為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后盡快加入終止液。在加入底物溶液后每隔一段時(shí)間觀察一下顯色情況以控制反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)肉眼見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品前3～4孔有明顯梯度藍(lán)色，后3～4孔不明顯時(shí)，加入終止液終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立刻變成黃色）。終止：依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。讀板：在反應(yīng)終止后盡快（5 min內(nèi)）用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16．0及Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1大鼠心肌組織肉眼見(jiàn)結(jié)果經(jīng)TTC和Evans blue染色后所得心肌組織切片，藍(lán)色部分為非缺血區(qū)，磚紅色部分為缺血未梗死區(qū)，灰白色部分為梗死區(qū)。肉眼所見(jiàn)缺血再灌注組及瑞舒伐他汀預(yù)處理組缺血梗死區(qū)面積大于假手術(shù)組，而瑞舒伐他汀預(yù)處理組缺血未梗死區(qū)面積大于缺血再灌注組。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心肌組織肉眼切面圖

2．2 E選擇素（E-selectin）的含量檢測(cè)結(jié)果通過(guò)ELSIA法檢測(cè)不同組中大鼠心肌組織中E選擇素的含量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)OD值函數(shù)關(guān)系見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析的One way-ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，瑞舒伐他汀預(yù)處理組和缺血再灌注組缺血區(qū)心肌細(xì)胞E選擇素的表達(dá)水平均高于假手術(shù)組（P＜0．01），但瑞舒伐他汀預(yù)處理組大鼠心肌細(xì)胞E選擇素的表達(dá)水平均明顯低于缺血再灌注組（P＜0．01）。見(jiàn)表1。

圖2 大鼠心肌組織E選擇素濃度與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所得OD值的函數(shù)關(guān)系

表1 瑞舒伐他汀預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞E選擇素的影響

表1 瑞舒伐他汀預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞E選擇素的影響

注：與假手術(shù)組相比*P＜0．001，**P＜0．01；與缺血再灌注組相比#P＜0．01。

E選擇素∕（pg∕mL）975．3±130．2 2 232．7±251．2*1 306．5±314．6**#組別假手術(shù)組缺血再灌注組瑞舒伐他汀預(yù)處理組數(shù)量∕只12 12 12

3 討論

急性心肌梗死發(fā)生后，通過(guò)溶栓等療法早期恢復(fù)缺血部位的血供能夠挽救缺血的心肌細(xì)胞、防止梗死范圍的擴(kuò)大。但是復(fù)灌會(huì)造成心肌細(xì)胞損傷加重的現(xiàn)象〔8〕。目前已經(jīng)證實(shí)多種中西藥具有減輕缺血再灌注損傷的療效，其中，他汀類藥物的療效尤為突出〔9-10〕。瑞舒伐他汀（rosuvastatin，RSV）是一種選擇性3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA）還原酶抑制劑，是目前最新研發(fā)的水溶性他汀，有穩(wěn)定斑塊的作用，在臨床上主要用于高脂血癥及冠心病的二級(jí)預(yù)防治療〔11〕。目前已有大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)瑞舒伐他汀與其他他汀類藥物一樣對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用〔12-15〕。其保護(hù)作用得益于改善內(nèi)皮功能、抗炎、抗凋亡及抗氧化機(jī)制。

本研究立足于他汀的保護(hù)血管內(nèi)皮功能及抗炎作用。炎癥的中心環(huán)節(jié)是由選擇素調(diào)節(jié)的中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附，主要是中性粒細(xì)胞沿著血管內(nèi)皮細(xì)胞的滾動(dòng)。E選擇素于1985年被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，1989年其基因被克隆〔16〕。E選擇素曾被稱為“內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子”，現(xiàn)已被統(tǒng)一命名為E選擇素或CD62E。E選擇素是誘導(dǎo)性黏附分子，介導(dǎo)白細(xì)胞在組織損傷和炎癥區(qū)域的滾動(dòng)，參與主要的炎性反應(yīng)，脂多糖、IL-1（白細(xì)胞介素-1）、TNF-α（腫瘤壞死因子α）均可刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成E選擇素。E選擇素是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)志，它在白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的過(guò)程中起重要作用，只在細(xì)胞因子激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，主要介導(dǎo)白細(xì)胞與血管壁黏附的首發(fā)階段〔17〕。目前E選擇素在心血管疾病中的作用成為臨床研究熱點(diǎn)之一。E選擇素水平的表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化等許多炎癥情況的表達(dá)有關(guān)，目前認(rèn)為E選擇素水平的變化反映了細(xì)胞表面成分的翻轉(zhuǎn)及蛋白質(zhì)的水解，可作為疾病活動(dòng)的標(biāo)志〔7〕。故研究E選擇素在心肌缺血再灌注損傷中是否表達(dá)，從而闡述心肌缺血再灌注損傷中炎癥發(fā)生的可能機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：瑞舒伐他汀預(yù)處理組和缺血再灌注組缺血區(qū)心肌細(xì)胞E選擇素的表達(dá)水平均高于假手術(shù)組（P＜0．01），但瑞舒伐他汀預(yù)處理組大鼠心肌細(xì)胞E選擇素的表達(dá)水平均明顯低于缺血再灌注組（P＜0．01）。

他汀類藥物的多效性作用使其應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大，包括減少心肌缺血再灌注損傷，其中負(fù)荷量給藥及藥物親水性差異是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵〔18-21〕。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌炎癥因子E選擇素的變化來(lái)闡明缺血后處理的保護(hù)機(jī)制與減輕炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到該方面的研究。瑞舒伐他汀預(yù)處理能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，這種作用可能與其降低再灌注心肌炎性細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)，而不依賴于其降脂作用，為瑞舒伐他汀預(yù)處理的臨床應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。

〔1〕陳飛，喻金彥，印媛君．急性心肌梗死的流行病學(xué)及危險(xiǎn)因素研究進(jìn)展〔J〕．浙江臨床醫(yī)學(xué)，2016，18（10）：1954-1956．

〔2〕HU X，F(xiàn)U W，JIANG H．HMGB1：a potential therapeutic target for myocardial ischemia and reperfusion injury〔J〕．Int J Cardiol，2012，155（3）：489．

〔3〕朱喬燕，王光宇，張慶勇．他汀類藥物非調(diào)脂作用在改善心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)與功能方面的研究進(jìn)展〔J〕．醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（17）：3424-3427．

〔4〕張占修．急性冠脈綜合征強(qiáng)化他汀治療進(jìn)展〔J〕．中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志（電子版），2016，4（9）：1-3．

〔5〕KE D，F(xiàn)ANG J，F(xiàn)AN L，et al．ReguLatory T cells contribute to rosuvastatin-induced cardioprotection against ischemiareperfusion injury〔J〕．Coron Artery Dis，2013，24（4）：334-341．

〔6〕BURMA O，ONAT E，UYSAL A，et al．Effects of rosuvastatin on ADMA，rhokinase，NADPH oxidase，caveolin-1，hsp 90 and NFkB levels in a rat model of myocardial ischaemia-reperfusion：cardiovascuLar topic〔J〕．Cardiovascular Journal of Africa，2014，25（5）：212-216．

〔7〕孫艷娜，林春旺，鄧明紅．心肌損傷患兒E-選擇素、白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子-α檢測(cè)的臨床價(jià)值〔J〕．國(guó)際兒科學(xué)雜志，2015，42（3）：328-330．

〔8〕吳曉燕，苗琳，鄭蕊，等．心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展〔J〕．中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2016，32（11）：1043-1045．

〔9〕BALAKUMAR P，KATHURIA S，TANEJA G，et al．Is targeting eNOS a key mechanistic insight of cardiovascuLar defensive potentials of statins〔J〕．J Mol Cell Cardiol，2012，52（1）：83-92．

〔10〕鄭仙福，劉文捷．冠心病PCI術(shù)后心肌缺血再灌注損傷的中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制及防治〔J〕．內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2012，31（5）：112-114．

〔11〕DOSTáLOVá G，BěLOHLáVEK J，VíTEK L，et al．Acute myocardial infarction in young patients--severe failures in the system of acute and secondary care〔J〕．Vnitr Lek，2012，58（10）：721-729．

〔12〕王凌，林榮，潘國(guó)焰，等．單次負(fù)荷劑量瑞舒伐他汀預(yù)處理對(duì)再灌注損傷挽救激酶信號(hào)通路的影響和心肌保護(hù)〔J〕．中國(guó)老年學(xué)雜志，2014，34（24）：6996-6999．

〔13〕陳福恒，陳還珍．瑞舒伐他汀不同給藥時(shí)間對(duì)兔心肌缺血-再灌注損傷內(nèi)皮功能影響的對(duì)比研究〔J〕．中國(guó)醫(yī)療前沿，2011，6（15）：14-15．

〔14〕周煒，陳玲，陳曼華．瑞舒伐他汀對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后細(xì)胞凋亡及線粒體融合素2表達(dá)的影響〔J〕．廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（16）：2514-2516．

〔15〕胡晶晶，陳小云，周偉，等．瑞舒伐他汀后處理通過(guò)抑制高遷移率族蛋白表達(dá)減輕心肌缺血再灌注損傷的研究〔J〕．貴州醫(yī)藥，2016，40（8）：798-800．

〔16〕胡龍才，張衛(wèi)，李偉龍，等．E-選擇素S128R基因多態(tài)性與中國(guó)人群冠心病發(fā)病相關(guān)性的Meta分析〔J〕．中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2016，8（1）：23-25．

〔17〕鄭煜凱，周明根，鄒子俊，等．血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)TLR9激活與ICAM-1、E-選擇素表達(dá)的研究〔J〕．嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志，2016，21（5）：441-443．

〔18〕王瑩，趙曉輝，楊軍．阿托伐他汀在心肌缺血再灌注損傷治療中的作用機(jī)制及其研究進(jìn)展〔J〕．中國(guó)醫(yī)藥，2015，10（5）：751-753．

〔19〕侯倩，王園園，趙志芳，等．負(fù)荷劑量氟伐他汀對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用：模擬缺血預(yù)適應(yīng)〔J〕．中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，2014，22（11）：714-718．

〔20〕ANDREADOU I，F(xiàn)ARMAKIS D，PROKOVAS E，et al．Short-term statin administration in hypercholesterolaemic rabbits resistant to postconditioning：effects on infarct size，endothelial nitric oxide synthase，and nitro-oxidative stress〔J〕．Cardiovasc Res，2012，94（3）：501-509．

〔21〕POST S，POST M C，VAN DEN BRANDEN B J，et al．Early statin treatment prior to primary PCI for acute myocardial infarction：REPERATOR，a randomized placebo-controlled pilot trial〔J〕．Catheter Cardiovasc Interv，2012，80（5）：756-765．

（責(zé)任編輯 李 楊）

Effects of Rosuvastatin Pretreatment on E Selectin after Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Rat

Huang Yunda,Yang Bo,Wang Hongxiong,Huang Wei*
（The Sixth Affiliated Hospital of Dali University,Kunming 650011,China）

Objective：To observe the effects of rosuvastatin on the expression of E selection in treating myocardial ischemiareperfusion injury in SD rats．Methods:36 male healthy SD rats were randomly divided into 3 groups（n=12）,including the sham operation group,the ischemia reperfusion group with 30 min of ischemia and 180 minutes of reperfusion,and the minand rosuvastatin pretreatment group which was given rosuvastatin 10 mg∕kg,fasting lavage once-daily for 3 consecutive days and reperfusion of 180 min after the final lavage before 30 min of ischemia．After 180-min reperfusion in the 3 groups the myocardial tissue of ischemic zone was taken to detect the expression level of E selection in ischemic myocardium．Results：The expression level of E selection in the myocardial cells of rosuvastatin pretreatment group was significantly lower than that of ischemia reperfusion group（P＜0．01）．Conclusion：Rosuvastatin preconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in rats has a protective effect;the mechanisms may be related to the fact that the infiltration of inflammatory cells decreases as the myocardial cells of rats with E selection expression reduce．

rosuvastatin calcium tablets;rats;myocardial ischemia reperfusion injury;E selection

R654．2

A

2096-2266（2017）10-0029-04

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．007

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013FD094）

2017-04-19

2017-05-06

黃云達(dá)，住院醫(yī)師，主要從事心血管疾病的診治研究．*通信作者：黃偉，主任醫(yī)師．