紅花蜂花粉多糖提取工藝的研究

李 月，王 昀，羅永會(huì)，陳貴元，左紹遠(yuǎn)，2*

（1．大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2．云南省昆蟲(chóng)醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

紅花蜂花粉多糖提取工藝的研究

李 月1，王 昀1，羅永會(huì)1，陳貴元1，左紹遠(yuǎn)1，2*

（1．大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2．云南省昆蟲(chóng)醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

目的：研究紅花蜂花粉多糖的最佳分離提取工藝。方法：以多糖提取率為考察指標(biāo)，用水提醇沉法和微波提取法分離提取紅花蜂花粉多糖。通過(guò)單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)，比較兩種方法對(duì)多糖得率的影響。結(jié)果：工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微波提取法最佳提取工藝為料液比1：18 g∕mL、功率500 W、時(shí)間7 min，多糖提取率為34．60%；水提醇沉法最佳提取工藝為：料液比1：18 g∕mL、時(shí)間10 h、溫度80℃、提取次數(shù)4次，多糖提取率為38．00%。結(jié)論：水提醇沉法比微波提取法的多糖得率高，工藝路線穩(wěn)定可行，可作為紅花蜂花粉多糖分離提取的最佳工藝路線。

紅花蜂花粉多糖；正交試驗(yàn)；工藝優(yōu)化；水提醇沉法；微波提取法

紅花（Carthamus tinctorius L．）為菊科紅花屬草本植物，味辛、性溫，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛等功效，是一種傳統(tǒng)中藥〔1-2〕。蜂花粉（bee pollen）是蜜蜂從蜜源植物花蕊內(nèi)采集的花粉粒，并加入了特殊的腺體分泌物（花蜜和唾液）混合而成的一種不規(guī)則扁圓形或淡黃色團(tuán)狀物，為傳統(tǒng)天然營(yíng)養(yǎng)食品。含有多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有多種生物學(xué)活性和藥理作用〔3〕。研究表明，不同來(lái)源的蜂花粉多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性〔4-8〕。

目前有關(guān)其他蜂花粉來(lái)源的多糖研究較多，但紅花蜂花粉多糖的研究少見(jiàn)報(bào)道〔9〕。為綜合開(kāi)發(fā)利用云南豐富的紅花蜂花粉資源，本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法對(duì)其提取工藝路線進(jìn)行研究，以期探索出最佳提取工藝路線，從而為紅花蜂花粉多糖的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

破壁紅花蜂花粉，購(gòu)于云南滇峰蜂業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品（批號(hào)：20140712），為黃色粉末狀；D-無(wú)水葡萄糖（含量≥99%，批號(hào)：110833-201506，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；水為去離子水；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：FST-Ⅲ-20普力菲爾超純水機(jī)（上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）；SHA-C恒溫水浴箱（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；AG135電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞?wèn)|生化儀器廠）；FD-1型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司）；722E可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；LD4-2A低速離心機(jī)（北京市醫(yī)用離心機(jī)廠）；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵（上海青浦滬西儀器廠）；PD70D20P-TD（W0）格蘭仕微波爐（輸出功率700 W，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司）。

2 方法

2．1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0．1 g于100 mL的容量瓶中，加水定容。取10 mL于另一100 mL容量瓶中，加水定容，得100 μg∕mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液〔10〕。取干燥試管10支，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0．05、0．10、0．20、0．30、0．40、0．50、0．60、0．70、0．80、0．90 mL，各管加水補(bǔ)至2 mL，迅速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6．0%苯酚溶液1．0 mL及濃硫酸5．0 mL，搖勻，室溫靜置30 min。另取水2．0 mL同法操作，加入6．0% 苯酚溶液1．0 mL和濃硫酸5．0 mL，此為空白對(duì)照管，在490 nm處測(cè)吸光度值（A），以A為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0．016 07C-0．013 97（r=0．999 82），顯示在 2．5～45．0 μg∕mL 的葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2．2紅花蜂花粉多糖提取率的測(cè)定水提后，離心取上清液，定容至250 mL，取50 μL，稀釋至2 mL，用苯酚-硫酸比色法測(cè)定吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，得其多糖的含量。紅花蜂花粉多糖的提取率按下式計(jì)算。

紅花蜂花粉多糖提取率=［（多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)×2×體積倍數(shù)）∕紅花蜂花粉質(zhì)量］×100%

2．3紅花蜂花粉多糖提取工藝流程紅花蜂花粉→萃取回流（2倍體積石油醚，無(wú)水乙醇脫脂2次，每次2 h）→水提、離心→減壓濃縮、醇沉→離心、沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→冷凍干燥→紅花蜂花粉多糖粗品（本實(shí)驗(yàn)中著重考察水提過(guò)程中的相關(guān)因素）。

2．4水提醇沉法單因素實(shí)驗(yàn)

2．4．1 料液比對(duì)紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉7份，在提取時(shí)間8 h，提取次數(shù)1次，提取溫度75℃條件下，考查不同料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15、1：18、1：21 g∕mL）對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．2 提取時(shí)間對(duì)紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉6份，在料液比1：18 g∕mL，提取次數(shù)1次，提取溫度75℃條件下，考查不同提取時(shí)間（4、6、8、10、12、14 h）對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．3 提取溫度對(duì)紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉6份，在料液比1：18 g∕mL，提取次數(shù)1次，提取時(shí)間10 h條件下，考查不同提取溫度（60、65、70、75、80、85 ℃）對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．4 提取次數(shù)對(duì)紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉5份，在料液比1：18 g∕mL，提取溫度80℃，提取時(shí)間10 h條件下，考查不同提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．4．5 水提醇沉法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以紅花蜂花粉多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定L9（34）4因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最優(yōu)紅花蜂花粉多糖提取工藝參數(shù)。見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

2．5微波法單因素實(shí)驗(yàn)

2．5．1 料液比對(duì)紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉7份，在提取時(shí)間3 min，提取功率400 W條件下，考查不同料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15、1：18、1：21 g∕mL）對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響〔11〕。

2．5．2 提取功率對(duì)紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉5份，在提取時(shí)間3 min，料液比1：21 g∕mL條件下，考查不同提取功率（300、400、500、600、700 W）對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．5．3 提取時(shí)間對(duì)紅花蜂花粉多糖得率的影響 稱取等量（1．0 g）紅花蜂花粉6份，在料液比1：21 g∕mL，提取功率500 W條件下，考查不同提取時(shí)間（2、3、4、5、6、7 min）對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響。

2．5．4 微波法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以紅花蜂花粉多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定L9（33）3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最優(yōu)紅花蜂花粉多糖提取工藝參數(shù)。見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平

2．6統(tǒng)計(jì)分析以紅花蜂花粉多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，同等條件下每組實(shí)驗(yàn)平行3次，以降低實(shí)驗(yàn)中所出現(xiàn)的誤差，采用SPSS 21．0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以優(yōu)選出紅花蜂花粉多糖的最佳提取工藝。

3 結(jié)果與結(jié)論

3．1水提醇沉法單因素試驗(yàn)結(jié)果

3．1．1 料液比對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響料液比在1：（3～18）g∕mL之間，紅花蜂花粉多糖的提取率逐漸增加，料液比1：18 g∕mL時(shí)提取率達(dá)到最大值；當(dāng)水量繼續(xù)增加后提取率呈下降的趨勢(shì)。其原因可能為料液比較小時(shí)，隨提取液的增加有利于紅花蜂花粉多糖的溶出；但料液比超過(guò)1：18 g∕mL時(shí)，紅花蜂花粉多糖提取率趨于平穩(wěn)，基本不再增加。所以最佳料液比為1：18 g∕mL。見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

3．1．2 提取時(shí)間對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)紅花蜂花粉多糖的提取率也相應(yīng)增加，當(dāng)提取時(shí)間為12 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值；提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，提取率呈下降趨勢(shì)。其原因可能為在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間的增加，紅花蜂花粉多糖的溶出逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間為12 h時(shí)，樣品中的紅花蜂花粉多糖已基本全部溶出，而后隨提取時(shí)間的繼續(xù)增加，紅花蜂花粉多糖的提取率趨于平穩(wěn)。提取時(shí)間10 h與12 h、12 h與14 h相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（n=4），對(duì)提取率無(wú)明顯差異，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本增加，因此綜合考慮，選擇10 h較為經(jīng)濟(jì)可行。見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

3．1．3 提取溫度對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響在60～80℃之間，紅花蜂花粉多糖的提取率隨溫度的升高而大幅升高，當(dāng)提取溫度達(dá)到80℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值；當(dāng)提取溫度進(jìn)一步升高時(shí)，提取率明顯下降。其原因可能為溫度較低時(shí)，紅花蜂花粉中多糖與其他物質(zhì)結(jié)合緊密，使得紅花蜂花粉多糖不易溶出，因而提取率偏低；當(dāng)提取溫度超過(guò)80℃時(shí)，會(huì)導(dǎo)致紅花蜂花粉多糖部分水解，從而影響紅花蜂花粉多糖的提取率。所以最適提取溫度為80℃。見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

3．1．4 提取次數(shù)紅花蜂花粉多糖提取率的影響隨提取次數(shù)的增加紅花蜂花粉多糖的提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取次數(shù)5次時(shí)，提取率達(dá)到最大值。其原因可能為次數(shù)較少時(shí)，紅花蜂花粉多糖僅部分溶出，因而紅花蜂花粉多糖提取率偏低；當(dāng)次數(shù)增加到5次時(shí)，紅花蜂花粉多糖已基本全部溶出，紅花蜂花粉多糖的提取率也趨于平穩(wěn)。提取次數(shù)3次與4次、4次與5次之間，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（n=4），提取率無(wú)明顯差異，提取次數(shù)增加，使后續(xù)減壓濃縮、醇沉等工藝的成本增加，所以最佳提取次數(shù)為4次。見(jiàn)圖4。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

3．2水提醇沉法正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析據(jù)表3中的R值可以得出，各因素對(duì)多糖提取率的影響程度依次為料液比（A）＞提取次數(shù)（D）＞提取溫度（C）＞提取時(shí)間（B）。由表4的方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)提取率的影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001），各因素對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響順序與極差分析結(jié)果相吻合。紅花蜂花粉多糖水提醇沉法最優(yōu)工藝為A1B3C2D3，即料液比1：15 g∕mL、提取時(shí)間12 h、提取溫度80℃、提取次數(shù)4次。見(jiàn)表3～4。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

3．3微波法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3．3．1 料液比對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響紅花蜂花粉多糖的提取率隨料液比的增大而增加，料液比1：21 g∕mL時(shí)提取率達(dá)到最大值。其原因可能為料液比較小時(shí)，隨提取液的增加有利于紅花蜂花粉多糖的溶出；料液比1：21 g∕mL時(shí)，紅花蜂花粉多糖提取率趨于平穩(wěn)，基本不再增加。所以最佳料液比為1：21 g∕mL。見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)多糖提取率的影響

3．3．2 提取功率對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響在功率300～500 W之間，紅花蜂花粉多糖提取率隨功率的增大而增加，功率為500 W時(shí)提取率達(dá)到最大值；當(dāng)功率繼續(xù)增大時(shí)，提取率反而下降。其原因可能為功率較低時(shí)，紅花蜂花粉多糖不易溶出，因而提取率偏低；當(dāng)提取功率超過(guò)500 W時(shí)，會(huì)導(dǎo)致紅花蜂花粉多糖部分水解，從而影響紅花蜂花粉多糖的提取率。所以最佳功率為500 W。見(jiàn)圖6。

圖6 提取功率對(duì)多糖提取率的影響

3．3．3 提取時(shí)間對(duì)紅花蜂花粉多糖提取率的影響紅花蜂花粉多糖提取率隨時(shí)間的增加而增加，在7 min時(shí)達(dá)到最大值。其原因可能為隨提取時(shí)間的增加，紅花蜂花粉多糖的溶出逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間為7 min時(shí)，樣品中的紅花蜂花粉多糖已基本全部溶出，紅花蜂花粉多糖的提取率趨于平穩(wěn)。所以最佳時(shí)間為7 min。見(jiàn)圖7。

圖7 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3．4微波法正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析根據(jù)表5中的R值可以得出，各因素對(duì)多糖提取率的影響程度依次為料液比（A）＞提取時(shí)間（B）＞提取功率（C）。由表6的方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)多糖提取率的影響差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），各因素對(duì)多糖提取率的影響順序與極差分析結(jié)果相吻合。紅花蜂花粉多糖微波法最優(yōu)工藝為 A2B3C2，即料液比 1：18 g∕mL、提取時(shí)間7 min、提取功率500 W。見(jiàn)表5～6。

3．5提取工藝驗(yàn)證選取3種方案進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，即微波提取法正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝A2B3C2，水提醇沉法單因素試驗(yàn)組合：料液比1：18 g∕mL、時(shí)間10 h、溫度80℃、提取次數(shù)4次，水提醇沉法正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝A1B3C2D3。結(jié)果微波提取法正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝A2B3C2多糖平均提取率為34．60%（n=3，RSD=0．33%），水提醇沉法單因素試驗(yàn)組合：料液比1：18 g∕mL、時(shí)間10 h、溫度80℃、提取次數(shù)4次的多糖平均提取率為38．00%（n=3，RSD=0．15%），水提醇沉法正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝A1B3C2D3多糖平均提取率為37．83%（n=3，RSD=0．45%）。3種方案工藝穩(wěn)定可行。其中水提醇沉法單因素試驗(yàn)組合的多糖提取率最高。

表5 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

4 討論

由工藝驗(yàn)證結(jié)果可知，水提醇沉法的多糖得率高，比微波提取法高3．4%，因此選擇水提醇沉法。同時(shí)又比較水提醇沉法的兩種方法，即：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)組合和正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝，雖然兩種工藝的多糖提取率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），但是單因素試驗(yàn)組合的料液比為1：18 g∕mL、時(shí)間為10 h，比正交試驗(yàn)最優(yōu)工藝省時(shí)且提取更完全。因此綜合考慮水提醇沉法最佳提取工藝為單因素試驗(yàn)組合，即：料液比1：18 g∕mL、時(shí)間10 h、溫度80 ℃、提取次數(shù)4次，多糖平均提取率為38．00%。該提取方法更利于紅花蜂花粉多糖的提取，為其后續(xù)研究提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

〔1〕江蘇醫(yī)學(xué)院．中藥大辭典：上冊(cè)〔M〕．上海：科學(xué)技術(shù)出版社，1986．

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〔11〕楊申明，王振吉，李艷婷．微波法提取金雀花多糖工藝研究〔J〕．食品工業(yè)，2015（4）：136-140．

（責(zé)任編輯 李 楊）

Comparative Research on the two Extraction Processes of Polysaccharides from Bee Pollen of Carthamus tinctorius

Li Yue1,Wang Yun1,Luo Yonghui1,Chen Guiyuan1,Zuo Shaoyuan1,2*
（1．Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2．Key Laboratory of Pharmaceutical Ramp;D of Insects in Yunnan Province,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To study the best extracting technique of polysaccharides from bee pollen of Carthamus tinctorius．Methods:Taking the yield of polysaccharide as indicator,the polysaccharide of bee pollen of Carthamus tinctorius L was isolated by water extracting-alcohol precipitating method and microwave power method．Then by the use of orthogonal experiment and single factor test,the results of the two methods on the extraction yields of polysaccharides were compared．Results:The results of verification tests showed that the best extraction technology of microwave power method was 1∶18 g∕mL for the ratio of material to liquid,500 watts for microwave power and 7 min for extraction time．Under these process conditions,the yield of polysaccharide was 34．60%．And the best conditions of water extracting-alcohol precipitating method was 1∶18 g∕mL for the ratio of material to liquid,80 ℃ for extracting temperature,10 h for time and 4 times for extraction．The yield of polysaccharide was 38．00% ．Conclusion:The yield of polysaccharide of water extracting-alcohol precipitating method is better than the microwave power method．It is stable and feasible to use this method as the best extraction process of polysaccharides from bee pollen of Carthamus tinctorius．

polysaccharides from bee pollen of carthamus tinctorius;orthogonal experiment;extracting technology;extractingalcohol precipitating;microwave power

R284．2

A

2096-2266（2017）10-0024-05

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．006

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31460231）；云南省科技廳高新科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（GX10-2004）；云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（2014-10）

2016-12-06

2017-08-13

李月，碩士研究生，主要從事多糖的分離純化與生物學(xué)活性研究．*通信作者：左紹遠(yuǎn)，教授．