引藥米酒對瓜蔞薤白中3，29-DK在人工胃液中降解影響的研究

鄢海燕，賈文茜，鄒純才

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

引藥米酒對瓜蔞薤白中3，29-DK在人工胃液中降解影響的研究

鄢海燕，賈文茜，鄒純才

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

目的：研究米酒對瓜蔞薤白中3，29-二苯甲?；闃侨嗜迹ㄒ韵潞喎Q3，29-DK）在人工胃液中降解程度的影響。方法：使用HPLC-SPD技術(shù)，分析人工胃液中瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液的3，29-DK 1、2、3、4 h的降解率。結(jié)果：與瓜蔞薤白水溶液相比，瓜蔞薤白米酒溶液中3，29-DK在人工胃液中各時間點的降解率明顯降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。以水和米酒分別作為溶媒時，其降解率的AUC0-t（mg·min·L）值為（140．84±3．65）和（78．17±5．83）（xˉ±s，n=3），二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論：引藥米酒可抑制3，29-DK在人工胃液中的降解。

引藥米酒；瓜蔞薤白白酒湯；3，29-二苯甲?；闃侨嗜?；人工胃液；降解

古方中記載的瓜蔞薤白白酒湯，是現(xiàn)代臨床治療胸痹癥的經(jīng)典方劑〔1-4〕。在該方劑中，瓜蔞為君藥，薤白為臣藥，白酒（即為現(xiàn)代的米酒）為引藥，有溫通上行之功效〔5〕。在《中國藥典》（2015年版）中，3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇（以下簡稱3，29-DK）被用作瓜蔞子的定量評價指標(biāo)〔6〕。為深入研究米酒對瓜蔞薤白中3，29-DK在人工胃液中降解程度的影響，本實驗制備了瓜蔞薤白60%乙醇提取物的水溶液和米酒溶液（簡稱瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液），使用HPLC-SPD（High performance liquid chromatography-serial presence detect）技術(shù)，研究引藥米酒對3，29-DK在人工胃液中降解的影響，以期為深入全面的探究瓜蔞薤白白酒湯的配伍機(jī)制，特別是引藥米酒對該方劑的影響提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1．1儀器FA2004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；島津LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；pHS-3C型酸度計（上海皓莊儀器有限公司）；KYC-100C空氣恒溫?fù)u床（上海滬粵明

科學(xué)儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；JW-2017H高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）。

1．2材料瓜蔞、薤白（河北安國市御顏坊中藥材有限公司，批號：20160801），經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)包淑云副教授鑒定，瓜蔞為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim．的干燥成熟果實，薤白為百合科植物小根蒜Allium macrostemon Bge．的干燥鱗莖；3，29-DK（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量≥98%，批號：20141110）；白糯米酒（寧波佳釀有限公司，批號：20141210）；Pepsin（生化試劑，南京奧多福尼生物科技有限公司，批號：20160515）；甲醇（色譜純，永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司，批號：20160511），娃哈哈純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號：20160304），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1溶液制備

2．1．1 3，29-DK對照品溶液 取經(jīng)硅膠干燥至恒重的對照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，以甲醇為溶劑，配制質(zhì)量濃度為0．10 mg∕mL的3，29-DK對照品溶液，備用。

2．1．2 瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液的制備 取經(jīng)50℃干燥24 h的瓜蔞、薤白適量，粉碎成粗粉，精密稱定并按1．5：1比例均勻混合后，加10倍量60%乙醇，回流提取1 h，重復(fù)操作3次，將所得濾液均分成2份，回收溶劑后，再分別用水和米酒定容成每1 mL含瓜蔞薤白混合藥材0．5 g藥液，得瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液。

2．2人工胃液（以下簡稱胃液）的制備稱取胃蛋白酶10 g，加以80倍量蒸餾水，取稀鹽酸（取濃鹽酸23．4 mL，加蒸餾水定容至100 mL，得9．5%～10．5%稀鹽酸）16．4 mL，混勻，加水定容至1 000 mL，搖勻〔7〕。

2．3瓜蔞薤白水溶液中3，29-DK在胃液中的降解精密量取瓜蔞薤白水溶液20．00 mL、胃液80．00 mL，混合均勻，分別精密量取4．00 mL混合液于15個50 mL尖底離心管中（5個時間點，每個時間點平行試驗3次），恒溫?fù)u床（150 r∕min，37℃）培養(yǎng)，在0、1、2、3、4 h分別取出，立即用0．5 mol∕L NaOH溶液停止反應(yīng)，并用 0．5 mol∕L NaOH 溶液調(diào) pH 至 7．0，再加24 mL甲醇超聲20 min，沉蛋白，5 000 r∕min高速離心，20 min后取上清液，揮干甲醇。所得殘渣以二氯甲烷萃取3次，每次加入二氯甲烷8 mL，渦旋20 s，3 500 r∕min離心，5 min后取出下層萃取液，合并3次萃取液，揮干。所得殘渣用200 μL甲醇復(fù)溶，取上清液，備用。

2．4瓜蔞薤白米酒溶液中3，29-DK在胃液中的降解精密量取瓜蔞薤白米酒溶液20．00 mL、胃液 80．00 mL，混合均勻，照“2．3”方法，自“分別精密量取4．00 mL混合液”起操作，備用。

2．5色譜條件色譜柱：AgelaTechnologiesInnoval-C18（5μm，250mm×4．6mm）。等度洗脫，流速為1．0mL∕min，流動相為甲醇：水（90：10）。SPD-20AV紫外檢測器，檢測波長為231 nm。CTO-20A柱溫箱，柱溫為25℃。SIL-20AC自動進(jìn)樣器，進(jìn)樣量為20 μL。

2．6統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 11．5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2．7標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精確量取“2．1．1”中對照品溶液，分別稀釋成2．0，4．0，8．0，16．0，32．0，64．0 μg∕mL，按“2．5”HPLC條件，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X，μg∕mL）進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線在2．0～64．0 μg∕mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：Y=33 223 428．571 4X-44 911．333 3（r=0．998 6）。

2．8方法學(xué)驗證

2．8．1 專屬性考察 在“2．5”的HPLC條件下，記錄胃液、3，29-DK對照品、瓜蔞薤白水溶液及米酒溶液、瓜蔞薤白水溶液及米酒溶液與胃液混合后（4 h）的HPLC圖。結(jié)果分析得胃液、瓜蔞薤白中其他成分及瓜蔞薤白在胃液中的降解產(chǎn)物不影響3，29-DK的定量。見圖1。

2．8．2 精密度考察 精密量取瓜蔞薤白水溶液樣品，按“2．3”中的降解方法，以“2．5”的色譜條件，選用0 h樣品，連續(xù)進(jìn)同一樣品5次。所得RSD為0．07%，結(jié)果表明精密度較好。

2．8．3 穩(wěn)定性考察 精密量取瓜蔞薤白水溶液樣品4．00 mL，不進(jìn)行酶解處理，以“2．3”的方式萃取，照“2．5”的色譜條件，分別于 0、2、4、8、16、32 h進(jìn)行檢測。RSD為0．33%（n=6），則在32 h內(nèi)樣品溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2．8．4 重復(fù)性考察 取瓜蔞薤白水溶液樣品5份，按“2．3”中方法降解，以“2．5”色譜條件，分別于0 h進(jìn)樣，RSD為0．04%，表明方法重復(fù)性較好。

2．8．5 加樣回收率 取已知3，29-DK含量的藥材水洗溶液樣品3組，每組3份，在3組中分別加入檢測成分含量的120%、100%、80%的對照品，按“2．5”HPLC條件，結(jié)果可得加樣回收率為101．9%，RSD為1．10%。

2．9瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中降解率的考察制備瓜蔞薤白藥材溶液各3批，以水和米酒分別洗下，按“2．3”和“2．4”項下的方法操作制備瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液在胃液中不同時間點的供試樣品，以“2．5”項下的條件進(jìn)樣測定，計算不同時間點3，29-DK在胃液中的降解率，即：

圖1 瓜蔞薤白水溶液及米酒溶液中3，29-DK的專屬性考察HPLC色譜圖

其中：ct為瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中t小時時的濃度（μg∕mL）（t=0，1，2，3，4 h）；c0為瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中0 h時的濃度（μg∕mL）。見圖2。

由圖2可知，以水和米酒作為溶媒的瓜蔞薤白溶液，3，29-DK在胃液中均有不同程度降解，且隨時間成正相關(guān)。在米酒的作用下，瓜蔞薤白藥液中3，29-DK在胃液中1～4 h各時間點的降解率，較瓜蔞薤白水溶液明顯降低且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。由DAS 2．0 分析可獲得兩溶液中3，29-DK降解率的AUC0-t（mg·min·L）值〔8〕，分別為（140．84±3．65）和（78．17±5．83）（ xˉ±s，n=3），二者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），說明引藥米酒可抑制3，29-DK在人工胃液中的降解。

圖2 瓜蔞薤白水溶液和米酒溶液中3，29-DK在胃液中隨時間的降解率（xˉ±s，n=3）

3 討論

食物由胃排入十二指腸的過程稱為胃排空。健康人的胃排空時間多不超過4 h〔9〕。結(jié)合文獻(xiàn)〔10〕，本試驗將3，29-DK在胃液中的降解率的考察時間設(shè)計為4 h。試驗發(fā)現(xiàn)，1 h時，瓜蔞薤白水及米酒溶液中3，29-DK在胃液中的降解率分別為（21．52%±2．18%）和（5．01%±1．44%），1～4 h瓜蔞薤白水及米酒溶液中3，29-DK在胃液中降解線性方程分別為Y=11．57X+11．28（r=0．9619），Y=11．70X-4．95（r=0．9925），兩條曲線基本平行，但在縱坐標(biāo)上的截距明顯不同。因此，米酒主要在0～1 h可有效抑制3，29-DK在胃液中降解，也是后續(xù)各時間點瓜蔞薤白米酒溶液中3，29-DK降解率較瓜蔞薤白水溶液中低的基礎(chǔ)。實驗結(jié)果顯示，米酒抑制瓜蔞薤白藥液中3，29-DK在胃液中的降解，導(dǎo)致這種結(jié)果的可能原因有兩個：一是米酒中的蛋白質(zhì)等成分和胃液作用，降低了胃液對3，29-DK的降解能力；二是米酒在減弱胃蛋白酶的活性方面發(fā)揮作用。

〔1〕李英，惠朋利．瓜蔞薤白白酒湯合丹參制劑治療不穩(wěn)定型心絞痛臨床研究〔J〕．中醫(yī)學(xué)報，2015，30（7）：1044-1046．

〔2〕吳晶晶，丁舸．瓜蔞薤白白酒湯核心藥組淺析〔C〕∕呼和浩特：全國第二十二次仲景學(xué)說學(xué)術(shù)年會論文集．2014．

〔3〕陳素慧．瓜蔞薤白湯的研究進(jìn)展〔J〕．天津藥學(xué)，2013，25（2）：60-62．

〔4〕卞海，王雅娟，黃順，等．瓜蔞薤白白酒湯對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕．中成藥，2013，35（11）：2347-2352．

〔5〕范鐵兵，楊志旭．仲景所用溶媒探析〔J〕．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14（7）：133-136．

〔6〕國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：一部〔M〕．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：112．

〔7〕國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：四部〔M〕．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：119．

〔8〕劉玲，趙曉莉，狄留慶，等．采用體外腸道菌群實驗研究防風(fēng)對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷代謝的影響〔J〕．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，31（2）：170-173．

〔9〕劉碩藝．100例胃排空時間x線觀察〔J〕．刑事技術(shù)，1984（1）：14-16．

〔10〕盧鳳來，黃振聰，顏小捷，等．羅漢果皂苷V在人工胃液中的穩(wěn)定性和體外代謝研究〔J〕．廣西植物，2015，35（6）：792-795．

（責(zé)任編輯 李 楊）

A Study on the Effect of Rice Wine as Cites Drug on Degradation of 3，29-Dibenzoyl-Karounitriol in Gualou-Xiebai in Artificial Gastric Juice

Yan Haiyan,Jia Wenqian,Zou Chuncai
（College of Pharmacy,Wannan Medical College,Wuhu,Anhui 241002,China）

Objective:To study the effects of rice wine as cites drug on the metabolism of 3,29-dibenzoyl-karounitriol as the main active component in Gualou-Xiebai in artificial gastric juice．Methods:The degradation rate of 3,29-dibenzoyl-karounitriol in Gualou-Xiebai rice aqueous solution and wine solution in artificial gastric juice were analyzed after 1 h,2 h,3 h and 4 h by the use of HPLC-SPD．Results:Compared with Gualou-Xiebai aqueous solution,the degradation rate of 3,29-dibenzoyl-karounitriol in Gualou-Xiebai rice wine solution in artificial gastric juice at each time point was significantly reduced and there was a significant difference（P＜0．01）．The AUC0-t（mg·min·L）of the degradation rate were（140．84 ± 3．65）and（78．17 ± 5．83）（xˉ± s，n=3）when the water and rice wine were used as the solvent respectively,and there was a significant difference between them（P＜0．01）．Conclusion：Rice wine as cites drug can effectively inhibit the degradation of 3,29-dibenzoyl-karounitriol in Gualou-Xiebai in artificial gastric juice．

rice wine as cites drug;Gualou-Xiebai;3,29-dibenzoyl-karounitriol;artificial gastric juice;degradation

R945

A

2096-2266（2017）10-0015-04

10．3969 ∕j．issn．2096-2266．2017．10．004

安徽高校省級自然科學(xué)研究重大項目（KJ2015ZD41；KJ2016SD60）；安徽省科技攻關(guān)項目（12010402089）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目（201510368018）

2017-02-13

2017-07-05

鄢海燕，教授，主要從事藥物制劑及其質(zhì)量控制研究．