5-羥色胺在非糜爛性反流病中表達(dá)的研究

姜志茹， 趙 雷， 郭 海， 鄭愛(ài)萍， 李明華

北京大學(xué)深圳醫(yī)院 1.老年科；2.消化科；3.病理科；4.中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518036

5-羥色胺在非糜爛性反流病中表達(dá)的研究

姜志茹1， 趙 雷1， 郭 海2， 鄭愛(ài)萍3， 李明華4

北京大學(xué)深圳醫(yī)院 1.老年科；2.消化科；3.病理科；4.中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518036

目的研究5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)在質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibtor, PPI)療效差的非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease, NERD)患者和PPI有效的NERD患者食管黏膜中的表達(dá)。方法北京大學(xué)深圳醫(yī)院門(mén)診60例NERD患者分為兩組：PPI療效差組21例，PPI有效組39例，10名健康志愿者為正常對(duì)照組，胃鏡下取食管黏膜標(biāo)本。免疫組化法測(cè)定肥大細(xì)胞的表達(dá)，免疫印跡法測(cè)定5-HT4受體、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter, SERT)的蛋白表達(dá)。結(jié)果PPI療效差組與PPI有效組的肥大細(xì)胞表達(dá)分別為：(17.05±2.13)%、(18.37±3.86)%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均高于正常對(duì)照組(3.94±2.13)%(P<0.05)。PPI療效差組、PPI有效組和正常對(duì)照組的5-HT4R蛋白吸光度比值分別為：1.08±0.17、0.96±0.15、1.10±0.18，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SERT蛋白吸光度比值：PPI療效差組(1.22±0.20)>PPI有效組(0.63±0.14)>正常對(duì)照組(0.21±0.09)(P<0.05)。結(jié)論SERT的高表達(dá)可能參與了PPI療效差的NERD的發(fā)病機(jī)制。

5-羥色胺；非糜爛性反流病；質(zhì)子泵抑制劑

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一種常見(jiàn)的消化道動(dòng)力障礙性疾病，指胃內(nèi)容物反流導(dǎo)致不同程度的食管黏膜損傷，可引起反酸、燒心等典型的反流癥狀。根據(jù)內(nèi)鏡和病理,GERD分為非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)、反流性食管炎和Barrett’s食管，其中NERD占GERD的65%～70%[1]。質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)是GERD的主要治療方法，但對(duì)于40%～50%的NERD患者往往不能獲得滿(mǎn)意療效，相關(guān)發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，可能與NERD患者食管的高敏感性和運(yùn)動(dòng)異常等因素有關(guān)[2]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)、分泌及感覺(jué)功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，在消化道動(dòng)力障礙性疾病發(fā)病機(jī)制中的研究越來(lái)越受到重視。但5-HT是否參與了PPI療效差的NERD患者的發(fā)病機(jī)制，目前尚無(wú)相關(guān)研究。本項(xiàng)目擬研究5-HT在PPI療效差的NERD患者和PPI有效的NERD患者食管黏膜中的表達(dá)，探討5-HT是否參與了PPI療效差的NERD發(fā)病機(jī)制，為臨床上選擇5-HT相關(guān)藥物治療PPI療效差的NERD提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015年9月至2016年10月北京大學(xué)深圳醫(yī)院門(mén)診的60例NERD患者，男34例，女26例，年齡(50.2±7.5)歲(36～65歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)(依據(jù)2013年美國(guó)胃腸病學(xué)會(huì)頒布的《胃食管反流病診斷和治療指南》[3])：(1)年齡18～80歲；(2)有典型的燒心、反酸、反食、胸痛等反流癥狀，病程≥3個(gè)月，GERD評(píng)分≥8分；(3)胃鏡檢查顯示食管黏膜無(wú)糜爛、潰瘍；(4)無(wú)消化道其他器質(zhì)性疾病及消化系統(tǒng)手術(shù)史，無(wú)可引起胃食管反流癥狀的全身系統(tǒng)性疾病；(5)4周內(nèi)未接受過(guò)抑酸、促動(dòng)力或抗抑郁等特殊治療。對(duì)于NERD患者給予PPI試驗(yàn)性治療(埃索美拉唑鎂腸溶片20 mg 2次/d，治療2周)，根據(jù)PPI治療前后GERD評(píng)分改善程度分為兩組：PPI療效差組(評(píng)分改善≤50%)21例，PPI有效組(評(píng)分改善>50%)39例。選取10名健康志愿者為正常對(duì)照組，無(wú)消化道疾病史，胃鏡檢查正常。所有研究對(duì)象于胃鏡檢查時(shí)采集食管黏膜標(biāo)本，標(biāo)本分為兩部分，一部分置于甲醛固定、石蠟包埋，另一部分置于-80 ℃中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化法測(cè)定肥大細(xì)胞的表達(dá)：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，沸水浴中1 mmol/L EDTA(pH 8.0)修復(fù)抗原，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。Envision法進(jìn)行免疫組化染色，抗肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶抗體(abcam)的工作濃度為1∶100，PBS為陰性對(duì)照，滴加二抗后DAB顯色，光鏡觀察。以細(xì)胞漿呈棕黃色為肥大細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性，高倍視野(400×)下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.2.2 Western blotting測(cè)定5-HT4受體(5-HT4R)、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter，SERT)的蛋白表達(dá)：依據(jù)RIPA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取凍存組織細(xì)胞內(nèi)總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，以80 μg蛋白上樣進(jìn)行80 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V恒壓電泳約25 min，待溴酚藍(lán)至積層膠與分離膠交界處換120 V恒壓電泳約1 h，使溴酚藍(lán)全部電泳出分離膠底部。電轉(zhuǎn)法(100 V，1 h)將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，質(zhì)量濃度為100 g/L的脫脂奶粉封閉2 h，與5-HT4R抗體(abcam，1∶1 000稀釋)、SERT抗體(abcam，1∶5 000稀釋)及β-actin抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。ECL法檢測(cè)蛋白條帶，X線曝光，凝膠電泳分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描分析并拍照。結(jié)果以與內(nèi)參β-actin蛋白條帶吸光度比值表示。

2 結(jié)果

2.1免疫組化法測(cè)定肥大細(xì)胞的表達(dá)PPI療效差組與PPI有效組的肥大細(xì)胞表達(dá)分別為：(17.05±2.13)%、(18.37±3.86)%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均高于正常對(duì)照組(3.94±2.13)%(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

2.2Westernblotting測(cè)定5-HT4R、SERT的表達(dá)5-HT4R蛋白表達(dá)：PPI療效差組、PPI有效組和正常對(duì)照組的5-HT4R蛋白吸光度比值分別為：1.08±0.17、0.96±0.15、1.10±0.18，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SERT蛋白表達(dá)：PPI療效差組(蛋白吸光度比值1.22±0.20)>PPI有效組(蛋白吸光度比值0.63±0.14)>正常對(duì)照組(蛋白吸光度比值0.21±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

圖2 SERT、5-HT4R的蛋白表達(dá) A：PPI療效差組；B：PPI有效組；C：正常對(duì)照組Fig 2 Expressions of SERT and 5-HT4R A: poor effection of PPI group; B: good effection of PPI group; C: normal control group

3 討論

NERD是指存在典型胃食管反流的臨床癥狀，但內(nèi)鏡下無(wú)食管黏膜損傷的一種疾病。NERD患者易合并精神心理異常和并存功能性胃腸病，PPI治療緩解率低，NERD中40%～50%患者對(duì)PPI治療無(wú)反應(yīng)[4]。NERD患者對(duì)PPI治療無(wú)反應(yīng)的原因可能與酸抑制不完全、食管對(duì)酸的高敏感性、食管壁擴(kuò)張的高敏感性、十二指腸腸液的反流、食管運(yùn)動(dòng)異常、持續(xù)的食管收縮和心理因素等方面有關(guān)[5]。其中，有關(guān)NERD患者食管高敏感性的確切機(jī)制尚不明確，目前研究[6]表明，食管黏膜上初級(jí)傳入神經(jīng)感受器被化學(xué)刺激(如酸刺激)、機(jī)械刺激(如高振幅蠕動(dòng)收縮)、溫度刺激(如冷、熱流體)和其他內(nèi)在刺激(如壓力、精神心理作用)激活而產(chǎn)生動(dòng)作電位，動(dòng)作電位信號(hào)再由迷走神經(jīng)和脊神經(jīng)通路傳至中樞而引起食管高敏感，這一過(guò)程由外周機(jī)制(食管感覺(jué)神經(jīng)纖維末梢致敏)和中樞機(jī)制(脊髓、大腦中樞致敏)介導(dǎo)。

5-HT也稱(chēng)血清素(serotonin)，90%存在于消化道黏膜，8%～10%存在于血小板，1%～2%存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)、分泌及感覺(jué)功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與內(nèi)臟高敏感的發(fā)生有關(guān)[7]。5-HT主要來(lái)源于消化道黏膜的肥大細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、部分胃腸道肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元及黏膜下神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)纖維及細(xì)胞，當(dāng)受到外界刺激時(shí)，致敏的肥大細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞脫顆粒向周?chē)M織中釋放5-HT，5-HT通過(guò)與5-HT受體結(jié)合而發(fā)揮生理效應(yīng)，而釋放入細(xì)胞間隙的5-HT可被5-SERT再攝入細(xì)胞內(nèi)而被代謝[8]。目前已發(fā)現(xiàn)7種5-HT受體類(lèi)型，并可進(jìn)一步細(xì)分為16種亞型，其中，5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4和5-HT7存在于人消化道，尤其以5-HT4R和消化道的功能調(diào)節(jié)關(guān)系密切[9]。5-HT4R激動(dòng)劑通過(guò)興奮5-HT4R，增加蛋白激酶途徑的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)降鈣素基因相關(guān)肽、P物質(zhì)、乙酰膽堿等的釋放，作用于周?chē)窠?jīng)末梢，從而改變胃腸感覺(jué)和動(dòng)力[10]。

Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)反流性食管炎大鼠的5-HT、SERT表達(dá)高于NERD組及對(duì)照組，5-HT4R的表達(dá)低于NERD組及對(duì)照組，推測(cè)5-HT4R受體介導(dǎo)的信號(hào)通路異常導(dǎo)致食管動(dòng)力障礙，酸停留時(shí)間延長(zhǎng)，食管黏膜受損。Saegusa等[12]研究發(fā)現(xiàn)GERD大鼠食管下括約肌5-HT4R的mRNA表達(dá)減少，從而導(dǎo)致食管下括約肌動(dòng)力異常，應(yīng)用5-HT4R受體激動(dòng)劑，可以降低一過(guò)性食管下括約肌松弛的頻率，縮短酸性物質(zhì)在食管停留的時(shí)間。

5-HT再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)通過(guò)抑制5-HT再攝取增加突觸間隙中5-HT的含量，是臨床上常見(jiàn)的一種抗抑郁藥，近年來(lái)也用于功能性胃腸病的治療[13]，其療效機(jī)制目前尚不明確，SSRIs可能是通過(guò)中樞作用來(lái)調(diào)整中樞認(rèn)知功能，減緩對(duì)應(yīng)激反應(yīng)性等改善內(nèi)臟高敏感性，也可能是直接作用于外周胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮療效。Viazis等[14]研究發(fā)現(xiàn)丙咪嗪可提高正常人食管的痛閾，改善胸痛癥狀，曲唑酮能降低食管的化學(xué)和機(jī)械敏感性。Broekaert等[15]研究發(fā)現(xiàn)西酞普蘭可以降低食管的化學(xué)和機(jī)械敏感性，對(duì)食管的動(dòng)力無(wú)影響。

本研究根據(jù)PPI治療前后GERD評(píng)分改善程度將NERD患者分為PPI療效差組與PPI有效組。通過(guò)免疫組化法測(cè)定食管黏膜肥大細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩組肥大細(xì)胞的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)Western blotting測(cè)定5-HT4R、SERT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PPI療效差組的SERT的表達(dá)高于PPI有效組，兩組5-HT4R的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)SERT的高表達(dá)可能通過(guò)減少突觸間隙中5-HT的含量，經(jīng)由外周機(jī)制導(dǎo)致NERD患者食管的高敏感性，參與了PPI療效差的NERD的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而推測(cè)SSRIs可能通過(guò)外周機(jī)制改變5-HT的含量，發(fā)揮其對(duì)PPI療效差的NERD的治療作用。

[1] Fass R. Erosive esophagitis and nonerosive reflux disease (NERD): comparison of epidemiologic, physiologic, and therapeutic characteristics [J]. J Clin Gastroenterol, 2007, 41(2): 131-137.

[2] Scarpignato C. Poor effectiveness of proton pump inhibitors in non-erosive reflux disease: the truth in the end! [J]. Neurogastroenterol Motil, 2012, 24(8): 697-704.

[3] Katz PO, Gerson LB, Vela MF. Guidelines for the diagnosis and management of gastroesophageal reflux disease [J]. Am J Gastroenterol, 2013, 108(3): 308-328.

[4] Kawamura O, Hosaka H, Shimoyama Y, et al. Evaluation of proton pump inhibitor-resistant nonerosive reflux disease by esophageal manometry and 24-hour esophageal impedance and pH monitoring [J]. Digestion, 2015, 91(1): 19-25.

[5] Bashashati M, Hejazi RA, Andrews CN, et al. Gastroesophageal reflux symptoms not responding to proton pump inhibitor: GERD, NERD, NARD, esophageal hypersensitivity or dyspepsia? [J]. Can J Gastroenterol Hepatol, 2014, 28(6): 335-341.

[6] Weijenborg PW, Smout AJ, Verseijden C, et al. Hypersensitivity to acid is associated with impaired esophageal mucosal integrity in patients with gastroesophageal reflux disease with and without esophagitis [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014, 307(3): G323-G329.

[7] Morrissette DA, Stahl SM. Modulating the serotonin system in the treatment of major depressive disorder [J]. CNS Spectr, 2014, 19 Suppl 1: 57-67; quiz 54-57, 68.

[8] Bertrand PP, Bertrand RL. Serotonin release and uptake in the gastrointestinal tract [J]. Auton Neurosci, 2010, 153(1-2): 47-57.

[9] Li HF, Liu JF, Zhang K, et al. Expression of serotonin receptors in human lower esophageal sphincter [J]. Exp Ther Med, 2015, 9(1): 49-54.

[10] Broad J, Hughes F, Chin-Aleong J, et al. Regionally dependent neuromuscular functions of motilin and 5-HT4 receptors in human isolated esophageal body and gastric fundus [J]. Neurogastroenterol Motil, 2014, 26(9): 1311-1322.

[11] Yang L, Cai H, Tou J, et al. The role of the 5-hydroxytryptamine pathway in reflux-induced esophageal mucosal injury in rats [J]. World J Surg Oncol, 2012, 10: 219.

[12] Saegusa Y, Takeda H, Muto S, et al. Decreased motility of the lower esophageal sphincter in a rat model of gastroesophageal reflux disease may be mediated by reductions of serotonin and acetylcholine signaling [J]. Biol Pharm Bull, 2011, 34(5): 704-711.

[13] Itatsu T, Nagahara A, Hojo M, et al. Use of selective serotonin reuptake inhibitors and upper gastrointestinal disease [J]. Intern Med, 2011, 50(7): 713-717.

[14] Viazis N, Keyoglou A, Kanellopoulos AK, et al. Selective serotonin reuptake inhibitors for the treatment of hypersensitive esophagus: a randomized, double-blind, placebo-controlled study [J]. Am J Gastroenterol, 2012, 107(11): 1662-1667.

[15] Broekaert D, Fischler B, Sifrim D, et al. Influence of citalopram, a selective serotonin reuptake inhibitor, on oesophageal hypersensitivity: a double-blind, placebo-controlled study [J]. Aliment Pharmacol Ther, 2006, 23(3): 365-370.

(責(zé)任編輯：陳香宇)

Expressionof5-hydroxytryptamineinnon-erosiverefluxdisease

JIANG Zhiru1, ZHAO Lei1, GUO Hai2, ZHENG Aiping3, LI Minghua4

1.Department of Gerontology; 2.Department of Gastroenterology; 3.Department of Pathology; 4.Central Laboratory, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China

ObjectiveTo investigate the expression of 5-hydroxytryptamine (5-HT) in non-erosive reflux disease (NERD) with poor effection and good effection of proton pump inhibitor (PPI).MethodsSixty patients of NERD were divided into poor effection of PPI group (21 patients), good effection of PPI group (39 patients) and 10 volunteers as the normal control group, esophageal mucous membrane biopsy were obtained by gastroscopy. The expression of mast cells was determined by immunohistochemistry technique, the expressions of 5-HT4 receptor and serotonin transporter (SERT) were determined by Western blotting.ResultsThe mast cell expression rate was (17.05±2.13)% in poor effection of PPI group and (18.37±3.86)% in good effection of PPI group (with no statistical difference), higher than that in the normal control group (3.94±2.13)% (P<0.05). The 5-HT4 receptor (5-HT4R) protein absorbance ratio by Western blotting were 1.08±0.17, 0.96±0.15 and 1.10±0.18 in poor effection of PPI group, good effection of PPI group and normal control group, respectively, with no statistical difference (P>0.05). The SERT protein absorbance ratio: poor effection of PPI group (1.22±0.20)> good effection of PPI group (0.63±0.14)>normal control group (0.21±0.09) (P<0.05).ConclusionThe up-regulation of SERT protein expression might be involved in the pathogenesis of NERD with poor effection of PPI.

5-hydroxytryptamine; Non-erosive reflux disease; Proton pump inhibitor

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.021

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20150403091443306)

姜志茹，博士，副主任醫(yī)師,研究方向：胃食管反流病。E-mail：japonica@sina.com

R57

A

1006-5709(2017)11-1282-03

2016-12-30