百蕊草離體快繁體系技術(shù)優(yōu)化

羅查梅+黃燕芬+劉向陽+曹永高+謝奇

摘 要 ：為優(yōu)化百蕊草離體培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，本試驗以野生百蕊草的葉片及幼嫩莖段為外植體，通過研究外植體消毒時間、不同濃度激素配比對芽苗誘導(dǎo)、增殖、壯苗的影響，以提高外植體誘導(dǎo)率和瓶苗增殖率。結(jié)果表明：（1）75%的酒精溶液消毒10 s后0.1%的氯化汞溶液浸泡8 min，外植體消毒效果最佳；（2）最適初代培養(yǎng)配方為MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA，增殖繼代培養(yǎng)配方為MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.3 mg·L-1 NAA，健壯無根苗培養(yǎng)基配方為MS + 0.5 mg·L-1 NAA。

關(guān)鍵詞： 百蕊草；組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號：Q813.1+2 文獻標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.11.003

Abstract： In order to optimize the rapid reproduction technology of Thesium chinense Turcz， the experiment was conducted with the leaf and young stem of wild T. chinensis as explants， and the effects of explants disinfection time and different hormones concentrations on the bud seedling induction， proliferation and growth were studied. The results showed as follows： （1） the optimal disinfection method was sterilized 10 s with 75% alcohol， and then soaked 8 min with 0.1% HgCl2. （2） The optimal primary culture medium formula was MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA， and the optimal step-generation culture medium formula was MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.3 mg·L-1 NAA， and the optimal robust adventitious buds culture medium formula was MS + 0.5 mg·L-1 NAA. The research could improve the value-added rate of explants induction and plantlets， providing reference for T. chinense seedling propagation.

Key words： Thesium chinense Turcz； tissue culture； rapid propagation

百蕊草（Thesium chinense Turcz）為檀香科多年生草本植物，全草入藥，具有清熱解毒、補腎澀精等功能，同時具有治療急性乳腺炎、肺炎、肺膿瘍、扁桃體炎、上呼吸道感染、腎虛腰痛、頭暈遺精、滑精等療效[1]。近年來，由于過度采挖和自然環(huán)境遭到破壞，野生資源日益枯竭，百蕊草的產(chǎn)量逐漸減少，市場上百蕊草已是供不應(yīng)求。百蕊草為半寄生草本植物，資源分布較為分散，且人工栽培較為困難，但臨床醫(yī)用量又日益增長[2-3]，為了解決此問題，人工培育百蕊草迫在眉睫。根據(jù)百蕊草野生苗與組培苗抑菌抗炎試驗比較研究，百蕊草野生苗和組培苗的提取物具有等效的抗炎抑菌作用[4]。從百蕊草的研究現(xiàn)狀來看，仍存在外植體誘導(dǎo)率較低、組培苗增值系數(shù)不高、長勢較弱等問題，因此， 本試驗通過優(yōu)化和完善百蕊草快繁體系，增加瓶苗增殖系數(shù)和優(yōu)等苗數(shù)量，為百蕊草快繁技術(shù)進一步發(fā)展和應(yīng)用提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用百蕊草新萌發(fā)的莖段、葉作為外植體，材料采自貴陽市花溪區(qū)。

1.2 試驗方法

1.2.1 叢生芽的誘導(dǎo) 取春季百蕊草植株上的幼嫩、健壯無病蟲害莖和葉，用流水沖洗凈后進行表面消毒：75%酒精溶液涮洗10 s，后用無菌水洗1～2次，再置于 0.1% 氯化汞溶液中浸泡，設(shè)置浸泡時間梯度為6，7，8，9，10 min，分別記為T1～T5，之后統(tǒng)一用無菌水清洗4～5次，進行初代誘導(dǎo)培養(yǎng)并統(tǒng)計外植體的萌發(fā)、污染、死亡、成活等誘導(dǎo)情況，計算其污染率、死亡率、成活率和愈傷組織誘導(dǎo)率，篩選能夠獲得最佳誘導(dǎo)效果的氯化汞消毒時間。

外植體切成 2 cm長的帶腋芽小段接入以MS為基本培養(yǎng)基，含NAA 0.13 mg·L-1的不同6-BA濃度的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，6-BA濃度梯度設(shè)置為0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mg·L-1，分別記為C1～C7。經(jīng)2～3周初代培養(yǎng)的百蕊草外植體切口處增厚變肥大產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織為綠色并開始出現(xiàn)芽的分化，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)接到同種激素配比的新鮮MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，20 d后記錄外植體出芽數(shù)，篩選能夠獲得最佳誘導(dǎo)效果的6-BA在初代培養(yǎng)基中的最適濃度。

1.2.2 芽的增殖繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)的百蕊草愈傷組織切至帶2棵芽苗 0.5～0.8 cm2 大小的團塊，轉(zhuǎn)接到附加不同6-BA和NAA配比的MS基本培養(yǎng)基中進行增殖繼代培養(yǎng)，其中6-BA和NAA配比設(shè)置6個處理（記為組1 ～ 組6，詳見表3），每種配方處理接種10瓶，每瓶接種2個團塊，培養(yǎng)30 d時統(tǒng)計增殖芽數(shù)，記錄芽的生長情況，并計算增殖系數(shù)，篩選最適增殖培養(yǎng)的6-BA和NAA配比。endprint

1.2.3 壯苗培養(yǎng) 將繼代增殖培養(yǎng)得到的無菌苗轉(zhuǎn)接至MS或1/2 MS為基本培養(yǎng)基，僅含不同濃度NAA的壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中基本培養(yǎng)基MS與不同濃度NAA組合形成5種配方（記為F1～F5，詳見表4），每種配方接種10瓶，每瓶接種5棵芽苗，接種18 d左右植株開始出現(xiàn)芽的分枝，葉片由卷曲狀開始變直變寬，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計百蕊草芽苗生長狀況，包括葉片大小、嫩綠情況、葉柄的粗細(xì)程度及苗的高度等指標(biāo)，篩選最優(yōu)壯苗培養(yǎng)基配方。

上述試驗過程中的培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度（24±1） ℃，光照時間12 h·d-1，光照強度1 500～2 000 lx[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化汞消毒時間對外植體生長的影響

從表1可以看出，隨著氯化汞溶液消毒時間的延長，污染率呈下降趨勢，成活率和愈傷組織誘導(dǎo)率呈先升后降的趨勢，其中以消毒時間8 min時最高，誘導(dǎo)效果最佳；死亡率僅出現(xiàn)在9 min和10 min處理，且隨著表面消毒時間的延長死亡率增加，說明百蕊草幼嫩莖葉外植體對0.1%氯化汞溶液的最長耐受時間為8 min，長于此處理時間百蕊草外植體芽苗的誘導(dǎo)將受到抑制。

2.2 6-BA對芽誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，隨6-BA濃度的增加，百蕊草外植體出芽總數(shù)和平均出芽數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，其中以6-BA濃度為2.0 mg·L-1時平均出芽數(shù)最高，即C5處理組MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA的初代培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)效果最佳（圖1）。

2.3 不同激素配比對百蕊草芽苗增殖的影響

增殖培養(yǎng)30 d時的結(jié)果由表3可知：6-BA的濃度在0.5～2.5 mg·L-1均有促進百蕊草芽增殖的作用，其中以組3即MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.30 mg·L-1 NAA為最佳的增殖培養(yǎng)基配方，可以獲得較高的增殖系數(shù)，且其芽長勢健壯（圖2a）；雖然組4獲得的增殖芽數(shù)最多，但生長空間的限制使芽的長勢相對組3較瘦弱（圖2b）。6-BA和NAA濃度過高會抑制苗的增殖和生長；在各濃度處理中，培養(yǎng)30 d以后的愈傷組織逐漸出現(xiàn)不同程度的發(fā)黃現(xiàn)象，且產(chǎn)生的小芽苗也隨之枯黃。

2.4 不同壯苗培養(yǎng)基對百蕊草生長的影響

由于增殖培養(yǎng)得到的芽苗數(shù)目較多，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分消耗很快，生長空間不足，導(dǎo)致芽苗長勢不統(tǒng)一（圖3a），無效芽苗增多，因此有必要進行壯苗培養(yǎng)，以提高無根瓶苗的培養(yǎng)效益。

從表4可以看出，無論是MS還是1/2MS基本培養(yǎng)基，均以NAA濃度0.5 mg·L-1時，對百蕊草的壯苗效果較好，其中以壯苗配方F1組MS + 0.5 mg·L-1 NAA效果最佳，可以獲得較大葉片、較粗的莖、較旺盛的長勢，以及較高的分枝數(shù)和株高（圖3b），說明MS基本培養(yǎng)基比1/2 MS更適合百蕊草的生長，NAA濃度過高不利于百蕊草的生長。

3 結(jié)論與討論

“酒精+氯化汞”是外植體培養(yǎng)前處理常用的消毒方法之一[7]，由于汞離子對動植物和人體都會產(chǎn)生一定的毒害作用[8]，故使用氯化汞消毒的過程中除考慮其消毒效果外，還應(yīng)避免對外植體生長活力的破壞[9]。試驗結(jié)果顯示，0.1%氯化汞消毒時間以8 min為宜，可在不破壞百蕊草生長活力的前提下降低污染率。時間過短，污染率過高進而降低了誘導(dǎo)率，時間過長，死亡率增加亦降低了誘導(dǎo)率。

在外植體離體培養(yǎng)中不添加其寄主植物提取液的情況下，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素和生長素的比值非常重要。試驗結(jié)果表明，6-BA濃度在0.5～2.5 mg·L-1，NAA濃度在0.13～0.5 mg·L-1范圍內(nèi)，對百蕊草芽的增殖均有促進作用，超出這個范圍會抑制芽的分化生長。試驗最終篩選出百蕊草離體繁殖最適初代培養(yǎng)配方為MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA，增殖繼代培養(yǎng)配方為MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.3 mg·L-1 NAA，壯苗培養(yǎng)配方為MS + 0.5 mg·L-1 NAA，如此優(yōu)化后的百蕊草快繁培養(yǎng)條件，具有誘導(dǎo)周期短、誘導(dǎo)率高、激素用量少、分化迅速、增殖率高的特點。同時，根據(jù)增殖苗的長勢，確定百蕊草的增殖周期不宜超過30 d。由于持續(xù)增殖會導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)成分耗盡，生長空間擁擠使芽苗質(zhì)量下降，且器官開始老化。但若增殖周期過短則芽增殖達不到頂峰，故百蕊草具體最佳增殖周期有待于進一步研究。

目前，國內(nèi)對百蕊草組織培養(yǎng)的系統(tǒng)研究還相對較少，如組培苗在移栽階段提高成活率、離體培養(yǎng)使用的各種試劑對百蕊草藥用成分、品質(zhì)的影響、在百蕊草的離體培養(yǎng)中不添加百蕊草寄主植物提取液的情況下，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素和生長素的比值能較高效的完成離體培養(yǎng)的機制等。為實現(xiàn)百蕊草種苗的工廠化生產(chǎn)，處理好百蕊草作為中藥材生產(chǎn)的種源不足情況，這些問題都有待系統(tǒng)深入研究。

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