大腸桿菌宿主遺傳背景對(duì)色氨酸生物傳感器響應(yīng)特性的影響

王天民,張 翀,2,邢新會(huì),2

(1.清華大學(xué) 化學(xué)工程系 生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2.清華大學(xué) 合成和系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100084)

大腸桿菌宿主遺傳背景對(duì)色氨酸生物傳感器響應(yīng)特性的影響

王天民1,張 翀1,2,邢新會(huì)1,2

(1.清華大學(xué) 化學(xué)工程系 生物化工研究所 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2.清華大學(xué) 合成和系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100084)

生物傳感器是一類重要的合成生物學(xué)功能元件，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于代謝工程領(lǐng)域的突變文庫篩選和進(jìn)化工程研究中。生物傳感器的正交性，即和宿主細(xì)胞中其他遺傳元件盡可能小的相互作用，對(duì)于其在代謝工程領(lǐng)域的成功應(yīng)用至關(guān)重要。然而，對(duì)于這一問題缺乏系統(tǒng)性的認(rèn)識(shí)。在本文中，通過分析不同遺傳背景的大腸桿菌宿主對(duì)于色氨酸生物傳感器響應(yīng)特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：trpR調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、TnaA裂解酶和色氨酸生物傳感器的響應(yīng)特性具有顯著的相互作用。通過一系列的遺傳學(xué)分析，我們給出了分子水平上介導(dǎo)這一相互作用過程的可能模型。本工作給出了宿主內(nèi)遺傳元件破壞生物傳感器正交性的一個(gè)案例，對(duì)于指導(dǎo)生物傳感器在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

大腸桿菌; 生物傳感器；生物傳感器正交性; 色氨酸; 代謝工程

小分子生物傳感器是一類重要的合成生物學(xué)功能元件。經(jīng)典的小分子生物傳感器由響應(yīng)元件和調(diào)控元件兩部分組成，響應(yīng)元件感知細(xì)胞內(nèi)外的目標(biāo)小分子濃度，并通過相互作用將信號(hào)傳遞給調(diào)控元件，改變下游基因的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)生物傳感器的功能[1]。小分子生物傳感器典型的響應(yīng)、調(diào)控元件配對(duì)包括轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)-啟動(dòng)子(promoter)[2-3]、核糖適配體(aptamer)-核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomal binding site,RBS)[4]等。

小分子生物傳感器可以在單細(xì)胞水平上監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)代謝物的積累水平，因此引起了代謝工程領(lǐng)域的廣泛興趣[5]。例如，通過在下游耦聯(lián)易于被檢出的功能基因，小分子生物傳感器可以被改造成為一種強(qiáng)大的高通量篩選工具，用以從突變文庫中快速篩分或者富集過量累積該小分子的突變細(xì)胞[6]；同時(shí)，小分子生物傳感器還被用于智能細(xì)胞工廠的構(gòu)建，通過實(shí)時(shí)感應(yīng)前體代謝物的累積水平并實(shí)時(shí)控制下游合成途徑的基因表達(dá)，所設(shè)計(jì)的細(xì)胞工廠可以最小化資源的浪費(fèi)以及有毒中間代謝產(chǎn)物的累積[2]；最后，由于單細(xì)胞水平的基因表達(dá)差異，會(huì)造成相同遺傳背景下的細(xì)胞群體分化為不同產(chǎn)能的亞群，通過耦聯(lián)和生長(zhǎng)相關(guān)的基因，小分子生物傳感器可以抑制低產(chǎn)能亞群的生長(zhǎng)，從而提高整體上代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[7]。

小分子生物傳感器在代謝工程領(lǐng)域的典型應(yīng)用路線圖包括傳感器構(gòu)建、響應(yīng)特性測(cè)試和生產(chǎn)條件下的應(yīng)用等步驟。由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜性，環(huán)境條件的微弱改變可能造成宿主細(xì)胞基因表達(dá)模式的顯著差異。由于生物傳感器的測(cè)試條件和實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景很難保持完全一致，因此其成功應(yīng)用高度依賴于生物傳感器的正交性，即最小化其和宿主細(xì)胞內(nèi)其他元件的相互作用，保持其在不同條件下響應(yīng)特性的一致。從這一點(diǎn)延伸開，本文中，筆者對(duì)宿主遺傳背景對(duì)于生物傳感器正交性的影響進(jìn)行更系統(tǒng)的研究，以期找出相關(guān)的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)條件

本文中所涉及E.coliBL21(DE3)(B1)以及B2～B8菌株，來自于筆者實(shí)驗(yàn)室保藏[8]。菌株chr-trp46構(gòu)建自B8，基因型為B8xylA::M1-37-trpEDfbr。將高強(qiáng)度的M1-37啟動(dòng)子(包含RBS序列)[9]克隆到點(diǎn)突變?nèi)コ答佉种莆稽c(diǎn)的trpEDfbr基因[10]上游，并將該表達(dá)盒子插入B8菌株染色體的xylA位點(diǎn)。利用RED重組技術(shù)敲除chr-trp46中的trpEDfbr表達(dá)盒子，得到chr-trp46ΔtrpEDfbr?？寺?shí)驗(yàn)利用的宿主E.coliDH5a來自于BioMed(北京)。對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)，使用LB培養(yǎng)基(10 g/L 蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，固體培養(yǎng)基添加1.8%瓊脂)37 ℃培養(yǎng)。對(duì)于色氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在平板上挑取單克隆在LB中過夜培養(yǎng)，種子液以1%體積分?jǐn)?shù)接種至50 mL三角瓶中的10 mL M9YE培養(yǎng)基[10]，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h，以液相色譜法測(cè)定胞外色氨酸濃度[10]。對(duì)于含有pSen或者pSenmCh的菌株，在相應(yīng)培養(yǎng)基中添加100 mg/L氨芐霉素。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR線性化本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的色氨酸生物傳感器質(zhì)粒[10]，同時(shí)克隆質(zhì)粒pKM154的sacB表達(dá)盒子克隆，利用Gibson assembly[11]進(jìn)行體外組裝得到pSen質(zhì)粒。PCR線性化pSen質(zhì)粒，同時(shí)制備由不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的組成型表達(dá)mCherry表達(dá)盒子線性片段，利用Gibson assembly[11]進(jìn)行體外組裝，得到包括pSenmCh在內(nèi)的一系列目標(biāo)質(zhì)粒(pSenmCh質(zhì)粒圖譜，參考：https://benchling.com/galacharles/f_/IIIoIUJp-tryptophan-biosensor/)。

1.3 色氨酸生物傳感器的表征

在平板上挑取單克隆在LB中(利用24深孔板)過夜培養(yǎng)，將種子液以1%體積分?jǐn)?shù)接種于96孔板內(nèi)的200 μL M9YE培養(yǎng)基中(后期確定條件后加入0.5 mmol/L IPTG)，利用Tecan 2000自動(dòng)化光度計(jì)37 ℃振蕩培養(yǎng)(15 min為間隔測(cè)定)，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線和熒光表達(dá)的測(cè)定。在600 nm處測(cè)定細(xì)胞濁度(OD600)。 綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)及測(cè)定：熒光通道，Ex為485 nm,Em為535 nm。紅色熒光蛋白(mCherry)表達(dá)及測(cè)定：熒光通道，Ex為587 nm,Em為615 nm。

每組包括至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，大部分實(shí)驗(yàn)平行性良好，對(duì)于誤差較小的部分圖表，未標(biāo)出誤差線。

1.4 突變文庫的構(gòu)建和篩選

從平板上挑取單克隆LB培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)，以1%體積分?jǐn)?shù)接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至 OD600為0.8,取10 μL菌液分散于無菌的鐵片上，ARTP處理25 s(100 W,氬氣流10 L/min(SLM))。將突變后的菌體以LB培養(yǎng)基進(jìn)行過夜培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)接于含有0.5 mmol/L IPTG的M9YE培養(yǎng)基中、37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)4 h后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選(FACS Aria， BD Biosciences)。分選后的菌體以加入氨芐霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行收集，離心去上清后涂布于LB平板，挑選單克隆進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 色氨酸生物傳感器中插入組成型表達(dá)mCherry盒子Fig.1 Screening of tryptophan biosensor inserted by constitutively expressing mCherry cassette

1.5 利用sacB反向篩選去除pSen(mCh)質(zhì)粒

將單克隆接種至LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，以1%體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至新鮮的M9YE培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至 OD600為0.8，稀釋1 000倍，取50 μL涂布含有100 g/L蔗糖的無NaCl的LB平板，30 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)?？剐詼y(cè)試和PCR鑒定確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 組成型表達(dá)紅色熒光蛋白對(duì)照的色氨酸生物傳感器

在之前的工作中，筆者基于天然的前導(dǎo)肽機(jī)制構(gòu)建了色氨酸生物傳感器[10]。該生物傳感器的機(jī)制[12]如圖1所示，在前導(dǎo)肽TnaC的編碼基因后克隆了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)作為研究的目的基因。在色氨酸不存在的條件下，細(xì)胞中的rho因子結(jié)合TnaC和GFP之間的識(shí)別序列，造成轉(zhuǎn)錄的提前終止，從而抑制GFP的表達(dá)；在色氨酸存在的條件下，色氨酸和TnaC相互作用，導(dǎo)致TnaC的構(gòu)象發(fā)生變化，使得TnaC前導(dǎo)肽在翻譯完成之后不會(huì)被核糖體釋放，從而抑制了rho因子結(jié)合下游的識(shí)別序列，導(dǎo)致GFP的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯。生物傳感器元件的表達(dá)由pTrc啟動(dòng)子控制，故需要IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，其對(duì)于色氨酸的響應(yīng)范圍在0～1.5 mmol/L之間(胞外添加丙氨酸-色氨酸二肽)[10]。

在本文中，筆者著眼于將色氨酸生物傳感器應(yīng)用于高產(chǎn)菌株的高通量篩選，筆者在質(zhì)粒中添加了sacB基因的表達(dá)模塊，用以在篩選結(jié)束后利用基于sacB催化蔗糖形成有毒產(chǎn)物的致死效應(yīng)以快速地去除傳感器質(zhì)粒；同時(shí)，之前的文獻(xiàn)報(bào)道表明細(xì)胞間的表達(dá)異質(zhì)性(克隆在質(zhì)粒上的表達(dá)元件由于質(zhì)粒拷貝數(shù)在不同細(xì)胞間的變化情況更加嚴(yán)重)會(huì)造成篩選過程的噪音[13-14]，因此，筆者利用組成型表達(dá)的紅色熒光蛋白(mCherry)作為質(zhì)?？截悢?shù)變化的對(duì)照，降低篩選過程中細(xì)胞異質(zhì)性噪音的影響。

利用大腸桿菌BL21(DE3)作為不產(chǎn)生色氨酸的陰性對(duì)照菌株，利用自行構(gòu)建的大腸桿菌chr-trp46(用M9YE培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，發(fā)酵產(chǎn)量0.46 mmol/L)作為累積色氨酸的陽性對(duì)照菌株，筆者構(gòu)建了一系列組成型表達(dá)mCherry的生物傳感器質(zhì)粒(典型質(zhì)粒圖譜如圖1所示)，并將其分別導(dǎo)入BL21(DE3)和chr-trp46，進(jìn)行綠色熒光和紅色熒光的測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：相比于不累積色氨酸的BL21(DE3)菌株，生物傳感器下游的GFP在高產(chǎn)色氨酸的chr-trp46菌株中表達(dá)量顯著提高，且mCherry表達(dá)量在兩種宿主中十分接近；不添加IPTG條件下的微弱泄露表達(dá)也和我們之前的報(bào)道一致[10]。因此，選擇了mCherry表達(dá)量較高的M1-37啟動(dòng)子，并將其對(duì)應(yīng)的生物傳感器質(zhì)粒命名為pSenmCh，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；同時(shí)，還構(gòu)建了一個(gè)不含有mCherry的生物傳感器pSen，比較以綠色熒光蛋白(GFP)熒光和以GFP/mCherry(熒光強(qiáng)度數(shù)值之比Ddr) 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的異同。

2.2 色氨酸生物傳感器誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

為了最大化篩選過程中的不同產(chǎn)量突變體細(xì)胞間的熒光差異，降低篩選過程中的假陽性率，筆者優(yōu)化了色氨酸生物傳感器的操作條件。利用大腸桿菌BL21(DE3)作為不產(chǎn)生色氨酸的陰性對(duì)照菌株，利用大腸桿菌chr-trp46作為累積色氨酸的陽性對(duì)照菌株，分別導(dǎo)入pSen(以GFP與OD600的熒光強(qiáng)度比為評(píng)價(jià)指標(biāo))和pSenmCh質(zhì)粒(以GFP與mCherry的熒光強(qiáng)度比為評(píng)價(jià)指標(biāo))，定義見公式(1)～(2)。

(1)

(2)

如果Ddr值越大，說明累積色氨酸菌株相比于對(duì)照菌株傳感器響應(yīng)越強(qiáng)，篩選過程中的假陽性率也會(huì)越低。

以Ddr作為主要的優(yōu)化指標(biāo)，首先優(yōu)化了添加誘導(dǎo)劑IPTG的時(shí)間(0、4、8、12、24 h)對(duì)Ddr的影響的預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在0時(shí)刻加入IPTG可以觀察到更大的Ddr，而在8 h之后添加IPTG無法觀測(cè)到任何的傳感器響應(yīng)(數(shù)據(jù)未列出)。因此，選定零時(shí)刻作為IPTG的添加時(shí)間，并進(jìn)一步優(yōu)化了其添加量，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：隨著誘導(dǎo)劑添加量的提升，傳感器的Ddr逐漸增加；當(dāng)IPTG添加量超過0.5 mmol/L之后，傳感器的響應(yīng)特性不再發(fā)生明顯變化，證明誘導(dǎo)已經(jīng)達(dá)到飽和。綜上所述，選定了在零時(shí)刻添加0.5 mmol/L IPTG作為色氨酸生物傳感器的操作條件。

圖2 色氨酸生物傳感器誘導(dǎo)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of induction parameters for tryptophan biosensor

2.3 色氨酸生物傳感器篩選的假陽性和分子機(jī)制探究

2.3.1 色氨酸生物傳感器高通量篩選導(dǎo)致高假陽性率

利用上文構(gòu)建的色氨酸生物傳感器進(jìn)行了突變文庫的高通量篩選。將pSen和pSenmCh生物傳感器質(zhì)粒分別導(dǎo)入具有一定色氨酸產(chǎn)量的chr-trp46作為出發(fā)菌株，并利用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的常壓室溫等離子體(ARTP)[15]誘變技術(shù)進(jìn)行了誘變處理。利用流式細(xì)胞分選技術(shù)，基于GFP熒光強(qiáng)度、GFP熒光強(qiáng)度/前向角數(shù)值和GFP熒光強(qiáng)度/mCherry熒光強(qiáng)度這3種指標(biāo)，并結(jié)合上文提到的生物傳感器操作條件進(jìn)行高通量篩選，富集了上述3種指標(biāo)的高值區(qū)域。理論上，誘變后色氨酸產(chǎn)量提高的突變體會(huì)誘導(dǎo)更強(qiáng)的GFP表達(dá)，從而得到富集。筆者對(duì)于每個(gè)組別分離得到了16個(gè)突變體，利用蔗糖反向篩選技術(shù)(sacB)去除生物傳感器質(zhì)粒后進(jìn)行了發(fā)酵表征，結(jié)果表明，沒有菌株表現(xiàn)出顯著的色氨酸產(chǎn)量提升(數(shù)據(jù)未列出)。

2.3.2 色氨酸生物傳感器在不同遺傳背景宿主中的響應(yīng)特性研究

上述異常的假陽性率說明生物傳感器在實(shí)際操作條件下的響應(yīng)參數(shù)可能和之前的設(shè)計(jì)值存在很大的變化。因此，筆者對(duì)這一問題進(jìn)行進(jìn)一步探究。前期的研究表明，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，色氨酸生物傳感器元件響應(yīng)范圍為0～1.5 mmol/L(胞外添加丙氨酸-色氨酸二肽)[10]，這一操作范圍覆蓋了chr-trp46菌株發(fā)酵條件下的色氨酸胞外累積產(chǎn)量(M9YE培養(yǎng)基24 h發(fā)酵產(chǎn)量0.46 mmol/L)，因此，理論上該生物傳感器可以被用于chr-trp46突變庫的篩選，即產(chǎn)量高于chr-trp46的突變株對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度應(yīng)該更高。考慮到篩選后的高假陽性率，筆者假設(shè)chr-trp46遺傳背景和BL21(DE3)的不同可能導(dǎo)致了生物傳感器操作參數(shù)的變化。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，敲除了chr-trp46菌株中的trpEDfbr表達(dá)盒子(chr-trp46ΔtrpEDfbr)，其突變株或者BL21(DE3)的色氨酸產(chǎn)量均無法被液相色譜有效檢出(數(shù)據(jù)未列出)。將pSen和pSenmCh分別導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)和chr-trp46ΔtrpEDfbr，利用胞外添加丙氨酸-色氨酸二肽的方法測(cè)試了色氨酸生物傳感器在這兩種不同宿主下的響應(yīng)特性，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：色氨酸生物傳感器在BL21(DE3)中的結(jié)果和之前的結(jié)果吻合，其響應(yīng)范圍以胞外添加丙氨酸-色氨酸二肽計(jì)，位于0～2.0 mmol/L；與之形成對(duì)比的是，在chr-trp46ΔtrpEDfbr中，其響應(yīng)上限迅速下降到了0.1 mmol/L以下。該結(jié)果表明宿主的遺傳背景差異會(huì)顯著影響生物傳感器的響應(yīng)特性。這種差異使得chr-trp46的胞內(nèi)色氨酸累積很有可能超過了傳感器的操作范圍，導(dǎo)致了篩選的失敗。

圖3 色氨酸生物傳感器響應(yīng)特性在不同宿主遺傳背景下的差異Fig.3 Response profile of tryptophan biosensor perturbed by the genetic backgrounds ofdifferent hosts

為了進(jìn)一步探究其背后的分子機(jī)制，筆者進(jìn)一步分析了chr-trp46菌株的遺傳背景。chr-trp46菌株(B8xylA::M1-46-trpED)構(gòu)建自實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的B8菌株[8]，而B8菌株為大腸桿菌BL21(DE3)的trpR、pheA和tnaA三敲除突變體。因此，推測(cè)trpR、pheA和tnaA中一個(gè)或者多個(gè)基因的敲除影響了色氨酸生物傳感器的響應(yīng)特性。為了系統(tǒng)地研究該問題，筆者利用之前構(gòu)建的一系列具有不同基因型的中間突變體B1～B8[8](見材料與方法，基因型如圖4所示，其色氨酸發(fā)酵胞外累積量均遠(yuǎn)低于0.01 mmol/L)，分別導(dǎo)入pSen和pSenmCh傳感器質(zhì)粒，并測(cè)試了其對(duì)于胞外添加丙氨酸-色氨酸二肽的響應(yīng)特性，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：在含有trpR敲除的四株突變體中(B2、B3、B6以及B8)，對(duì)于胞外添加丙氨酸-色氨酸二肽的響應(yīng)范圍相比于其他菌株下降到了0.2 mmol/L以下。這一特性在11.7 h下尤為顯著，而在4.7 h條件下，同時(shí)敲除了trpR和tnaA的B6和B8菌株較之只敲除了trpR的B2和B3菌株，該表型更為顯著。這一結(jié)果表明：trpR對(duì)于色氨酸生物傳感器響應(yīng)特性變化起主導(dǎo)作用，同時(shí)tnaA對(duì)于其動(dòng)力學(xué)特征(形成所需要的時(shí)間)具有重要影響。

圖4 效應(yīng)物(色氨酸)添加后不同時(shí)間以及trpR、pheA和tnaA敲除對(duì)于色氨酸生物傳感器響應(yīng)特性的影響Fig.4 Effects of time after tryptophan addition and the knockout of trpR,pheA,and tnaA on the biosensor response profile

結(jié)合文獻(xiàn)[16]可知，trpR基因編碼色氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子蛋白TrpR，TrpR在色氨酸存在的條件下抑制一系列和色氨酸生物合成相關(guān)的酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)；而tnaA基因編碼的裂解酶負(fù)責(zé)將胞內(nèi)的色氨酸降解為丙酮酸、胺和吲哚。筆者之前的丙氨酸-色氨酸二肽胞外添加實(shí)驗(yàn)表明，trpR突變體和野生型宿主中色氨酸生物傳感器的響應(yīng)在相當(dāng)短的時(shí)間尺度內(nèi)即產(chǎn)生了明顯差異(特別是在trpR和tnaA同時(shí)被敲除的條件下)，加之B1～B8菌株均沒有明顯的胞外色氨酸累積，因此我們推測(cè)色氨酸生物傳感器在二者中響應(yīng)差異的主要貢獻(xiàn)者并非色氨酸的生物合成，而是trpRregulon和tnaA共同介導(dǎo)的胞內(nèi)色氨酸濃度變化。為了進(jìn)一步闡釋其中的分子機(jī)制，我們檢查了TrpR的regulon[17]，其中特別引起我們興趣的是mtr基因，編碼色氨酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[18]。我們由此推測(cè)，mtr編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞外的色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，在trpR被敲除的遺傳背景下，胞內(nèi)色氨酸濃度的提高不能抑制mtr的表達(dá)。因此相比于野生型，在相同胞外色氨酸的濃度下，trpR突變體更快地提高了其胞內(nèi)的色氨酸濃度，從而表現(xiàn)出表觀上生物傳感器響應(yīng)范圍的縮小。而TnaA裂解酶可以通過分解胞內(nèi)色氨酸，延緩胞內(nèi)色氨酸的累積。與該機(jī)理吻合的是，在胞外添加效應(yīng)物4.7 h后，Mtr介導(dǎo)的胞內(nèi)色氨酸累積過程并未完全壓倒TnaA的作用(圖4)，因此trpR敲除組(B2、B3)和trpR、tnaA雙敲除組(B6、B8)顯現(xiàn)出不同的表型；到11.7 h，Mtr介導(dǎo)的胞內(nèi)色氨酸累積過程相較于TnaA，對(duì)于色氨酸的分解占據(jù)了主導(dǎo)地位，因此，B2、B3、B6和B8突變株的表型近似，即相對(duì)于野生型表現(xiàn)出響應(yīng)范圍的顯著降低。而在實(shí)際的生產(chǎn)宿主中(例如chr-trp46)，trpR和tnaA的敲除也會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)色氨酸累積量相比于野生型更快地達(dá)到峰值，從而導(dǎo)致篩選過程出現(xiàn)的假陽性。對(duì)于以上推測(cè)分子機(jī)制的進(jìn)一步確證，需要準(zhǔn)確地標(biāo)定胞外色氨酸添加后不同遺傳背景宿主細(xì)胞內(nèi)色氨酸(或者進(jìn)一步包括丙酮酸)水平隨時(shí)間的變化以及mtr基因表達(dá)量在這一過程中的動(dòng)力學(xué)特征。

2.4 本研究對(duì)于小分子生物傳感器在代謝工程中應(yīng)用的啟示和建議

需要指出的是，特定生物傳感器的響應(yīng)特性很大程度上是表觀的和唯象的，因此受到宿主遺傳背景和實(shí)際表征條件的影響。理論上，“絕對(duì)真實(shí)”的生物傳感器響應(yīng)特性曲線應(yīng)當(dāng)是胞內(nèi)代謝產(chǎn)物濃度和下游報(bào)告基因表達(dá)速度這兩個(gè)變量的關(guān)聯(lián)函數(shù)。一方面，由于胞內(nèi)代謝物濃度的快速定量相比于胞外定量方法的復(fù)雜性，目前幾乎全部文獻(xiàn)報(bào)道的生物傳感器響應(yīng)特性都基于胞外添加效應(yīng)物的方法(即使少數(shù)使用不同產(chǎn)量宿主進(jìn)行傳感器表征的文獻(xiàn)，其對(duì)于宿主代謝物產(chǎn)量的定義也基于胞外累積量)，這有別于“真實(shí)的”胞內(nèi)濃度，而宿主的遺傳背景無疑會(huì)對(duì)胞內(nèi)外代謝物的濃度關(guān)系產(chǎn)生巨大的影響，正如本文所報(bào)道的；另一方面，由于報(bào)告基因表達(dá)速度(微分形式)定量的困難，目前幾乎全部文獻(xiàn)報(bào)道的生物傳感器響應(yīng)特性都是通過報(bào)告基因累積量(積分形式)的形式進(jìn)行，誠然，這一表觀聯(lián)系在某種程度上對(duì)于實(shí)際體系的應(yīng)用更加有利(流式細(xì)胞術(shù)，或者下游遺傳線路所對(duì)應(yīng)的變量是報(bào)告基因的累積量)，但是報(bào)告基因表達(dá)累積量相比于其表達(dá)速度和更多的胞內(nèi)過程(例如蛋白質(zhì)的降解)相關(guān)聯(lián)，因此對(duì)于不同遺傳背景的魯棒性無疑也會(huì)較差，而這一點(diǎn)是目前已知文獻(xiàn)中所沒有涉及的。

考慮到本文所報(bào)道分子機(jī)制在原核生物細(xì)胞中的普遍存在，結(jié)合上文的討論，筆者認(rèn)為本文所報(bào)道的現(xiàn)象對(duì)于生物傳感器在高通量代謝工程中的應(yīng)用具有啟示意義。筆者建議：對(duì)于生物傳感器在新的宿主細(xì)胞中的再利用都需要進(jìn)行響應(yīng)特征曲線的重新標(biāo)定；同時(shí)對(duì)于相應(yīng)的失敗案例，系統(tǒng)考慮實(shí)際操作條件(胞內(nèi)累積)和響應(yīng)特征曲線標(biāo)定(胞外)包括時(shí)間尺度在內(nèi)的差異，為設(shè)計(jì)新的工程化策略提供參考。同時(shí)，也期待基于無細(xì)胞體系生物傳感器高通量表征技術(shù)[19]以及對(duì)于生物傳感器響應(yīng)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)[20]的發(fā)展可以幫助代謝工程學(xué)家更好地逼近“真實(shí)的”生物傳感器響應(yīng)特性，為其在代謝工程領(lǐng)域的利用提供更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

筆者在分子水平上報(bào)道了不同宿主遺傳背景下色氨酸生物傳感器響應(yīng)特性的差異以及這種差異對(duì)于將該傳感器應(yīng)用于代謝工程高通量篩選中可能帶來的問題。我們期待本文所報(bào)道的事實(shí)和由此提出的建議可以對(duì)生物傳感器在高通量代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用產(chǎn)生積極影響。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

GeneticbackgroundofEscherichiacoliinteractswiththeperformanceofgenetictryptophanbiosensor

WANG Tianmin1,ZHANG Chong1,2,XING Xinhui1,2

(1. Key Laboratory for Industrial Biocatalysis of the Ministry of Education,Institute of Biochemical Engineering,Department of Chemical Engineering,Tsinghua University,Beijing 100084,China; 2. Center for Syntheticand Systems Biology,Tsinghua University,Beijing 100084,China)

Genetically encoded biosensor is a category of important components of synthetic biology functional parts,and used as a powerful tool in metabolic engineering,such as screening of a mutagenesis library or genetic circuit based evolutionary engineering.Biosensor orthogonality,conventionally defined as the minimal interaction with other genetic components in host cell,is paramount to the success of such applications.However,there exist few examples exploring the potential interacting factors of the host cell with biosensor.In this work,based on the analysis of tryptophan biosensor performance in a series ofEscherichiacolihost cells with different genetic backgrounds,we identified that the TrpR regulon as well as TnaA enzyme had significant interaction with the response profile of the tryptophan biosensor.We also gave a proposed molecular model of this interaction.This work presented an example of host genetic component impairing biosensor orthogonality,which can guide us to design better strategy to utilize biosensor in metabolic engineering more reliably.

Escherichiacoli; biosensor; biosensor orthogonality; tryptophan; metabolic engineering

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.012

2017-09-26

國家自然科學(xué)基金(21376137)；清華大學(xué)自主科研項(xiàng)目(2013Z02-1)

王天民(1990—)，男，甘肅民勤人，博士研究生，研究方向：基于高通量方法的基礎(chǔ)微生物學(xué)、生物物理和代謝工程；張 翀(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:chongzhang@mail.thu.edu.cn

TQ922； Q93

A

1672-3678(2017)06-0080-07