透性化細(xì)胞海藻糖合成酶的制備及其催化合成海藻糖的工藝優(yōu)化

劉 念，高 振，趙倩如，王凱峰，郭玉欣，江 凌，周佳海

(1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學(xué) 2011學(xué)院，江蘇 南京 211800；4.中國科學(xué)院 上海有機(jī)化學(xué)研究所 生命有機(jī)化學(xué)國家重點實驗室，上海 200032)

透性化細(xì)胞海藻糖合成酶的制備及其催化合成海藻糖的工藝優(yōu)化

劉 念1，高 振2，趙倩如3，王凱峰3，郭玉欣3，江 凌1，周佳海4

(1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學(xué) 2011學(xué)院，江蘇 南京 211800；4.中國科學(xué)院 上海有機(jī)化學(xué)研究所 生命有機(jī)化學(xué)國家重點實驗室，上海 200032)

筆者以麥芽糖為底物，開展經(jīng)滲透細(xì)胞技術(shù)處理得到的透性化細(xì)胞海藻糖合成酶催化制備海藻糖的新工藝開發(fā)。首先，對比不同透性化試劑對異源表達(dá)海藻糖合成酶的大腸桿菌工程菌的透性化處理效果，發(fā)現(xiàn)使用硫酸粘桿菌素時海藻糖合成酶的催化轉(zhuǎn)化率高達(dá)64.6%，是傳統(tǒng)超聲破碎的2.63倍；其次，通過參數(shù)優(yōu)化獲得硫酸粘桿菌素透性化處理的最佳條件，即：1.5 g/L的硫酸粘桿菌素在30 ℃下處理60 min，得到的海藻糖合成酶活性最高，為5 209 U/mL；最后，利用透性化處理后的大腸桿菌工程菌進(jìn)行全細(xì)胞催化制備海藻糖工藝研究，結(jié)果表明：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的麥芽糖為底物，在pH 7.5、30 ℃條件下，獲得海藻糖的轉(zhuǎn)化率為65.6%；進(jìn)一步通過離心收集細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)催化試驗，在20批次之后，轉(zhuǎn)化率仍維持在62.5%，顯示了良好的應(yīng)用前景。

海藻糖；硫酸粘桿菌素；透性化處理；全細(xì)胞催化

海藻糖(trehalose)是一種無醛基的非還原性二糖，由兩個葡萄糖分子通過α,α-1,1-糖苷鍵相連接[1]。海藻糖具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，口感優(yōu)于蔗糖，在體內(nèi)緩慢代謝，是糖尿病患者的新一代食糖替代品；并且該糖具有優(yōu)良的抗逆保護(hù)功能，素有“生命之糖”的美譽(yù)，在食品、化妝品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用[2-5]。海藻糖的生產(chǎn)方法主要有微生物抽提法、發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法等[6]，其中，海藻糖合成酶(trehalose synthase,TreS,EC 5.4.99.16)催化麥芽糖一步轉(zhuǎn)化合成海藻糖的酶法工藝因操作簡單、原料成本低廉及催化過程不需要消耗高能物質(zhì)等優(yōu)點備受青睞[7-11]。

海藻糖合成酶屬于胞內(nèi)誘導(dǎo)型酶，傳統(tǒng)的提取工藝是先將細(xì)胞進(jìn)行破碎，經(jīng)過分離純化后才能使用。而分離純化過程操作困難、設(shè)備投資大，限制了海藻糖在工業(yè)中的應(yīng)用[12]。近年來，全細(xì)胞催化(whole-cell catalysis)技術(shù)[13-14]的出現(xiàn)為解決這一胞內(nèi)酶催化問題提供了一種新思路。在全細(xì)胞催化過程中，酶的穩(wěn)定性高，催化效率高，可重復(fù)批次進(jìn)行底物催化反應(yīng)，省去了制酶過程的繁瑣程序，使得生產(chǎn)成本大大降低。例如Zheng等[15]通過對比無水乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)和氯仿對大腸桿菌工程菌的滲透效果，最終確定以2%的氯仿透性化處理20 min效果最佳，海藻糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到55.4%。

硫酸粘桿菌素(colistin sulfate)是一種具有抗菌活性的生物表面活性劑，最早在桿屬多粘芽孢桿菌變種粘菌素(Bacilluspolymyxavar.colistinus)的培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)，對革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，作為飼料添加劑在飼料工業(yè)中已被廣泛采用[16]。

本文中，筆者針對目前生產(chǎn)海藻糖的方法，在實驗室已經(jīng)構(gòu)建的異源表達(dá)TreS的大腸桿菌工程菌基礎(chǔ)上，探索一種更加高效的全細(xì)胞催化合成海藻糖的方法，以期為實現(xiàn)海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供新思路。筆者通過對比硫酸粘桿菌素、EDTA、氯仿和無水乙醇對表達(dá)海藻糖合成酶的大腸桿菌工程菌的透性化處理效果，以獲得最佳的透性試劑，并對其處理細(xì)胞的濃度、溫度和時間進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，進(jìn)而進(jìn)行全細(xì)胞催化制備海藻糖工藝研究，以期獲得最佳的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

異源表達(dá)海藻糖合成酶的重組大腸桿菌BL21工程菌(EscherichiacoliBL21)，由筆者所在實驗室成員構(gòu)建保存[7]。

1.2 主要試劑

葡萄糖、麥芽糖、海藻糖，德國Sigma公司；酵母粉、蛋白胨，英國OXOID公司；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，生工生物工程(上海)股份有限公司；硫酸粘桿菌素，Ruibio公司。

1.3 主要設(shè)備

SW-CJ-1B(U)型生物凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；HYL-A型恒溫?fù)u床，太倉市強(qiáng)樂實驗設(shè)備廠；GA88-II型超聲破碎儀，無錫上佳生物科技有限公司；UltiMate 3000型戴安高效液相色譜儀，美國Dionex公司；RI-101型示差折光檢測器，Shodex公司。

1.4 主要溶液及培養(yǎng)基的配制

IPTG(1 mmol/L)：2 g IPTG溶于10 mL無菌水，水濾膜過濾除去雜菌，在-20 ℃貯存。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂20。

1.5 實驗方法

1.5.1 菌種活化

在LB固體培養(yǎng)基中(含50 mg/L的氨芐青霉素(Amp))，采用劃線法培養(yǎng)菌種12 h，獲得重組大腸桿菌BL21的單菌落。挑取單菌落，在加氨芐的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化， 在37 ℃、200 r/min條件下活化12 h。

1.5.2 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)

接種體積分?jǐn)?shù)1.5%活化的菌液到新的LB液體培養(yǎng)基(含50 mg/L的Amp)中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)1 h后，每隔2 h取2 mL菌液進(jìn)行OD600的測定，在OD600達(dá)到0.6～0.8時加入誘導(dǎo)劑。在錐形瓶中，加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為0.8 mmol/L，在37 ℃、200 r/min的搖床中誘導(dǎo)8 h。

1.5.3 傳統(tǒng)超聲法破碎細(xì)胞

誘導(dǎo)結(jié)束后，使用50 mL離心管，在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min后棄上清。用0.04 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸底細(xì)胞，重復(fù)操作2次，離心后得到重組大腸桿菌的濕菌體。將濕菌體用等體積的PBS重懸，在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎(工作時間4 s，間隔時間4 s，總工作時間5 min)，破碎后在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，上清液用于合成海藻糖。

1.5.4 制備通透性的重組大腸桿菌

分別加入相同濃度的硫酸粘桿菌素、氯仿、無水乙醇和EDTA對濕菌體進(jìn)行處理，并做空白對照。處理條件：30 ℃、200 r/min的搖床中處理60 min。在200 r/min條件下，考察不同濃度的硫酸粘桿菌素、不同的處理溫度和時間對細(xì)胞通透性的影響。處理后的菌液在6 000 r/min離心10 min后棄上清，用PBS洗滌2次，并用1/2體積的PBS重懸，使菌體濃度固定在10%。

1.5.5 測定酶活

稱取5.4 g麥芽糖，用100 mL的PBS溶解，使其終濃度為150 mmol/L。用移液槍取200 μL的細(xì)胞懸浮液和800 μL的麥芽糖溶液，在2 mL離心管中混勻，每組做3個平行樣品。讓該1 mL體系在25 ℃條件下反應(yīng)30 min，對其進(jìn)行煮沸處理，滅酶10 min。冷卻后，在6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，用于海藻糖含量的測定。酶活力單位的定義：在25 ℃條件下，每1 min生成1 nmol海藻糖所消耗的海藻糖合成酶的量為1個酶活力單位。

1.5.6 全細(xì)胞催化反應(yīng)

在最佳透性化處理細(xì)胞的基礎(chǔ)上，稱取30.0 g麥芽糖，用PBS溶解定容到100 mL，使其終濃度為30%。10 mL的通透性處理細(xì)胞懸浮液和40 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的麥芽糖底物裝于250 mL錐形瓶中，每組做3個平行樣品。讓該反應(yīng)體系在30 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)24 h，對其進(jìn)行煮沸處理，滅酶10 min，并探究pH、反應(yīng)溫度和底物濃度對全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響。轉(zhuǎn)化率的計算見式(1)。

(1)

1.5.7 高效液相色譜法(HPLC)測定產(chǎn)物和底物

使用HPLC測定樣品的產(chǎn)物、底物和副產(chǎn)物。測定條件是V(乙腈)∶V(水)=8∶ 2組成流動相，流速為0.6 mL/min，層析柱為氨基柱(柱溫35 ℃)，選擇ShodexRI101視差折光檢測器。配制麥芽糖、葡萄糖和海藻糖的質(zhì)量濃度分別是1、2、3、4和5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.22 μm的過濾膜除去雜質(zhì)，裝入專用的自動進(jìn)樣瓶中，HPLC進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同透性化試劑對大腸桿菌工程菌進(jìn)行透性化處理效果的對比

在細(xì)胞懸浮液中分別加入相同濃度的硫酸粘桿菌素、無水乙醇、氯仿和EDTA，在30 ℃、200 r/min條件下對重組大腸桿菌進(jìn)行通透處理60 min。反應(yīng)結(jié)束后，測定上清液中的海藻糖含量，并與傳統(tǒng)超聲破碎法進(jìn)行對比，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同透性試劑處理對海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effects of permeabilization treatment on the conver-sion yield of trehalose by various reagents

由圖1可知：經(jīng)過傳統(tǒng)超聲破碎得到的海藻糖轉(zhuǎn)化率僅有24.6%，而經(jīng)過透性化處理的細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)得到的海藻糖轉(zhuǎn)化率最高是64.6%，是傳統(tǒng)超聲破碎的2.63倍。這不僅大大提高了轉(zhuǎn)化效率，同時避免了細(xì)胞破碎過程中酶使用效率不高、酶易失活及分離純化壓力大等缺點[15]。

使用未經(jīng)過透性化處理的細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，海藻糖的轉(zhuǎn)化率僅為0.9%，這是因為細(xì)胞膜對反應(yīng)體系的傳質(zhì)起天然屏障作用；同時說明，用不同化學(xué)試劑處理均能對細(xì)胞的通透性產(chǎn)生影響，只是效果有所不同。例如，利用無水乙醇和EDTA處理時的海藻糖轉(zhuǎn)化率很低，可能是因為二者對細(xì)胞的破壞性較大、毒性強(qiáng)，直接導(dǎo)致酶活喪失，沒有海藻糖的生成；而氯仿和硫酸粘桿菌素可以作用在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的脂類結(jié)構(gòu)，尤其是溶解了細(xì)胞膜上的磷脂層，增加了細(xì)胞的通透性，海藻糖的轉(zhuǎn)化率高[17]。但是，氯仿是化學(xué)試劑，對人體有害，存在食品安全隱患，用它處理細(xì)胞過程也容易造成環(huán)境污染，更會增加海藻糖的后續(xù)分離的壓力。因此，選用硫酸粘桿菌素作為透性化處理的試劑，不僅催化效率高、無污染，而且安全性能好，適合工業(yè)化生產(chǎn)[18]。

2.2 通透性處理重組大腸桿菌實驗參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 通透性處理試劑的最佳濃度

在25 ℃、200 r/min條件下，用不同濃度0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 g/L的硫酸粘桿菌素處理重組大腸桿菌60 min，結(jié)果如圖2所示。

圖2 硫酸粘桿菌素質(zhì)量濃度對細(xì)胞通透性的影響Fig.2 Effects of colistin sulfate concentrationson cell permeability

由圖2可知：隨著硫酸粘桿菌素質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，細(xì)胞的通透性增大，有利于小分子物質(zhì)的進(jìn)出，提高酶催化反應(yīng)的效率；但是，隨著硫酸粘桿菌素濃度的增加，細(xì)胞的活力下降，這可能是因為細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂分子表面的負(fù)電荷和硫酸粘桿菌素所帶的正電荷形成靜電吸附，擾亂了脂質(zhì)和質(zhì)膜蛋白的排列順序，進(jìn)而破壞了細(xì)胞膜的有序結(jié)構(gòu)，使得菌體溶解，失去了細(xì)胞膜的保護(hù)作用，從而使海藻糖合成酶的活性大大降低[15]。

2.2.2 通透性處理的最佳時間

在25 ℃、200 r/min條件下，在細(xì)胞懸浮液中加入1.5 g/L的硫酸粘桿菌素對重組大腸桿菌進(jìn)行通透處理，處理時間分別是0、30、60、90、120和150 min，結(jié)果如圖3所示。

圖3 硫酸粘桿菌素處理時間對細(xì)胞通透性的影響Fig.3 Effects of colistin sulfate treatment timeon cell permeability

由圖3可知：隨著處理時間的延長，細(xì)胞的通透性加大，進(jìn)而使得細(xì)胞活力提高。隨后，由于處理時間繼續(xù)延長，細(xì)胞活力反而下降，這是因為細(xì)胞膜表面和硫酸粘桿菌素形成的離子通道激增，使得滲透壓改變，水會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞發(fā)生溶脹破裂，部分海藻糖合成酶會從細(xì)胞中釋放出來，使得胞內(nèi)檢測到的酶活有所下降[15]。

2.2.3 通透性處理的最適溫度

在200 r/min條件下，在細(xì)胞懸浮液中加入1.5 g/L的硫酸粘桿菌素，對重組大腸桿菌進(jìn)行通透性處理60 min，處理溫度分別是25、28、30、35和40 ℃，結(jié)果如圖4所示。

圖4 處理溫度對細(xì)胞通透性的影響Fig.4 Effects of colistin sulfate treatment temperatureon cell permeability

由圖4可知：隨著處理溫度的升高，海藻糖合成酶的活性迅速增加，最高酶活達(dá)5 209 U/mL。這是因為適當(dāng)?shù)靥岣邷囟瓤梢允姑傅幕钚宰兏?。但隨著溫度的升高，酶活下降，其原因可能是較高的處理溫度會使蛋白質(zhì)失活和細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生位移，導(dǎo)致酶失活[19]。

2.3 全細(xì)胞催化工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 全細(xì)胞催化的最佳pH

利用透性化處理后的大腸桿菌工程菌，在30 ℃、200 r/min條件下，用PBS溶液配制pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麥芽糖溶液作為底物，進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，測定該上清液中的海藻糖含量，以確定全細(xì)胞反應(yīng)的最佳pH，結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH對海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effects of pH on the conversion yield of trehalose

由圖5可知：當(dāng)反應(yīng)pH在7.5時，海藻糖的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到65.7%，是海藻糖合成酶催化反應(yīng)的最適值。當(dāng)pH過高或過低時都不利于海藻糖合成酶的催化，這是由于pH影響著酶蛋白的等電點和空間結(jié)構(gòu)，合適的pH能夠高效促進(jìn)酶分子的催化效率[20]。

2.3.2 全細(xì)胞催化的最佳溫度

利用透性化處理后的大腸桿菌工程菌，在200 r/min條件下進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)24 h。底物是PBS配制的pH 7.5、質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的麥芽糖溶液，實驗溫度分別為15、20、25、30、35、40和45 ℃，反應(yīng)結(jié)束后，測定該上清液中的海藻糖含量，以確定全細(xì)胞反應(yīng)的最佳溫度，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effects of temperature on the conversionyield of trehalose

由圖6可知：隨著溫度的升高，海藻糖的轉(zhuǎn)化率升高。當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到65.5%；而后隨著溫度的進(jìn)一步升高，轉(zhuǎn)化率反而下降。這是因為溫度對酶活的影響使得海藻糖產(chǎn)量迅速下降。最終選擇30 ℃作為全細(xì)胞催化反應(yīng)的最適溫度。本工藝采用的催化溫度與產(chǎn)酶發(fā)酵溫度相同，對于全細(xì)胞催化十分有利，保證細(xì)胞活性的同時，便于發(fā)酵工段和催化工段的快速銜接，縮短了生產(chǎn)間歇時間，進(jìn)一步提高了生產(chǎn)效率。

2.3.3 全細(xì)胞催化的最佳底物濃度

利用透性化處理后的大腸桿菌工程菌，在30 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)24 h。底物是PBS配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、25%、30%、35%和40%的麥芽糖溶液(pH 7.5)。反應(yīng)結(jié)束后，測定該上清液中的海藻糖含量，以確定全細(xì)胞反應(yīng)的最佳底物濃度，結(jié)果如圖7所示。

圖7 麥芽糖底物濃度對海藻糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effects of substrate concentration on theconversion yield of trehalose

由圖7可知：隨著麥芽糖濃度的增加，海藻糖的轉(zhuǎn)化率先上升后下降，這說明高濃度的底物濃度會對全細(xì)胞催化反應(yīng)有抑制的趨勢，同時降低海藻糖的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。因此，選用25%的麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為最佳底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前已公開報道的同類研究中，催化底物麥芽糖的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)大都在5%～10%[15]，相比而言，本研究采用的高底物濃度有利于提高海藻糖的整體工藝生產(chǎn)強(qiáng)度[19]。

2.4 全細(xì)胞催化的重復(fù)使用批次考察

為了考察重組大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)海藻糖合成酶的酶活保持能力，把重組大腸桿菌離心收集重復(fù)使用，考察每批反應(yīng)體系中海藻糖的轉(zhuǎn)化率。用PBS配制pH為7.5的25%麥芽糖溶液為底物，在30 ℃、200 r/min條件下，每批次反應(yīng)24 h，共考察20批次，結(jié)果如圖8所示。

圖8 全細(xì)胞催化反應(yīng)的使用批次考察Fig.8 The using batch of the whole cell catalysis

由圖8可知：海藻糖的轉(zhuǎn)化率基本保穩(wěn)定略降的趨勢。首批轉(zhuǎn)換率最高為65.6%，該轉(zhuǎn)化率與已公開報道的最高的TreS催化的底物轉(zhuǎn)化率的水平相當(dāng)(60%～70%)[7-8]。然而，全細(xì)胞催化20批次后，還可以保留62.5%的較高轉(zhuǎn)化率，高于部分同行研究的轉(zhuǎn)化率[21]。

3 結(jié)論

本文中，筆者通過對比無水乙醇、氯仿、EDTA和硫酸粘桿菌素4種透性試劑對表達(dá)海藻糖合成酶的大腸桿菌工程菌的處理效果，發(fā)現(xiàn)使用硫酸粘桿菌素時海藻糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)64.6%，是傳統(tǒng)超聲破碎的2.63倍。經(jīng)過氯仿處理的海藻糖轉(zhuǎn)化率能達(dá)到46.9%，但是由于氯仿的毒害作用，限制其在食品行業(yè)的應(yīng)用；其次，通過參數(shù)優(yōu)化獲得硫酸粘桿菌素透性化處理的最佳條件，即：1.5 g/L的硫酸粘桿菌素在30 ℃條件下處理60 min，得到的海藻糖合成酶活性最高，為5 209 U/mL；最后，利用透性化處理后的大腸桿菌工程菌進(jìn)行全細(xì)胞催化制備海藻糖工藝研究，結(jié)果表明：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的麥芽糖為底物，在pH 7.5、30 ℃條件下，獲得的海藻糖轉(zhuǎn)化率為65.6%；進(jìn)一步通過離心收集細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)催化試驗，在20批次之后，轉(zhuǎn)化率仍維持在62.5%，顯示了良好的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯 管珺)

Optimizationoftrehalosesynthesisbywholecellcatalysisandpreparationoftrehalosesynthasefrompermeablecells

LIU Nian1,GAO Zhen2,ZHAO Qianru3,WANG Kaifeng3,GUO Yuxin3,JIANG Ling1,ZHOU Jiahai4

(1.College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China; 2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;3.College of 2011,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;4.State Key Laboratory of Bioorganic and NaturalProducts Chemistry，Shanghai Institute of Organic Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200032，China)

Maltose is used as the substrate to synthesize trehalose using a novel whole-cell catalysis strategy with trehalose synthase expressed inside the cells ofEscherichiacoli.First,comparing the effect of different permeability agents on recombinedE.coli,we found that the conversion rate of trehalose reached 64.6% with colistin sulfate, 2.63 times higher than that of traditional ultrasonic crushing method.Second,we optimized parameter of permeation treatment.Results show that the highest activity of trehalose synthase was 5 209 U/mL when using 1.5 g/L colistin sulfate as the permeability agent,reacting for 60 min at 30 ℃.Last, the conditions for the whole-cell catalytic reaction were investigated as well.The conversion rate of trehalose was 65.6% at pH 7.5 and 30 ℃,with 25% maltose as the substrate.The conversion rate of trehalose almost kept stable and remained 62.5% even after 20 batches,which showed a good application prospect.

trehalose; colistin sulfate; permeability treatment; whole-cell catalysis

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.010

2017-08-30

國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金(U1603112)；生命有機(jī)化學(xué)國家重點實驗室開放課題(SKLBNPC15429)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項目(14KJB530002)；江蘇省博士后科研資助計劃(1401009A)

劉 念(1994—)，男，天津?qū)氎嫒耍芯糠较颍菏称房茖W(xué)；江 凌(聯(lián)系人)，研究員， E-mai:jiangling@njtech.edu.cn

TQ925

A

1672-3678(2017)06-0068-06