奇臺黑堿土可培養(yǎng)細菌的分離及抑制黑色素合成活性菌株的篩選

付建紅， 楊新平，謝 芹，仲曉燕，張婉昕，甘 甜

(1.新疆師范大學 生命科學學院 新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調控重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆農業(yè)科學院 微生物應用研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

奇臺黑堿土可培養(yǎng)細菌的分離及抑制黑色素合成活性菌株的篩選

付建紅1， 楊新平2，謝 芹1，仲曉燕1，張婉昕1，甘 甜1

(1.新疆師范大學 生命科學學院 新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調控重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆農業(yè)科學院 微生物應用研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

黑堿土也稱為堿化鹽土，形成原因十分復雜，改良也很困難，但是這種高鹽環(huán)境為嗜鹽堿菌、耐鹽堿菌的研究提供了得天獨厚的條件。本研究中，筆者采用平板稀釋法從新疆奇臺黑堿土中分離獲得95個細菌菌株，通過建立的用比基尼鏈霉菌CPCC200555為鑒定菌的黑色素生物合成抑制劑篩選模型，從分離菌株的285個次級代謝產(chǎn)物樣品中篩選出21株細菌，其代謝產(chǎn)物對黑色素合成有較強的抑制活性，其中，15株細菌代謝物對蘑菇酪氨酸酶也有明顯的抑制活性。本研究為篩選用作美白化妝品的添加劑和治療皮膚黑色素瘤藥物的黑色素生物合成抑制劑奠定科學基礎。

耐鹽堿菌；分離；黑色素合成抑制劑；蘑菇酪氨酸酶抑制劑

新疆地處歐亞大陸腹地，降雨量稀少，蒸發(fā)強烈，是我國最為干旱、土壤鹽堿化分布面積最廣、鹽堿化類型最多以及土壤積鹽最重的地區(qū)。因此被稱為“世界鹽堿土的博物館”[1]。

目前，鹽堿化程度比較嚴重的黑堿土在新疆的分布面積還沒有精確的統(tǒng)計，但就奇臺縣坎爾孜鄉(xiāng)西三村新疆農科院奇臺試驗站附近零星分布的黑堿土來說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其對作物危害很大，一般作物幾乎不能在此生長。這種獨特的生態(tài)環(huán)境為耐鹽堿微生物的生長繁殖創(chuàng)造了有利條件，長期的選擇壓力使這些微生物演化形成適應環(huán)境脅迫的機制，能產(chǎn)生特殊性質的生物活性物質。

人體局部黑色素沉著如痣、雀斑，影響人的美觀及身心健康，嚴重的如黑色素瘤還危及生命。因此，篩選黑色素生物合成抑制劑用作化妝品及藥品有著良好的前景。目前，為了從微生物中尋找新的黑色素合成抑制劑，已先后從霉菌和鏈霉菌中分離到一些有效物質，但是為數(shù)不多。Imae等[2]報道：在利用指示菌比基尼鏈霉菌NRRL B-1049篩選黑色素生物合成抑制劑過程中，分別從鏈霉菌StreptomycescalvusNo.N924-1和StreptomycesclaviferNo.N924-2的發(fā)酵液中分離出新的化合物BMY-28565和BMY-28566。Komiyama等[3]從Streptomycessp. OH-3984的發(fā)酵液中分離出了新的黑色素生物合成抑制劑 OH-3984K1 和K2。Takamatsu等[4]研究了OH-3948K1和K2的理化特性和結構。Lee等[5-6]從木霉Trichodermaharzianum的發(fā)酵液中分離出了新的黑色素合成抑制劑MR566A 和MR566B，并對其分類、發(fā)酵、分離、生物學特性和理化特性、結構式鑒定進行了研究。鄭榕等[7]從棘孢小單孢福建亞種No.80-A18(Micromonosporaechinosporasubsp.fujianensis)的發(fā)酵液中提取黑色素生物合成抑制劑MA-18，經(jīng)過純化和理化性質鑒別，根據(jù)元素分析、EI-MS 和13C核磁共振(NMR)的結果，確定了其分子式。目前，已報道的具有抑制黑色素合成功能的菌株都不是極端微生物菌株，從鹽堿土的細菌資源中獲得具有抑制黑色素生物合成活性的耐鹽堿菌株尚未見報道。

本研究中，筆者應用產(chǎn)生黑色素的鏈霉菌為指示菌，通過分離的耐鹽堿細菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物直接抑制其產(chǎn)生黑色素的方法篩選黑色素生物合成抑制劑，同時檢測其對酪氨酸酶的抑制活性，以探究黑色素合成抑制劑的抑制機理和抑制劑的結構鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗指示菌及樣品來源

比基尼鏈霉菌CPCC200555由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所菌種中心提供。

供試土壤為2014年10月采自奇臺縣坎爾孜鄉(xiāng)西三村新疆農科院奇臺試驗站附近的土壤樣品。分別在有少量植被和無植被的地帶采集地表和地下20 cm土層的土壤樣品，去除根系、石塊等雜物，將土壤樣品裝入牛皮紙袋中帶回實驗室，保存于4 ℃冰箱中。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基

1)改良CM培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白5 ，酵母粉10，NaCl 50，胰蛋白胨 5，KCl 2，檸檬酸三鈉3，MgSO4·7H2O 20;pH 7.5。

2)改良LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 50；pH 7.0。

3)Horikoshi培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10，蛋白胨 5，酵母浸出物 5，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.2，Na2CO310，NaCl 50；pH 9.0。

1.2.2 分離培養(yǎng)基

1)GW1培養(yǎng)基(g/L)：干酪素0.3，甘露醇1，NaCl 100，NaHCO32，CaCO30.2，(NH4)2SO42，KNO32，K2HPO41，MgSO4·7H2O 2，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂20；另加微量鹽溶液1 mL。

2)改良ISP5培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出物5，K2HPO41，甘油1，KNO35，L-天門冬酰胺1，NaCl 100，瓊脂12；pH 7.0～7.4。

3)改良CM培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白5，酵母粉10，NaCl 50，胰蛋白胨5，KCl 2，檸檬酸三鈉3，MgSO4·7H2O 20，瓊脂18；pH 7.5。

4)Horikoshi培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10，蛋白胨 5，酵母浸出物 5，K2HPO41，MgSO4·7H2O0.2，Na2CO310，NaCl 50，瓊脂18；pH 9.0。

細菌種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)用的培養(yǎng)基同富集培養(yǎng)基。

1.2.3 Papavizas′ VDYA固體培養(yǎng)基

V-8蔬菜汁液20 mL，葡萄糖 2 g/L，酵母提取物 2 g/L，CaCO31 g/L，瓊脂20 g/L；pH 7.2。

1.2.4 ISP7瓊脂培養(yǎng)基

蛋白胨 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，細菌-酵母提取物 2 g/L，酪氨酸 5 g/L，瓊脂 20 g/L；pH 7.6。

1.3 試劑與儀器

丁基羥基茴香醚(BHA，AR)、二甲基亞砜(AR)、曲酸(AR)、L-多巴(AR)、蘑菇酪氨酸酶(BR)，Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、丙酮、NaH2PO4、Na2HPO4·12H2O等均為市售國產(chǎn)分析純。

FA2204N型電子天平，上海菁華儀器有限公司；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-LF-1FD型超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；ZWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ш型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；BG-80型隔水式培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；GL-20GH型離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-2800H型紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司。

1.4 黑堿土中細菌的分離純化

分別稱取采集的土樣5 g置于100 mL不同的富集培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 d進行耐鹽堿微生物的富集。然后將富集的菌懸液采用稀釋平板分離法涂布于不同的分離培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)3～15 d，待菌落長出后，根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色進行初步篩選，再經(jīng)反復劃線分離純化后，接種于斜面培養(yǎng)基4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細菌發(fā)酵及其次生代謝產(chǎn)物的提取分離

將分離到的細菌接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。以1%(體積分數(shù))接種量轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48～72 h。

獲得的細菌發(fā)酵液于4 ℃、6 000 r/min離心20 min，分別收集上清液和菌體沉淀。

1)上清液：加等體積乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并萃取液后減壓濃縮，用少量的5%二甲基亞砜溶液溶解得樣品Ⅰ，4 ℃冷藏備用；

2)菌體：用等體積的60%丙酮水溶液懸浮菌體沉淀，超聲波破碎細胞，再浸提5 h，低溫離心。上清液中加等體積乙酸乙酯萃取2次，分別收集乙酸乙酯萃取相(樣品Ⅱ)和丙酮溶液萃取相(樣品Ⅲ)，經(jīng)減壓蒸餾得浸膏狀物質，加少量二甲基亞砜溶解，4 ℃冷藏備用。

1.6 細菌次生代謝產(chǎn)物對比基尼鏈霉菌黑色素合成的抑制活性

參照文獻[8-10]將比基尼鏈霉菌CPCC200555接種到Papavizas′VDYA平板上，28 ℃培養(yǎng)2周，制備孢子懸液。將鏈霉菌孢子懸液定量加入到ISP7瓊脂平板上，用玻璃棒刮勻。干燥后，將不同的細菌代謝產(chǎn)物樣品浸泡過的、直徑6 mm紙碟放置在平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d后，從平板背面觀察測量黑色素抑制圈，以1 000 μg/mL丁基羥基茴香醚為黑色素合成抑制劑的陽性對照。

1.7 細菌次生代謝產(chǎn)物對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性

以L-多巴為底物，參照文獻[11-12]報道的方法進行酪氨酸酶活性的抑制率測定。用含5%二甲基亞砜的磷酸鹽緩沖液配制一定濃度的細菌代謝提取物溶液。按表1精確吸取代謝物溶液、pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液和濃度為1.0 mmol/L的L-多巴溶液，充分混合，于30 ℃下水浴10 min后，加入酪氨酸酶溶液(150 U/mL) ，再水浴反應15 min，迅速轉移至比色皿中，在475 nm處測定各反應液吸光度值，按式(1)計算抑制率。陽性對照以曲酸代替細菌代謝物，空白對照為含5%二甲基亞砜磷酸鹽緩沖液。

(1)

式中：A1為酪氨酸酶催化氧化L-多巴溶液產(chǎn)生黑色素的吸光度值；A2為L-多巴溶液的吸光度值；B1為酪氨酸酶活性受代謝物抑制后溶液的吸光度值；B2為代謝物的吸光度值。

表1 反應液組成

2 結果與討論

2.1 黑堿土中細菌的分離純化

從奇臺采集黑堿土樣品4份，分別用3種富集培養(yǎng)基和4種分離培養(yǎng)基，采用稀釋平板涂布法分離細菌。最終從本次采集的樣品中分離到95株純培養(yǎng)物，結果如表2和3所示。

表2 不同富集培養(yǎng)基分離菌株的結果

從表2可出：不同富集培養(yǎng)基的分離效果不同，改良CM富集培養(yǎng)基(1號)和LB培養(yǎng)基(2號)分離到的菌落較多，而Horikoshi培養(yǎng)基(3號)上菌落形成單位少，說明土壤樣品中可培養(yǎng)細菌以耐鹽菌為主，耐堿菌相對較少。

表3 不同分離培養(yǎng)基分離菌株的結果

從表3可以看出：改良CM分離培養(yǎng)基(3號)分離到的菌落數(shù)量要遠遠多于其他分離培養(yǎng)基，占細菌總數(shù)的61%?？梢姡牧糃M培養(yǎng)基的分離效果最好，且分離到的菌株大多為耐鹽細菌。

從各土樣的分離結果看，無植被的地下20 cm土層中可培養(yǎng)細菌最豐富(占32.6%～33.7%)，而有少量植被的地表土層中細菌數(shù)量最少(占16.8%～17.9%)。這可能與土壤中鹽分分布格局有關，土層越深，含鹽量越低，則細菌數(shù)量越多。

2.2 細菌次生代謝產(chǎn)物對比基尼鏈霉菌合成黑色素的抑制

將待篩選的95株細菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵后按照胞外和胞內產(chǎn)物以及提取方式的不同，共獲得285個次級代謝產(chǎn)物樣品，這些樣品分別用比基尼鏈霉菌篩選模型進行篩選。通過比較抑制圈直徑的大小，從中選得21株抑制圈直徑較大的黑色素生物合成抑制劑產(chǎn)生菌株。圖1顯示了在ISP7瓊脂培養(yǎng)基上，篩選出的陽性菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物抑制比基尼鏈霉菌CPCC200555形成黑色素的情況。表4為黑堿土中篩選得到的菌株產(chǎn)黑色素生物合成抑制劑的情況。

從表4可以看出：21株具有黑色素生物合成抑制活性的菌株耐鹽能力不同，其中8株菌是從2號分離培養(yǎng)基分離出來的，能耐受100 g/L NaCl，屬于中度耐鹽菌；12株菌是從3號分離培養(yǎng)基分離出來的，能耐受50 g/L NaCl，屬于輕度耐鹽菌。還有1株菌B6 -1②B是從4號分離培養(yǎng)基分離出來的，既能耐受50 g/L NaCl，又能在pH 9.0的環(huán)境下生長，屬于耐鹽堿菌。

圖1 陽性菌株產(chǎn)生的次生代謝物抑制比基尼鏈霉菌形成黑色素抑制圈Fig.1 The resulting zone of inhibition of melanin formation of Streptomyces bikiniensis from thepositive strain for the metabolites

菌株編號樣品編號抑制圈直徑/mm菌株編號樣品編號抑制圈直徑/mmB53①R樣品Ⅰ28B53②Ⅰ樣品Ⅰ11B23①樣品Ⅰ26B52①R樣品Ⅱ11B52③樣品Ⅲ23B51⑥Y樣品Ⅱ10B23③樣品Ⅲ19B53④樣品Ⅰ10B52①樣品Ⅰ15B53②B樣品Ⅱ10B53②樣品Ⅰ15B23⑤樣品Ⅲ9B51⑥A樣品Ⅲ145B23②樣品Ⅱ8B22③樣品Ⅰ13B21①樣品Ⅰ8B51⑥B樣品Ⅰ13B53⑤B樣品Ⅲ8B61②B樣品Ⅰ11B22②樣品Ⅲ8BHA陽性對照8B21③樣品Ⅱ8

2.3細菌次生代謝產(chǎn)物對蘑菇酪氨酸酶的抑制活性

酪氨酸酶是黑色素生物合成的主要限速酶，黑色素合成量與酪氨酸酶的活性呈正相關，其活力可控制黑色素生成量，抑制酪氨酸酶活性可減少黑色素生成。一般情況下，能強烈抑制酪氨酸酶的物質也能抑制比基尼鏈霉菌的黑色素形成。應用蘑菇酪氨酸酶法篩選對比基尼鏈霉菌的黑色素形成和蘑菇酪氨酸酶都有抑制作用的抑制劑，為進一步探究黑色素合成抑制劑的抑制機理、鑒定其化學結構以及開發(fā)其應用價值提供理論依據(jù)。

參照文獻[11-12]報道的方法，在475 nm處測定各反應液的吸光度值，計算細菌代謝產(chǎn)物對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制率。實驗結果發(fā)現(xiàn)，抑制比基尼鏈霉菌黑色素生物合成的21株活性菌株中有15株細菌的代謝產(chǎn)物也能抑制酪氨酸酶的活性，表現(xiàn)為能強烈抑制酪氨酸酶活性的代謝產(chǎn)物也能很強地抑制比基尼鏈霉菌的黑色素形成，如菌株B2-3①樣品Ⅰ(95.9%)、菌株B5-3①R樣品Ⅰ(92.98%)和菌株B5-2 ③樣品Ⅲ(92.86%)。此外，抑制率達70%以上的菌株有B6-1②B樣品Ⅰ(80.59%)、菌株B2-3②樣品Ⅱ(86.7%)、菌株B5 -1⑥B樣品Ⅰ(72.6%)、菌株B5-2①R樣品Ⅱ(82.49%)、菌株B5-3②樣品Ⅰ(86.43%)、菌株B2-2②樣品Ⅲ(73.1%)、菌株B2-3③樣品Ⅲ(87.68%)、菌株5-1⑥A樣品Ⅲ(80.05%)。

在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)有8株細菌的代謝產(chǎn)物對比基尼鏈霉菌的黑色素有抑制作用，但對蘑菇酪氨酸酶卻沒有抑制作用，推測它們可能是縮肽類抗生素，通過抑制酪氨酸酶的產(chǎn)生抑制黑色素形成，而對酪氨酸酶的酶催化反應無影響[5,13]。這類物質可能抑制了某種激素，通過有關的信號通路下調酶基因的表達，從而間接抑制酪氨酸酶的含量[14]。

3 結論

1)本研究通過稀釋平板法從新疆奇臺黑堿土中分離獲得95株耐鹽堿細菌。

2)采用比基尼鏈霉菌篩選模型，從耐鹽堿細菌中篩選出的21株細菌可產(chǎn)生對黑色素合成有抑制活性的代謝物質，進一步研究其對蘑菇酪氨酸酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)15株細菌的代謝產(chǎn)物對蘑菇酪氨酸酶和比基尼鏈霉菌的黑色素形成都有抑制作用。

本研究篩選出的黑色素合成抑制劑能否抑制小鼠B16黑色素瘤細胞的黑色素合成，能否從細菌發(fā)酵產(chǎn)物中尋找到能有效祛除及減輕皮膚局部色素沉著且毒性較低的化合物，作為造福于人類的治療新藥和美容佳品值得進一步研究。

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(責任編輯 荀志金)

Isolationofculturablebacteriafromsaline-alkalisoilinQitaiandscreeningofstrainsofinhibitingmelaninbiosynthesis

FU Jianhong1,YANG Xinping2,XIE Qin1,ZHONG Xiaoyan1,ZHANG Wanxin1,GAN Tian1

(1.Key Laboratory of Species Diversity Application and Control in Xinjiang,College of Life Science,Xinjiang Normal University,Urumqi 830054,China; 2.Applied Microbiology Institute,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830011,China)

Black alkali soil is called alkalized solonchak.The soil-farming process is very complex and the soil improvement is very difficult.However,black alkli soil provides a unique condition to study of haloalkalophilic bacteria and haloalkalo-resistant bacteria.Using dilution-plate method,95 bacteria strains were isolated and purified from the black alkali soil collected in Qitai,Xinjiang.In total 285 secondary metabolites of 95 strains were screened for their melanin formation inhibition,withStreptomycesbikiniensisCPCC200555(a melanin-producer) as a screening model.Metabolites of 21 strains strongly inhibited melanin formation inS.bikiniensisCPCC200555.The metabolites of the 15 strains among the above strains showed inhibitory activity against mushroom tyrosinase.Our findings provide references for exploring melanin synthesis inhibitors with potential use in cosmetics and drug.

haloalkaloresistant bacteria; isolation; melanin synthesis inhibitors; mushroom tyrosinase inhibitors

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.011

2017-09-27

國家自然科學基金(31260213)

付建紅(1970—)，女，河南平輿人，博士，教授，研究方向：特殊環(huán)境微生物多樣性及其代謝產(chǎn)物活性，E-mail：fjh_719@163.com

Q936

A

1672-3678(2017)06-0074-06