微生物細(xì)胞CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展

張 燦，楊高華，姜衛(wèi)紅，顧 陽

(1. 中國(guó)科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所，上海 200032；2. 中國(guó)科學(xué)院 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

微生物細(xì)胞CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展

張 燦1,2*，楊高華1,2*，姜衛(wèi)紅1,2，顧 陽1,2

(1. 中國(guó)科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所，上海 200032；2. 中國(guó)科學(xué)院 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

CO2是自然界儲(chǔ)量巨大的游離性碳資源。關(guān)于CO2的生物轉(zhuǎn)化，除了我們所熟知的植物光合作用外，許多微生物亦具備此能力。微生物利用CO2的首要步驟是完成CO2從細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這也是決定微生物CO2利用效率的重要環(huán)節(jié)。本文中，筆者對(duì)目前微生物CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，重點(diǎn)闡述了各類微生物CO2運(yùn)輸元件及其工作的分子機(jī)制以及通過優(yōu)化CO2轉(zhuǎn)運(yùn)提高微生物利用CO2能力的策略。在此基礎(chǔ)上，筆者還提出了今后微生物轉(zhuǎn)化利用CO2的研究重點(diǎn)和關(guān)鍵科學(xué)問題，可為未來通過生物路線實(shí)現(xiàn)CO2的資源化利用提供借鑒。

微生物；CO2；跨膜運(yùn)輸；轉(zhuǎn)運(yùn)子；分子機(jī)制

長(zhǎng)期以來，來源于糧食作物的糖基原料一直是微生物發(fā)酵的主要碳源，未來發(fā)展趨勢(shì)是以更為廉價(jià)的碳資源結(jié)合高效的重組微生物作為生產(chǎn)菌株來實(shí)現(xiàn)技術(shù)革新。這之中，除了所熟知的木質(zhì)纖維素原料，以CO2為代表的一碳資源的利用近年來已引起廣泛關(guān)注。CO2儲(chǔ)量豐富且來源廣泛，除了是地球大氣的主要成分，還廣泛存在于石化及冶煉企業(yè)排放的廢氣、含碳物質(zhì)(如煤、石油、天然氣以及生物質(zhì)等)氣化制備的合成氣等。因此，發(fā)展CO2為代表的一碳資源利用的生物催化路線，將為解決全球資源和能源問題開辟一條新路，對(duì)未來工業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

固碳微生物可通過生命活動(dòng)將空氣中游離態(tài)的碳素直接轉(zhuǎn)變?yōu)楹加袡C(jī)物加以利用，因而在地球生物圈的碳循環(huán)中扮演重要角色，其固碳轉(zhuǎn)化功能對(duì)于CO2的資源化利用起著重要作用。天然的自養(yǎng)型固碳微生物按能量依賴形式主要分為光能、化能以及電能3種類型。其中，化能固碳微生物以H2或其他還原性化合物作為還原力和能量供體用于吸收固定CO2，比較有代表性的是產(chǎn)乙酸菌(acetogen)[1]。值得一提的是，個(gè)別產(chǎn)乙酸菌還能夠直接利用電能作為還原力實(shí)現(xiàn)CO2的固定[2]。光能固碳微生物，如藻類，可直接利用光能固定CO2，其CO2的固定效率遠(yuǎn)高于植物[3]，且具有遺傳背景簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快和營(yíng)養(yǎng)需求低等優(yōu)勢(shì)。此外，借助合成生物學(xué)手段改造異養(yǎng)型微生物實(shí)現(xiàn)其自養(yǎng)固碳也是未來發(fā)展的重要方向之一，可為獲得新型固碳微生物開辟道路。

作為固碳過程的首要步驟，微生物完成CO2從外部環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的方式主要有被動(dòng)運(yùn)輸和主動(dòng)運(yùn)輸兩類，其中被動(dòng)運(yùn)輸中又存在簡(jiǎn)單擴(kuò)散和協(xié)助擴(kuò)散兩種方式[4-5]。CO2是非極性小分子，通常能以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式直接通過細(xì)胞膜，這一跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的方式和機(jī)制在固碳微生物中普遍存在[6]。而其他轉(zhuǎn)運(yùn)方式，由于需要借助輔助因子，其具體機(jī)制在不同微生物中存在一定差異?？傮w而言，基于主動(dòng)運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率比被動(dòng)運(yùn)輸更高[5]。

目前，關(guān)于植物體內(nèi)CO2傳遞運(yùn)輸?shù)难芯枯^為全面和深入，且有系統(tǒng)的總結(jié)和闡述[7-10]；而微生物CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究主要集中于光合固碳的真核藻類和原核藍(lán)藻，在其他自養(yǎng)微生物中的研究較少。本文中，筆者總結(jié)和梳理了迄今已發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的微生物CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式及其分子機(jī)制，并重點(diǎn)介紹近年來該研究領(lǐng)域的新進(jìn)展以及如何通過對(duì)CO2運(yùn)輸途徑的代謝工程設(shè)計(jì)和改造提升微生物的固碳效率。

1 CO2被動(dòng)運(yùn)輸

被動(dòng)運(yùn)輸是指通過簡(jiǎn)單擴(kuò)散或者協(xié)助擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)物質(zhì)由高濃度向低濃度方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力來自于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的濃度梯度或溶質(zhì)的電化學(xué)梯度，不需要消耗細(xì)胞自身的能量[11]。其中，疏水小分子或不帶電荷的極性分子在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中不需要細(xì)胞提供能量，也沒有膜蛋白的協(xié)助，這種方式稱為簡(jiǎn)單擴(kuò)散；而一些極性分子和無機(jī)離子，如氨基酸、核苷酸等，順著濃度梯度或電化學(xué)梯度減小方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)雖然也不需要消耗能量，但需要特異的膜蛋白協(xié)助，因而稱之為協(xié)助擴(kuò)散[12]。

CO2分子屬于非極性小分子，其熱運(yùn)動(dòng)使CO2分子能以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式通過細(xì)胞膜[6]，因而這種CO2吸收方式在微生物中普遍存在。此外，CO2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)亦一定程度地依賴于協(xié)助擴(kuò)散。目前，CO2的協(xié)助擴(kuò)散研究較多地集中于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，且主要發(fā)現(xiàn)了兩類協(xié)助CO2擴(kuò)散的轉(zhuǎn)運(yùn)子，即Rhesus(Rh)蛋白和水通道蛋白[13-14]。相對(duì)而言，微生物的CO2協(xié)助擴(kuò)散機(jī)制研究較少，且多聚焦于光能自養(yǎng)的藻類。

目前，研究者只在包括綠藻在內(nèi)的少數(shù)真核微生物中發(fā)現(xiàn)了類似上述哺乳動(dòng)物中Rh蛋白協(xié)助CO2擴(kuò)散的轉(zhuǎn)運(yùn)子[15]。作為銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Amt的同系物，Rh蛋白亦屬于通道蛋白[16]。在綠藻屬萊茵衣藻中的研究發(fā)現(xiàn)，Rh蛋白的同源蛋白R(shí)hl的表達(dá)量受到CO2濃度的影響。當(dāng)衣藻在高濃度CO2(3%)的條件下生長(zhǎng)時(shí)，Rhl 的表達(dá)量較高，而當(dāng)用空氣作為原料氣培養(yǎng)時(shí)，Rhl 表達(dá)水平較低[17]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證綠藻中的Rh1是否參與了CO2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，研究者通過RNA干擾技術(shù)降低了衣藻中該蛋白編碼基因的表達(dá)量，結(jié)果表明：在高濃度CO2條件下，突變株的生長(zhǎng)速率明顯低于原始菌株，而在空氣中兩者生長(zhǎng)情況相近[4]，從而證明了衣藻的Rhl蛋白主要在高濃度CO2條件下發(fā)揮作用。

水通道蛋白在微生物中分布較為廣泛。根據(jù)已完成的微生物全基因組序列分析，有26%的原核微生物和67%的真核微生物含有潛在的水通道蛋白[18]，主要包括革蘭氏陽性的芽孢桿菌屬、分枝桿菌屬、鏈球菌屬，革蘭氏陰性的大腸桿菌、布魯氏菌、弧菌、假單胞菌以及酵母等[19]。已有研究表明，一些水通道蛋白在微生物抵御環(huán)境冷凍脅迫中發(fā)揮重要作用[20-22]。但水通道蛋白在微生物中是否也參與CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)尚不得而知，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2 CO2主動(dòng)運(yùn)輸

主動(dòng)運(yùn)輸是由載體蛋白所介導(dǎo)的物質(zhì)逆濃度梯度或電化學(xué)梯度由濃度低的一側(cè)向濃度高的一側(cè)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的方式，這一過程需要消耗能量[12]。CO2可以分子或HCO3-的形式通過主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞奖晦D(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。這一轉(zhuǎn)運(yùn)方式是藻類實(shí)現(xiàn)CO2濃縮的首要步驟。目前，已知藻類固碳的關(guān)鍵酶——核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)對(duì)CO2的親和力較弱。通過這種主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞?，藻類可以提高羧酶體內(nèi)CO2濃度，彌補(bǔ)RubisCO對(duì)CO2親和力不足的問題，提高反應(yīng)效率[5,23]。

2.1 藍(lán)藻

藍(lán)藻又被稱為藍(lán)細(xì)菌，具有極為高效的CO2濃縮機(jī)制。圖1展示了藍(lán)藻中的無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子。藍(lán)藻含有的無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子主要有以下5種類型：①BCT1。誘導(dǎo)型ATP依賴的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子，對(duì)CO2具有較高的親和力。②SbtA。誘導(dǎo)型的Na+依賴的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子，也對(duì)CO2具有較高的親和力，由sbtA基因編碼，在無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用[24]。③BicA。Na+依賴的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子，對(duì)HCO3-親和力較低但轉(zhuǎn)運(yùn)速率較高，屬于SulP家族[25]。④NDH-14。組成型的CO2吸收系統(tǒng)，由NdhD4/NdhF4/CupB(ChpX)組成[26-27]。NDH-14可將通過被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞的CO2再轉(zhuǎn)化為HCO3-。⑤NDH-13。誘導(dǎo)型CO2轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，由NdhD3/NdhF3/CupA(ChpY)組成[26]，工作機(jī)制與NDH-14相似，但對(duì)CO2的親和力要高于NDH-14[27]。

上述高親和力的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子BCT1屬于ABC(ATP binding cassette)型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，又被稱為轉(zhuǎn)運(yùn)ATPases，通常由ATP提供能量[28]。它是由cmpABCD操縱子編碼的4個(gè)亞基組成的復(fù)合體。目前為止，其功能及工作機(jī)制只在聚球藻SynechococcusPCC7942中有所研究。相比藍(lán)藻中另外幾種無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子，該轉(zhuǎn)運(yùn)子對(duì)HCO3-具有較高的光合親和性[29]，在無機(jī)碳(CO2和HCO3-)受限或高光脅迫條件下均可被誘導(dǎo)表達(dá)[30-32]。

BCT1—轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase，由操縱子CmpABCD編碼，包含4種亞基；BicA和SbtA—Na+依賴的 HCO3- 轉(zhuǎn)運(yùn)子；NDH-13和NDH-14—CO2吸收系統(tǒng)，其中，NDH-13由NdhF3/NdhD3/ChpY構(gòu)成，NDH-14由NdhF4/NdhD4/ChpX構(gòu)成圖1 藍(lán)藻中無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子Fig.1 Inorganic carbon transporters in cyanobacteria

SbtA轉(zhuǎn)運(yùn)子最初是在集胞藻SynechocystisPCC6803中被發(fā)現(xiàn)的，它是一種Na+依賴的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子[24]。SbtA發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能并不消耗ATP，而是依賴于Na+形成的胞內(nèi)外電化學(xué)梯度[33]。關(guān)于HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)Na+依賴性的解釋尚未有定論，一種觀點(diǎn)認(rèn)為是HCO3-在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中通過關(guān)聯(lián)Na+/H+反向運(yùn)輸系統(tǒng)來維持胞內(nèi)pH的穩(wěn)定[33]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)運(yùn)子在碳限制條件下的蛋白表達(dá)水平急劇上升[34]，表明它在低濃度CO2時(shí)可能發(fā)揮重要作用。

BicA轉(zhuǎn)運(yùn)子是在近海藍(lán)藻聚球藻SynechococcusPCC7002中首先被發(fā)現(xiàn)的，是另一種Na+依賴的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子。此后，在SynechococcusWH8102和SynechocystisPCC6803中也發(fā)現(xiàn)存在這類轉(zhuǎn)運(yùn)子[25]。在不同的藍(lán)藻中，該轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)方式存在一定差異。研究顯示，SynechococcusPCC7002中的BicA在無機(jī)碳限制的條件下可被誘導(dǎo)表達(dá)，而在高CO2環(huán)境中的表達(dá)水平卻較低；在SynechocystisPCC6803中，BicA的基因可能是組成型表達(dá)的[35]。與無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子SbtA相比，BicA在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中雖然對(duì)底物的親和力較低，但卻具有較高的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，從而支撐較高的光合速率[25]。

NDH-13/4都屬于修飾過的NADPH脫氫酶(NDH-1)復(fù)合物。在組成上，NDH-13和NDH-14復(fù)合體分別包含ChpX和ChpY蛋白，這2個(gè)蛋白催化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)CO2到HCO3-的轉(zhuǎn)化[27]。復(fù)合體NDH-14系統(tǒng)是組成型表達(dá)的，而NDH-13則是可被誘導(dǎo)表達(dá)的[36]。研究表明，SynechococcusPCC7002的ndhF3/ndhD3/chpY/orf133基因編碼高親和力的NDH-13復(fù)合物，而SynechocystisPCC6803的ndhF4/ndhD4/chpX基因編碼組成型表達(dá)的低親和性的NDH-14復(fù)合物[26-27]。需要指出的是，NDH-13和NDH-14這2種復(fù)合體定位于類囊體膜上，而不是像其他幾種轉(zhuǎn)運(yùn)子定位在細(xì)胞膜上。目前已知，NDH-13和NDH-14在α和β型藍(lán)藻中均有分布[37-38]，但相關(guān)的功能研究主要集中于3種β型的藍(lán)藻，即SynechococcusPCC7002、SynechococcusPCC7942和SynechocystisPCC6803[26-27]。

2.2 萊茵衣藻

萊茵衣藻作為一種淡水綠藻，是第1個(gè)被用于研究CO2濃縮機(jī)制的真核藻類[39]。作為真核藻類，其CO2濃縮機(jī)制要比藍(lán)藻復(fù)雜，相關(guān)研究尚不深入。

圖2展示了衣藻中的無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子。由圖2可知：CO2可以直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，也可以在碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)的催化下生成HCO3-,再通過載體HLA3或LCI1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞質(zhì)。胞質(zhì)中CO2分子和HCO3-進(jìn)入葉綠體后作為光合作用的原料。研究者已在萊茵衣藻中鑒定了2個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)膜上可能的無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子，即HLA3/MRP1和LCI1[40-42]。其中，HLA3最初被發(fā)現(xiàn)只在低CO2濃度(0.03%)的條件下才被誘導(dǎo)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[40]，且HLA3的表達(dá)受到CIA5的調(diào)控；后者是一個(gè)感應(yīng)CO2濃度的調(diào)控基因，在低CO2濃度時(shí)調(diào)控HLA3的表達(dá)[43]。在缺乏CIA5時(shí)，HLA3不能發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)功能[44]。有研究者在低濃度CO2條件下通過RNAi的方式干擾HLA3的表達(dá)，從而降低了衣藻對(duì)無機(jī)碳的親和性，顯著影響了衣藻的生長(zhǎng)[45]，從而證明了HLA3確實(shí)在衣藻光合固碳中發(fā)揮著作用。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)定位于葉綠體上的LCIA也能影響HLA3的表達(dá)[46]。LCIA的缺失導(dǎo)致HLA3的表達(dá)水平降低，從而影響無機(jī)碳的轉(zhuǎn)運(yùn)。但是，當(dāng)環(huán)境中CO2水平到達(dá)或者高于空氣中CO2濃度時(shí)，LCIA和HLA3均被抑制，這時(shí)CO2的吸收主要由LCIB完成[47]。此外，值得一提的是，與上述藍(lán)藻BCT1類似，HLA3也是一個(gè)ABC(ATP binding cassette)類型的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于MRP蛋白家族。MRP家族蛋白在動(dòng)物和植物中廣泛存在，其具有廣泛的底物譜[48]。所不同的是，BCT1是多聚體，而HLA3則是單體蛋白。

衣藻中另一種無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子LCI1可在低濃度CO2條件下被誘導(dǎo)表達(dá)[49]，它的表達(dá)受到調(diào)控基因CIA5和LCR1的共同控制[41-42]。有研究者通過軟件(iPSORT)預(yù)測(cè)了LCI1轉(zhuǎn)運(yùn)子中含有一個(gè)信號(hào)肽，并定位于細(xì)胞質(zhì)膜上[50]。目前，LCI1的功能以及生理學(xué)意義尚不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。

圖2 衣藻中無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)子Fig.2 Inorganic carbon transporters in Chlamydomonas

2.3 金藻和硅藻

金藻中的顆石藻(coccolithophores)是一種單細(xì)胞藻類，能夠利用石顆藻泡(coccolith vesicle)富集CO2和Ca2+并轉(zhuǎn)化為CaCO3，并將產(chǎn)生的CaCO3分泌到細(xì)胞表面，從而在自然界的碳循環(huán)中發(fā)揮作用。顆石藻中的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子AEL1(anion exchanger like 1)屬于solute carrier 4(SLC4)蛋白家族，是一類重要的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子。在低碳濃度的環(huán)境中，CO2濃縮相關(guān)的基因表達(dá)量上調(diào)[51]，從而可有效吸收CO2作為光合作用和形成CaCO3的原料，同時(shí)也對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH起到調(diào)節(jié)作用[52]。這一主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制使藻類能在低CO2濃度的水體環(huán)境中獲得足量的碳源以維持生長(zhǎng)。

在對(duì)硅藻的模式菌株，即PhaeodactylumtricornutumCCAP 1055/1和ThalassiosirapseudonanaCCMP1335的基因組分析中，發(fā)現(xiàn)硅藻的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要?dú)w屬于兩類蛋白家族——SLC4和SLC26[53]。這兩類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在原核和真核生物中廣泛分布[54]，其中，藍(lán)藻的BicA轉(zhuǎn)運(yùn)子屬于SLC26家族[55]。隨后，有研究者對(duì)SLC4和SLC26的功能進(jìn)行了解析。Nakajima等[56]發(fā)現(xiàn)在Phaeodactylumtricornutum中，SLC4家族的PtSLC4-2蛋白可定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，且能利用Na+濃度梯度向胞內(nèi)泵入HCO3-；Matsuda等[57]則通過亞細(xì)胞定位的方法發(fā)現(xiàn)SLC4蛋白在葉綠體膜上也有分布，對(duì)HCO3-從胞質(zhì)中運(yùn)輸進(jìn)入葉綠體起到重要作用。

圖3簡(jiǎn)要概括了上述金藻和硅藻的CO2轉(zhuǎn)運(yùn)方式和相關(guān)分子元件。主要通過SLC4和SLC26蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)并富集HCO3-，并在葉綠體中被碳酸酐酶(CA)催化為CO2，用于碳水化合物(CH2O)的合成。

圖3 金藻和硅藻無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Fig.3 Inorganic carbon transport system inChrysophyta and Bacillariophyta

2.4 化能自養(yǎng)細(xì)菌

化能自養(yǎng)細(xì)菌的CO2主動(dòng)運(yùn)輸可通過HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)的方式完成，目前已發(fā)現(xiàn)HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在這類細(xì)菌中廣泛存在。一方面，HCO3-能協(xié)同Na+運(yùn)輸，維持細(xì)胞的滲透壓和容量；另一方面，CO2/HCO3-/CO32-之間的切換也是維持細(xì)胞pH穩(wěn)定的有效緩沖體系[58]。例如，在自養(yǎng)硫細(xì)菌Phreagenaokutanii中已發(fā)現(xiàn)了可編碼SLC4家族蛋白的基因 (slc4co1、slc4co2和slc4co4)和碳酸酐酶基因(mcaco1和mcaco2)，意味著該菌存在著HCO3-攝入機(jī)制[59]。在另一類化能自養(yǎng)細(xì)菌——氨氧化古菌中也存在著CO2的主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制，其所含的SBT家族轉(zhuǎn)運(yùn)子具備在低碳環(huán)境中攝取無機(jī)碳的功能，但若菌體處于高CO2的環(huán)境中，該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則不能發(fā)揮無機(jī)碳主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[60]。

3 微生物CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的遺傳改造

CO2作為氣態(tài)物質(zhì)，其被微生物利用的過程涉及諸多關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，包括氣液傳質(zhì)效率、細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及后續(xù)固碳轉(zhuǎn)化過程等。其中，氣液傳質(zhì)效率的提高主要依靠生物反應(yīng)裝置的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以促進(jìn)含碳?xì)怏w向液態(tài)培養(yǎng)基的溶解[61-62]。而跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作為微生物固碳過程的首要環(huán)節(jié)，對(duì)于固碳效率亦具有決定作用，因而是遺傳改造的重要靶點(diǎn)。

研究者在藍(lán)藻Synechocystissp.PCC6803中用強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子過表達(dá)BicA轉(zhuǎn)運(yùn)子，使得工程菌在CO2濃度為0.5% 和5%條件下的生長(zhǎng)速度和生物量的積累達(dá)到野生型菌株的2倍[63]。此外，在衣藻Chlamydomonasreinhardtii中，研究者使用dTALE技術(shù)激活其自身的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)子HLA3的表達(dá)，提高了衣藻在低碳條件下的碳利用率和光合作用效率[47]。

改造異養(yǎng)微生物實(shí)現(xiàn)其對(duì)CO2的固定和轉(zhuǎn)化利用亦是近年來的研究熱點(diǎn)。例如，有研究者將來源于6種藍(lán)藻(Synechococcussp.WH5701、Cyanobiumsp.PCC7001、Cyanobiumsp.PCC6307、SynechococcuselongatusPCC7942、Synechocystissp.PCC6803和Synechococcussp.PCC7002)的CO2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SbtA分別在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并運(yùn)用同位素標(biāo)記的方法觀察到了大腸桿菌胞內(nèi)無機(jī)碳含量的顯著提升，從而證明了藍(lán)藻來源的SbtA轉(zhuǎn)運(yùn)子可在大腸桿菌中得到有效表達(dá)，且發(fā)揮CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[64]。大腸桿菌經(jīng)過人工篩選和工程改造可以用于固碳，且高效地生產(chǎn)琥珀酸[65]，在此基礎(chǔ)上，研究者通過在上述大腸桿菌工程菌中表達(dá)SynechocystisPCC6803來源的CO2轉(zhuǎn)運(yùn)子SbtA和BicA，提高其CO2的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，使得琥珀酸的產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高[66]。

此外，CO2完成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后，其后續(xù)固定及代謝過程涉及多步反應(yīng)，可以預(yù)見，其中會(huì)存在限速步驟。例如，最普遍的卡爾文循環(huán)中的固碳酶RubisCO，由于其對(duì)CO2的親和力較低，因而是固碳途徑遺傳改造的重要靶點(diǎn)[67]。鑒于本文主要關(guān)注的是微生物CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)于固碳代謝途徑的研究進(jìn)展在此不作詳細(xì)闡述。

4 結(jié)語

CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是微生物代謝利用這一游離性碳資源的首要步驟。目前，在光合固碳藻類中已經(jīng)鑒定了若干參與介導(dǎo)CO2吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)子，并解析了相關(guān)的分子機(jī)制。但對(duì)于其他兩種能量形式(化能和電能)的固碳微生物而言，CO2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究比較薄弱，亟待跟進(jìn)。

近年來，隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，深入解析固碳微生物的CO2吸收及轉(zhuǎn)化利用機(jī)制并開展高效的代謝工程設(shè)計(jì)和改造的研究迎來了契機(jī)?？梢灶A(yù)見的是，未來的CO2生物轉(zhuǎn)化利用將依托于光、化和電這3種能量形式，呈現(xiàn)多元化發(fā)展的局面，并致力于解決以下一些關(guān)鍵科學(xué)問題：①發(fā)掘和鑒定新型CO2轉(zhuǎn)運(yùn)子以及下游固碳途徑的酶基因，充實(shí)和完善現(xiàn)有的固碳元件庫和知識(shí)庫；②固碳相關(guān)新基因的功能解析，認(rèn)識(shí)和理解其工作機(jī)制；③提出重塑策略，包括優(yōu)化能量吸收、CO2轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化效率、引入和強(qiáng)化CO2濃縮機(jī)制等，構(gòu)建新型固碳細(xì)胞工廠；④以固碳微生物為底盤細(xì)胞創(chuàng)建新產(chǎn)物合成途徑，代謝重編程以提高目標(biāo)產(chǎn)物流量；⑤創(chuàng)建新型固碳底盤細(xì)胞，即改造現(xiàn)有的工業(yè)異養(yǎng)微生物(如大腸桿菌)成為自養(yǎng)微生物，建立基于CO2等一碳資源利用的新產(chǎn)業(yè)，實(shí)現(xiàn)“多源化”的生物制造。

致謝:上海交通大學(xué)陶飛博士對(duì)綜述的撰寫提出了諸多寶貴建議，在此表示感謝。

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(責(zé)任編輯 管珺)

ResearchprogressesinmicrobialtransmembranetransportofCO2

ZHANG Can1,2，YANG Gaohua1,2，JIANG Weihong1,2，GU Yang1,2

(1. Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200032,China; 2.Key Laboratory of Synthetic Biology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200032,China)

CO2is the free carbon resource with large reserves in the nature.Besides the well-known plant photosynthesis,many microorganisms can fix and utilize CO2,where the first step is the transmembrane transportation of CO2into cells.Here,we summarized the current research progresses in microbial CO2transportation,especially focusing on CO2transporters and the related molecular mechanisms,as well as the strategies to improve microbial CO2utilization via engineering CO2transport.On this basis,we further proposed key scientific problems and research emphasis in this area,to provide a reference to the biological uses of CO2in the future.

microorganism; CO2; transmembrane transport; transporter; molecular mechanism

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.001

2017-07-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(31630003、31421061) ；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃(17JC1404800)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2015AA020202)；中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)優(yōu)秀會(huì)員人才專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)

張 燦(1993—)，女，山東煙臺(tái)人，研究方向：微生物代謝調(diào)控；*為同等貢獻(xiàn),共同第一作者;姜衛(wèi)紅(聯(lián)系人)，研究員，E-mail:whjiang@sibs.ac.cn；顧 陽(聯(lián)系人)，研究員，E-mail:ygu02@sibs.ac.cn

TK6

A

1672-3678(2017)06-0001-08