顱腦損傷開顱手術(shù)患者顱內(nèi)壓變化與CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T 細胞的關(guān)系

梁 仔，徐 力，林國慶

1廣東醫(yī)學院附屬廉江市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廉江 524400；2湛江中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 湛江524001

顱腦損傷開顱手術(shù)患者顱內(nèi)壓變化與CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T 細胞的關(guān)系

梁 仔1，徐 力2，林國慶1

1廣東醫(yī)學院附屬廉江市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廉江 524400；2湛江中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 湛江524001

目的探討顱腦損傷開顱手術(shù)患者顱內(nèi)壓變化與CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的關(guān)系。方法以56例顱腦損傷開顱手術(shù)患者作為觀察組（A組），以38例急性大面積腦梗死進行開顱去骨瓣減壓的患者作為陽性對照（B組），并以40例健康志愿者作為陰性對照（C組）；比較以上3組外周血及腦脊液內(nèi)CD8+CD28-Treg及其細胞因子白介素10（IL-10）及轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的百分含量，并監(jiān)測A組在不同時間點顱內(nèi)壓、CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1的變化，并分析其相關(guān)性。結(jié)果A組術(shù)前CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1均不同程度低于B及C組（P＜0.05），但B組與C組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。隨著病情的推演，A組患者顱內(nèi)壓逐漸降至正常，而外周血及腦脊液內(nèi)CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1均逐漸回升。相關(guān)性分析顯示顱內(nèi)壓與CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1均呈顯著負相關(guān)。結(jié)論CD8+CD28-Treg及其細胞因子降低是顱腦損傷的重要免疫學現(xiàn)象，且與顱內(nèi)壓升高存在密切關(guān)系。

顱腦損傷；顱內(nèi)壓；CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細胞；細胞因子

顱內(nèi)壓監(jiān)測是神經(jīng)外科領域的研究熱點，目前主要是依靠物理學的方法，從宏觀的角度對顱內(nèi)壓進行監(jiān)測[1]。然而，顱內(nèi)壓是神經(jīng)外科功能的一個外在表現(xiàn)，僅能在一定程度上反映腦功能，存在局限性。研究顯示免疫功能的變化，是顱腦損傷之后“瀑布反應”的核心環(huán)節(jié)-腦細胞或血管破裂后引起抗原靶位暴露而誘發(fā)過亢的免疫反應而損失腦組織[2-3]。在這種情況下，一種特殊的T細胞-調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是抑制上述過度免疫反應的主要免疫細胞。有研究報道顯示，顱腦損傷患者的CD4+CD25+及CD8+CD28-兩種Treg都降低，且與病情相關(guān)[4-7]。為此，本研究推測CD8+CD28-Treg可能與顱腦損傷所致的顱內(nèi)高壓有關(guān)。本研究以顱腦損傷患者的外周血及腦脊液作為觀察標本，檢測了CD8+CD28-Treg及其細胞因子在上述標本的表達，發(fā)現(xiàn)具有顯著的相關(guān)性，這對于進一步關(guān)聯(lián)顱內(nèi)壓與神經(jīng)免疫損傷的內(nèi)在聯(lián)系具有重要意義，過程如下：

1 資料與方法

1.1 患者資料

選取2013年1月～2017年1月我院及湛江中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的顱腦損傷接受開顱手術(shù)的患者作為觀察對象（A組），合并以下情況者排除[8]：（1）免疫性疾?。唬?）近期服用激素、免疫抑制劑或生物制劑者；（3）孕婦。共入選56例，其中男性38例，女性18例。以同期手術(shù)的大面積腦梗死進行開顱手術(shù)減壓的38例患者作為陽性對照組（B組），以40例健康志愿者作為陰性對照（C組）。

1.2 手術(shù)方法

在患側(cè)半球側(cè)行標準大骨瓣減壓術(shù)，從外耳道前繞過枕部到達中線直到發(fā)際的大反問號切口，進暴露單側(cè)腦組織。術(shù)中盡可能的暴露前顱窩底以切除額、顳葉對腦干的壓迫。硬腦膜缺損者取顳肌筋膜修補，硬腦膜與顳肌盡可能嚴密縫合，而不切除腦組織。

1.3 顱內(nèi)壓監(jiān)測方法

采用腦室內(nèi)插管法：在顱骨頂部合適位置鉆一小孔，將內(nèi)徑為l mm左右的充滿生理鹽水的導管插入側(cè)腦室，導管外端用三通開關(guān)連接液壓傳感器，并連接腦室外引流裝置[9-10]。

1.4 流式細胞術(shù)

分別采集以上對象肘靜脈血約5 mL，采用Ficoll分離獲得外周血單個核細胞，隨后應用尼龍毛柱獲得T淋巴細胞，再免疫磁珠孵育30 min后進行磁珠而分離出CD8+CD28-T細胞，分別使用IL-10及TGF-β1染色劑對胞內(nèi)的IL-10及TGF-β1進行染色。使用BD公司生產(chǎn)的流式細胞儀的雙激光光源，以CD8及CD28進行射門，F(xiàn)L1和FL2 熒光通道則以相應同種型鼠IgG染色細胞作陰陽分界線，仔細設置各熒光通道之間的熒光補償，每管獲取細胞數(shù)1000個，運用FACSDIVA軟件，分別計算CD8+CD28-T細胞、IL-10及TGF-β1的百分含量[11]。

1.5 指標比較

分別在術(shù)后采集A、B組的外周血，進行CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1的檢測，并與C組進行比較。術(shù)后第1、4、7天采集A及B組患者外周血及腦脊液，進行CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1的測量。比較術(shù)后第1、4、7天A與B組患者的顱內(nèi)壓。并將CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1與臨床指標進行相關(guān)性分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

運用統(tǒng)計軟件包SPSS15.0對數(shù)據(jù)進行處理，定量資料采用均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析進行3組間的定量資料分析，采用Pearson法對定量資料間的相關(guān)性進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血CD8+CD28-Treg及其細胞因子比較

與C組比較，A、B組CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1均降低，但B組與C組差異無統(tǒng)計學意義，而A組顯著低于B組及C組（P＜0.05，表1）。

表1 3組研究對象外周血CD8+CD28-Treg及其細胞因子含量比較（%,）

表1 3組研究對象外周血CD8+CD28-Treg及其細胞因子含量比較（%,）

*P＜0.05 vs B組; #P＜0.05 vs C組.

分組 n CD8+CD28-Treg IL-10 TGF-β1 A組 56 4.13±0.95*# 3.02±0.81*# 1.16±0.32*#B組 52 10.91±3.88 8.16±2.58 5.87±3.27#C組 55 12.42±4.17 9.37±3.09 7.13±2.64*F-4.182 -3.221 -5.193 P 0.003 0.016 0.000

2.2 開顱患者術(shù)后CD8+CD28-Treg含量變化

A、B組患者術(shù)后24 h的CD8+CD28-Treg含量均較術(shù)前不同程度降低，且A組的外周血及腦脊液的該細胞含量低于B組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在術(shù)后第4、7天，兩組的CD8+CD28-Treg均逐漸回升，但僅第4天組間A組外周血及腦脊液的該細胞含量低于B組（P＜0.05），術(shù)后第7天兩組差異已無統(tǒng)計學意義（P＞0.05, 表2）。

表2 開顱患者不同時間點CD8+CD28-Treg的百分含量變化（）

表2 開顱患者不同時間點CD8+CD28-Treg的百分含量變化（）

分組 n術(shù)后24 h 術(shù)后第4天 術(shù)后第7天外周血 腦脊液 外周血 腦脊液 外周血 腦脊液A組 56 4.01±1.03 0.92±0.26 6.39±2.35 1.69±0.52 11.32±2.73 2.78±0.89 B組 52 8.92±3.37 1.96±0.43 10.23±4.62 2.53±0.68 12.45±4.12 3.04±1.76 t-3.202 -2.183 -2.831 -1.922 -0.814 -1.025 P 0.006 0.013 0.017 0.037 0.089 0.103

2.3 開顱患者術(shù)后IL-10含量變化

A及B組患者術(shù)后24 h的IL-10含量同樣均較術(shù)前不同程度降低，且兩組的外周血及腦脊液的該細胞的含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在術(shù)后第4、7天，兩組的IL-10均逐漸回升，但僅第4天組間的外周血及腦脊液IL-10差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而在第7天差異已無統(tǒng)計學意義（P＞0.05, 表3）。

表3 開顱患者不同時間點IL-10的百分含量（）

表3 開顱患者不同時間點IL-10的百分含量（）

分組 n術(shù)后24 h 術(shù)后第4天 術(shù)后第7天外周血 腦脊液 外周血 腦脊液 外周血 腦脊液A組 56 3.15±0.78 0.79±0.21 5.28±2.17 1.27±0.43 9.13±2.24 2.51±0.71 B組 52 7.04±2.61 1.61±0.39 8.36±3.85 2.23±0.56 10.21±3.98 2.83±1.53 t-3.013 -2.461 -2.712 -1.724 -0.922 -0.913 P 0.009 0.018 0.023 0.041 0.073 0.142

2.4 開顱患者術(shù)后TGF-β1含量變化

A及B組患者術(shù)后24 h的TGF-β1含量同樣均較術(shù)前不同程度降低，且兩組的外周血及腦脊液的該細胞的含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在術(shù)后第4、7天，兩組的TGF-β1均逐漸回升，但僅第4天組間的外周血及腦脊液TGF-β1有差異（P＜0.05），而在第7天兩組差異已無統(tǒng)計學意義（P＞0.05, 表4）。

表4 開顱患者不同時間點TGF-β1的百分含量（）

表4 開顱患者不同時間點TGF-β1的百分含量（）

分組 n 外A組 56 1.0術(shù)后24 h 術(shù)后第4天 術(shù)后第7天周血 腦脊液 外周血 腦脊液 外周血 腦脊液3±0.21 0.36±0.11 3.27±1.02 0.88±0.27 5.19±1.78 1.13±0.32 B組 52 3.29±0.72 0.72±0.21 6.13±3.04 1.52±0.39 6.36±2.87 1.76±0.59 t-2.894 -1.929 -2.251 -1.503 -0.871 -0.802 P 0.011 0.032 0.039 0.047 0.083 0.163

2.5 顱內(nèi)壓變化

A、B組術(shù)后24 h的顱內(nèi)壓差異無統(tǒng)計學意義（P=0.078），術(shù)后第4天B組顱內(nèi)壓顯著低于A組（P=0.025），但在術(shù)后第7天兩組的顱內(nèi)壓差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05, 表5）。

表5 兩組患者顱內(nèi)壓比較（，mmHg）

表5 兩組患者顱內(nèi)壓比較（，mmHg）

分組 n 術(shù)后24 h 術(shù)后第4天 術(shù)后第7天A組 56 91.29±26.37 69.39±18.19 53.27±12.45 B組 52 88.38±22.52 62.17±15.22 50.16±11.38 t 3.923 5.923 2.012 P 0.078 0.025 0.096

2.6 相關(guān)性分析

CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1均與GCS評分呈顯著正相關(guān)，而與顱內(nèi)壓及NIHSS評分呈顯著負相關(guān)（P＜0.05，表6）。

表6 A組患者腦脊液內(nèi)CD8+CD28-Treg及其細胞因子與臨床指標的相關(guān)性（）

表6 A組患者腦脊液內(nèi)CD8+CD28-Treg及其細胞因子與臨床指標的相關(guān)性（）

GCS：格拉斯哥昏迷評分；NIHSS：美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表.

指標CD8+CD28-Treg IL-10 TGF-β1 rPrPrP顱內(nèi)壓 -0.728 0.003 -0.713 0.008 -0.684 0.013 GCS 0.684 0.011 0.651 0.015 0.632 0.021 NIHSS -0.762 0.000 -0.743 0.001 -0.715 0.006

3 討論

T細胞的活化是啟動獲得性、特異性免疫反應的第1步，而活化的前提是CD28分子表達在效應T細胞的表面[12]。因此，根據(jù)是否表達CD28分子，CD8+T細胞可分為表達CD28分子的CD8+CD28+T細胞，以及不表達的CD8+CD28-T細胞，前者具有免疫殺傷作用，可導致前述的瀑布式反應，而后者由于未被活化而具有免疫抑制作用，因此CD8+CD28-T細胞被歸屬到調(diào)節(jié)性T細胞亞群（Treg）[5,13]。大量研究表明，讓Treg執(zhí)行免疫抑制功能的基礎是分泌細胞因子IL-10及TGF-β1，后兩者可以抑制Teff的表達[7]。然而，CD8+CD28-Treg在創(chuàng)傷性顱內(nèi)高壓扮演何種角色，目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，A及B組CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1均降低，但B與C組無統(tǒng)計學差異，而A組顯著低于B組及C組，這說明CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1在腦梗死及顱腦損傷存在差異性表達，主要原因是兩組的病因不同，因此其免疫狀態(tài)差異較大[14]。在術(shù)后的比較方面說明一個重要現(xiàn)象：盡管手術(shù)在一定程度上解除了顱內(nèi)高壓，但是疾病發(fā)展本身還存在瀑布反應[15]。因此CD8+CD28-Treg及其細胞因子存在持續(xù)消耗而不斷降低[16]，至少持續(xù)至術(shù)后96 h，后者為重要時間窗，此首次報道，有較顯著的臨床意義。術(shù)后1周，A、B組的外周血及腦脊液內(nèi)的CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1無差異，說明該時間點患者的免疫狀態(tài)已趨于平衡。

IL-10作為重要的抑制性炎癥因子，研究表明，在顱腦損傷早期血清中IL-10含量就明顯代償性升高，與顱腦損傷程度呈正相關(guān)，并可能在繼發(fā)性腦損害中起重要作用[17-20]。醫(yī)學界普遍認為其具有神經(jīng)保護作用。急性顱腦損傷早期炎癥因子表達大幅度提升，引起機體出現(xiàn)炎癥反應，這一表現(xiàn)大大加重了腦水腫及腦神經(jīng)元損傷，從而致使機體產(chǎn)生抗炎因子IL-10，通過減低炎性細胞因子、組織炎癥反應、減輕腦水腫、減少巨噬細胞產(chǎn)生有毒物質(zhì)等作用與炎癥因子對抗[21]。并且有研究顯示，TGF-β1作為神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)元的存活有神經(jīng)保護作用[22]。有研究也證實TGF-β1可抑制大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后海馬神經(jīng)元的凋亡[23]。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，追蹤檢測IL-10的絕對含量可判斷顱腦損傷[17-21]及繼發(fā)性腦損害[18]嚴重程度，而其百分含量的變化可結(jié)合TGF-β1用于評價顱腦損傷的手術(shù)治療效果。

手術(shù)操作本身所造成的腦水腫是顱內(nèi)高壓的主要原因[24]，但在第7天兩組的顱內(nèi)壓差異又無統(tǒng)計學意義，說明術(shù)后已趨于穩(wěn)定。D8+CD28-Treg及其細胞因子與臨床存在何種聯(lián)系是本研究探索的核心目的，因此通過Pearson分析了相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1均與GCS評分呈顯著正相關(guān)，而與顱內(nèi)壓及NIHSS評分呈顯著負相關(guān)，這說明一個重要現(xiàn)象：顱腦損傷患者的顱內(nèi)壓越高，腦脊液內(nèi)的CD8+CD28-Treg、IL-10及TGF-β1越低，其神經(jīng)損傷越嚴重。

本研究發(fā)現(xiàn)，CD8+CD28-Treg及其細胞因子降低是顱腦損傷的重要免疫學現(xiàn)象，且與顱內(nèi)壓升高存在密切關(guān)系，這對于神經(jīng)外科患者的顱內(nèi)壓監(jiān)測具有重要的臨床指導作用。

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Correlation between CD8+CD28-Treg and intracranial pressure in craniotomy patients with craniocerebral injury

LIANG Zai1, XU Li2, LIN Guoqing1

1Department of Neurosurgery, The People’s Hospital of Lianjiang Affiliated to Guangdong Medical College, Lianjiang 524400, China;2Department of Neurosurgery, The Central People’s Hospital of Zhanjiang, Zhanjiang 524001, China

ObjectiveTo explore the correlation between CD8+CD28-Treg and intracranial pressure in craniotomy patients with craniocerebral injury.MethodsFifty-six patients with craniocerebral injury surgical operation were chosed as observation group (group A), 38 cases with acute massive cerebral infarction who underwent decompressive craniectomy were chosed as the positive control (group B), and 40 healthy volunteers were chosed as the negative control group (group C). CD8+CD28-Treg,cytokine interleukin 10 (IL-10) and transforming growth factor beta 1 (TGF-beta 1) percentage in peripheral blood and cerebrospinal fluid were compared. Intracranial pressure, CD8+CD28-Treg, IL-10 and the TGF-beta 1 of Group A in different time were compared, with correlation analyzed.ResultsPreoperative CD8+CD28-Treg, IL-10 and TGF-beta 1 of group A were lower than that of group B and C (P＜0.05), but no significant difference was found between B and C (P＞0.05). With the deduction of the illness, intracranial pressure of group A droped to normal level gradually, and CD8+CD28-Treg, IL-10 and TGF-beta 1 in peripheral blood and cerebrospinal fluid were gradually recovered.Correlation analysis showed that intracranial pressure had a negative correlation with CD8+CD28-Treg, IL-10 and TGF-beta 1.ConclusionCD8+CD28-Treg cells and its cytokine reduction are important phenomenon of immunology in craniocerebral injury. There is a close relationship with elevated intracranial pressure.

craniocerebral injury; intracranial pressure; CD8+CD28-regulatory T cells; cytokines

2017-08-17

湛江市科學技術(shù)局課題（2015C01012）

梁 仔，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail: liangzaizai008@163.com