青藤堿對(duì)家兔骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型骨生長(zhǎng)分化因子2和血清白介素-1β及白介素-17的影響

黃 明，胡熙耀，彭 敏，朱克剛

青藤堿對(duì)家兔骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型骨生長(zhǎng)分化因子2和血清白介素-1β及白介素-17的影響

黃 明1，胡熙耀2，彭 敏2，朱克剛3*

目的研究青藤堿對(duì)骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型家兔骨生長(zhǎng)分化因子2(GDF2)和血清白介素-1β(IL-1β)及IL-17的影響，并探討其作用機(jī)制。方法先將36只雌性家兔去卵巢建立骨質(zhì)疏松模型，4周后再采用剪斷L1-L5節(jié)段椎體前緣的方法建立骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型，成模后分為模型組，青藤堿A組、B組。青藤堿A組、B組用10%青藤堿分別按2、4 mL/(kg·d)劑量灌胃，模型組灌胃等體積生理鹽水，三組均治療1個(gè)月。采用雙抗體夾心法檢測(cè)耳緣靜脈炎性因子IL-1β/IL-17的含量；采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)椎間盤(pán)組織GDF2表達(dá)水平；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)椎間盤(pán)組織GDF2 mRNA表達(dá)。結(jié)果青藤堿可提高青藤堿A組、B組家兔GDF2、GDF2 mRNA表達(dá)水平，降低血清IL-1β/IL-17含量，與模型組和同組治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但青藤堿A組、B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論青藤堿可改善低IL-1β/IL-17介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及骨退行性變，提高GDF2誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力，加速骨折愈合。

青藤堿；骨質(zhì)疏松壓縮性骨折；骨生長(zhǎng)分化因子2；IL-1β/IL-17；家兔

0 引言

骨質(zhì)疏松屬體內(nèi)鈣調(diào)節(jié)激素分泌失調(diào)的全身代謝性疾病，尤以50歲以上的絕經(jīng)婦女最為嚴(yán)重，患者因鈣、磷、維生素及蛋白質(zhì)等攝入不足，成骨和破骨代謝失衡，骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變、骨強(qiáng)度下降且脆性增加，在外力的作用下較易發(fā)生壓縮性骨折，嚴(yán)重影響患者的生活及生存質(zhì)量[1-2]。在骨折愈合病理過(guò)程中，炎性因子IL-1β、IL-17等常影響骨折局部微環(huán)境。IL-1β在誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的同時(shí)，還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)，降低成骨細(xì)胞活性，減緩骨痂形成[3]。而因子IL-17由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性并最終導(dǎo)致骨侵蝕[4]。骨生長(zhǎng)分化因子2(Growth differentiation factor 2，GDF2)具有誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力，在骨折愈合過(guò)程中起重要作用，GDF2對(duì)促進(jìn)骨痂形成具有重要意義[5]。本文旨在研究青藤堿(Sinomenine，SIN)對(duì)骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型家兔骨折GDF2和血清IL-1β/IL-17的影響，探討青藤堿的作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雌性家兔36只，7月齡左右，體重(3.0±0.1)kg，隨機(jī)分為3組(模型組,青藤堿A組、B組)，每組12只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由十堰市太和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格號(hào)：4200593344)。

1.2 試劑及藥品 水合氯醛(揚(yáng)州市奧鑫助劑廠，批號(hào)：015102913)，鹽酸青藤堿腸溶片(煙臺(tái)魯銀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2016122603)；IL-1β、IL-17、OPG和GDF2檢測(cè)ELISA試劑盒均由上海信則生物科技有限公司提供。

1.3 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型及骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型建立 家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉后俯臥位固定，8%硫化退毛，于家兔髂嵴頂部上方和腰椎骶棘肌兩側(cè)采用雙切口方法切開(kāi)家兔背肌，分離出腹腔脂肪團(tuán)中包埋的卵巢和子宮角。先結(jié)扎子宮角上部，然后摘除卵巢，摘除干凈后納入脂肪團(tuán)，分層縫合背肌和皮膚，用雙氧水消毒。術(shù)后肌肉注射地塞米松(1 mg/kg)，2次/周，共4周[6]。術(shù)后自由攝食、飲水，恒溫20～22 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。4周后參照文獻(xiàn)[7]方法建立骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型。建模時(shí)用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，雙氧水消毒，切開(kāi)兔L1-L5皮膚，分離家兔背闊肌、棘間肌及韌帶，從椎體側(cè)前方剪斷L1-L5節(jié)段椎體前緣，術(shù)后椎體不用做內(nèi)固定，2周后動(dòng)物可成模。成模依據(jù)[8]：2周內(nèi)強(qiáng)迫活動(dòng)(每天6 h)，因家兔的前肢不發(fā)達(dá)，后肢及脊柱背側(cè)肌群、腹側(cè)肌群比較發(fā)達(dá)，且生活體位多以半直立屈曲位為主，負(fù)重集中在后肢，動(dòng)物清醒后，其覓食活動(dòng)、強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)均會(huì)使椎體受壓，脊柱在此負(fù)重狀態(tài)下最終會(huì)出現(xiàn)壓縮狀態(tài)而形成骨質(zhì)疏松壓縮性骨折。本實(shí)驗(yàn)在術(shù)后2周時(shí)拍攝CR，發(fā)現(xiàn)椎體均有明顯壓縮變短等病理改變，證實(shí)建模成功，符合骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型病理特征。

1.4 治療方法 骨質(zhì)疏松壓縮性骨折模型成功后，青藤堿A組、B組用事先配制好的10%鹽酸青藤堿腸溶片混懸液，每只家兔按2、4 mL/(kg·d)的劑量灌胃，模型組按2 mL/(kg·d)灌生理鹽水，三組均治療1個(gè)月。

1.5 觀察指標(biāo) 治療前和治療后，取耳緣靜脈血0.1 mL，采用雙抗體夾心法檢測(cè)炎性因子IL-1β/IL-17的含量；取血后各組處死7只，取椎間盤(pán)組織制成勻漿液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)椎間盤(pán)組織GDF2表達(dá)水平；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)椎間盤(pán)組織GDF2 mRNA表達(dá)。以上操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對(duì)家兔GDF2和GDF2 mRNA的影響 模型組家兔治療前后GDF2和GDF2 mRNA無(wú)明顯變化(P>0.05)。治療前，青藤堿A組、B組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，兩組GDF2和GDF2 mRNA均高表達(dá)(P<0.05)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 青藤堿對(duì)家兔IL-1β和IL-17的影響 模型組家兔治療前后IL-1β和IL-17無(wú)明顯變化(P>0.05)。治療前，青藤堿A組、B組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組IL-1β和IL-17均降低(P<0.05)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)有15個(gè)成員，其中BMP9又稱GDF2，具有誘導(dǎo)成骨分化和骨形成的能力，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，因其可誘導(dǎo)骨形成而得名[9]。Kimelman-Bleich等[10]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GDF2具有誘導(dǎo)成骨活性的作用，具有明顯的促成骨作用。IL-1β和IL-17作為炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。從理論上講，抑制IL-1β和IL-17的合成，增強(qiáng)GDF2均有利于骨折愈合。青藤堿是從中醫(yī)青風(fēng)藤的干燥根莖中提取的裝模單體生物堿，因其具有抗腫瘤、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕等作用，臨床常用于類風(fēng)濕、風(fēng)濕及骨性關(guān)節(jié)炎等的治療[11-12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先用雌性家兔去卵巢建立家兔骨質(zhì)疏松模型，再在此基礎(chǔ)上建立椎體壓縮性骨折模型，目的是真實(shí)模擬老年女性骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折，研究青藤堿在骨折愈合過(guò)程中是否可以通過(guò)影響GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)及炎癥因子IL-1β和IL-17合成而加速愈合。

表1 各組治療前后GDF2和GDF2 mRNA比較(n=8)

注：與治療前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 各組治療前后IL-1β和IL-17比較(pg/mL，n=8)

注：與治療前比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

本研究表明，青藤堿可提高A組、B組GDF2、GDF2 mRNA表達(dá)水平，降低血清IL-1β/IL-17含量。研究表明，IL-1β是一種較強(qiáng)的刺激骨吸收的因子，隨著絕經(jīng)后婦女雌激素分泌量降低，機(jī)體對(duì)于IL-1β啟動(dòng)因子的拮抗作用降低，故IL-1β促使骨吸收，加速骨質(zhì)疏松的形成[13]。另外，在骨質(zhì)疏松形成的過(guò)程中，炎癥因子IL-17也可以調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收，影響破骨細(xì)胞活性，破骨細(xì)胞分泌大量水解酶溶解骨質(zhì)，使骨小梁變薄、斷裂，最終形成骨質(zhì)疏松[14-15]。IL-1β與IL-17在炎癥反應(yīng)中有聯(lián)動(dòng)關(guān)系，IL-1β首先激活一氧化氮合酶而產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，并能抑制軟骨細(xì)胞增殖和合成蛋白多糖[16]。同時(shí)，IL-1β還會(huì)使T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17而降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)，降低成骨細(xì)胞活性而破壞骨微結(jié)構(gòu)[17]。T細(xì)胞活化后產(chǎn)生的因子IL-17還可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，并最終導(dǎo)致骨侵蝕而加重骨質(zhì)疏松病理進(jìn)程[18]。因此，抑制IL-1β與IL-17所造成炎性反應(yīng)成為防治骨質(zhì)疏松時(shí)骨質(zhì)破壞及可能發(fā)生椎體壓縮性骨折的關(guān)鍵。在本實(shí)驗(yàn)中，青藤堿通過(guò)抑制IL-1β合成和T細(xì)胞活化，間接抑制IL-17表達(dá)及分泌而產(chǎn)生抗炎作用，降低軟骨細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性而加速骨折愈合[19]。本實(shí)驗(yàn)還觀察到青藤堿可明顯提高GDF2表達(dá)。目前關(guān)于GDF2對(duì)骨質(zhì)疏松的研究較少。GDF2能夠誘導(dǎo)鈣鹽結(jié)節(jié)沉積，并可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨、軟骨[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中，GDF2和GDF2 mRNA高表達(dá)，提示青藤堿可通過(guò)誘導(dǎo)骨鈣沉積，提高成骨細(xì)胞活性，并有可能抑制已經(jīng)成熟的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨吸收，促成新骨及骨痂形成而加速修復(fù)動(dòng)物骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折。

綜上所述，青藤堿可以通過(guò)影響GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)及炎癥因子IL-1β和IL-17合成而加速骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折愈合，具有肯定的治療作用，其意義在于青藤堿可能成為治療老年女性骨質(zhì)疏松椎體壓縮性骨折的新藥物。

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Effectofsinomenineongrowthdifferentiationfactor2ofboneandseruminterleukin-1βand-17inmodelsofosteoporoticvertebralcompressionfracturesinrabbits

HUANG Ming1,HU Xi-yao2,PENG Min2,ZHU Ke-gang3*

(1.Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442002,China;2.Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;3.Department of Pharmacology, Basic Medical College of Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

ObjectiveTo study the effects of sinomenine on growth differentiation factor 2 (GDF2) and IL-1β and IL-17 in models of osteoporotic vertebral compression fractures in rabbits,and to explore the mechanism of action.MethodsFirst,36 female rabbits were ovariectomized to establish osteoporosis models,and after 4 weeks,the method of cutting former-edge of L1-L5 segments was used to establish fractures of vertebral compression with osteoporosis.After modeling,they were divided into model group,sinomenine group A and group B.Sinomenine group A and group B

intragastric administration of 10% sinomenine with 2 mL/(kg·d) and 4 mL/(kg·d) as dosages,model group was given normal saline,and the 3 groups were all treated for one month.Double antibody sandwich method was used to test the contents of factor IL-1β/IL-17 of ear vein inflammatory;enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used for the detection of expressions of GDF2 in intervertebral disc tissue;reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expressions of GDF2 mRNA in intervertebral disc tissue.ResultsSinomenine could improve the expression level of GDF2 and GDF2 mRNA in group A and group B,and decrease the contents of IL-1β/IL-17 in serum (P<0.05),and there was statistically significant difference between sinomenine groups and model group (P<0.05),but there was no significant difference between group A and group B (P>0.05).ConclusionSinomenine can reduce the inflammatory reaction and bone degeneration induced by factor IL-1β/IL-17,increase the ability of GDF2 to induce osteogenic differentiation and bone formation,thus accelerating the healing of bone fractures.

Sinomenine;Osteoporotic compression fracture;Bone growth differentiation factor 2;IL-1β/IL-17;Rabbit

2017-03-23

1.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 十堰 442002；2.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，湖北 十堰 442000

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711006