川芎嗪對肝藥物代謝酶CYP3A4的影響及機制研究

吳曉華，張 俐，朱 磊，戴亞萍

川芎嗪對肝藥物代謝酶CYP3A4的影響及機制研究

吳曉華1，張 俐2，朱 磊1，戴亞萍2

目的探討川芎嗪對HepG2細胞中肝藥物代謝酶CYP3A4的影響及其作用機制。方法采用不同濃度的川芎嗪作用于HepG2細胞48 h，MTT法檢測細胞活力，并選取對細胞存活率影響較小的濃度進行實驗。設置空白組、酮唑康組、不同濃度川芎嗪組以及酮唑康和不同濃度川芎嗪共同給藥組，CYP3A4和PXR轉(zhuǎn)染各組細胞，采用熒光素酶報告基因技術(shù)檢測各給藥組對CYP3A4和PXR酶活性的影響。并提取各組細胞蛋白，采用Western blot法檢測HepG2細胞的CYP3A4和PXR蛋白表達水平。結(jié)果川芎嗪可以使CYP3A4酶活性增加，并呈劑量依賴性，還可使CYP3A4蛋白表達水平上調(diào)；川芎嗪可劑量依賴性地增加PXR轉(zhuǎn)錄活性，并使PXR蛋白水平升高。結(jié)論川芎嗪能通過激活PXR受體而對藥物代謝酶CYP3A4起誘導作用。

川芎嗪；HepG2細胞；CYP3A4；孕烷X受體

0 引言

川芎(LigusticumchuanxiongHort.)是傘形科植物的干燥根莖，其味辛，溫，可活血行氣，祛風止痛，用于治療胸痹心痛，胸脅刺痛，跌撲腫痛，月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕腹痛，頭痛，風濕痹痛[1]。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)為酰胺類生物堿，是川芎的主要有效成分之一。藥理學研究表明，川芎嗪具有抗血小板聚集、擴張小動脈、改善微循環(huán)和腦血流的作用，用于治療閉塞性血管疾病、腦血栓形成、脈管炎、冠心病、心絞痛等[2-5]。目前關于川芎嗪藥物代謝的研究較少，尚無川芎嗪對藥物代謝酶的影響及其機制的研究。肝是機體內(nèi)藥物代謝的主要器官，細胞色素P4503A(CYP3A)是肝內(nèi)最主要的代謝酶，其中CYP3A4是CYP3A酶系中一種重要的同工酶，參與50%以上臨床常用藥物的代謝[6]。許多藥物對其有抑制或誘導作用，可引起CYP3A4活性的改變，從而影響藥物的療效、毒性作用和藥物之間的相互作用。近年來，在CYP450研究過程中發(fā)現(xiàn)，核受體孕烷X受體(PXR)作為轉(zhuǎn)錄因子，在藥物代謝酶調(diào)控中具有重要作用，外源性藥物可與PXR結(jié)合，激活或抑制其活性，從而調(diào)控CYP3A4的基因表達，影響藥物的代謝[7-8]。因此，本研究旨在探討川芎嗪對CYP3A4和PXR的作用，探討川芎嗪對藥物代謝酶作用的可能機制，為其合理用藥和安全性提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器 NU-4750型CO2培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)，HD2-BCN-1360B生物潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，AE31EF型倒置顯微鏡(Motic公司)，TDZ4-WS臺式離心機(湘儀離心機)，U570-86 Premium系列超低溫冰箱(美國NBS公司)，TDZ4-WS低速臺式離心機(湘儀離心機)，濾器(Millex.GP)，96孔無菌培養(yǎng)板(Corning公司)，BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司)，Sartorious CP225D型精密天平(北京塞多斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 川芎嗪(中國藥品生物制品檢定所)，酮康唑(美國Sigma公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Amreso公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，雙抗(美國Hyclone公司)，PBS磷酸鹽緩沖液(北京Solarbio公司)，RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)，總蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所)，CYP3A4抗體(美國Abcam公司)，PXR抗體(美國Abcam公司)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細胞 人肝癌細胞系HepG細胞購自上海細胞生物研究所。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞活性 HepG細胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的HepG細胞，調(diào)整細胞密度至5.0×104個/mL，接種于96孔板，每孔加100 μL，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁，吸棄舊培養(yǎng)液，加入終濃度為5、10、20、50、100、200 μg/mL的含川芎嗪培養(yǎng)液，每個濃度設置6個復孔，同時設定空白對照孔和調(diào)零孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液，孵育4 h后，吸去培養(yǎng)液，加入100 μL的DMSO，震蕩10 min，在酶標儀492 nm處測得OD值，計算細胞存活率。細胞存活率%=(A實驗-A調(diào)零)/(A空白對照-A調(diào)零)×100%。

2.2 熒光素酶報告基因檢測法檢測CYP3A4和PXR酶活性 采用熒光素酶報告基因檢測法[8-9]考察川芎嗪對HepG細胞中CYP3A4和PXR活性的影響。HepG細胞接種于96孔板中培養(yǎng)，將Pgl3-CYP3A4、pCl-hPXR和pRL-TK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG細胞中。加入各組藥液，使各組終濃度如下：10 μg/mL TMP、20 μg/mL TMP、50 μg/mL TMP、3 μmol/L酮康唑(Ket)、10 μg/mL TMP+3 μmol/L Ket、20 μg/mL TMP+3 μmol/L Ket、50 μg/mL TMP+3 μmol/L Ket，每組設置6個復孔，同時設定空白對照孔和調(diào)零孔。給藥48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明，裂解細胞，取上清用于測定。樣品中加入熒光素酶檢測試劑混勻，以報告基因細胞裂解液為空白對照，測定相對光單位(Relative light unit,RLU)，然后加入海腎熒光素酶檢測工作液，混勻后測定RLU。熒光素酶活性值=熒光素酶檢測值/海腎熒光素酶檢測值。

2.3 Western blot檢測CYP3A4和PXR蛋白表達 取對數(shù)生長期的HepG細胞，調(diào)整細胞密度至5.0×105個/mL，接種于6孔板，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁，吸棄舊培養(yǎng)液，給藥后使各組終濃度同“2.2”項實驗，每個濃度設置6個復孔，同時設定空白對照孔和調(diào)零孔。48 h后，小心吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌，重復2次，將各組細胞用0.25%胰酶消化，離心5 min，小心吸出上清液，加入PBS輕輕吹打混勻，離心5 min，倒出PBS，加入200 μL細胞裂解液，于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 g離心10 min，取上清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用BCA法測定蛋白含量，調(diào)整各組蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，采用SDS-PADE凝膠電泳，濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，含5% BSA的封閉液37 ℃封閉1 h后加入一抗和β-actin溶液4 ℃過夜(PXR 1∶1 000，CYP3A4 1∶3 000)。次日37 ℃孵育1.5 h，5% PBST溶液洗滌5次，每次5 min。加入二抗后密封，37 ℃孵育1 h，5% PBST溶液洗滌5次，每次5 min。ECL反應2 min，化學發(fā)光凝膠圖像儀成像，結(jié)果用Image J灰度分析軟件分析條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪對HepG2細胞的影響 MTT結(jié)果表明，隨著川芎嗪濃度的升高，HepG2細胞的存活率逐漸下降，5～50 μg/mL的川芎嗪對細胞的存活率影響較小，細胞存活率>85%。當川芎嗪濃度>50 μg/mL時，HepG2細胞的存活率低，出現(xiàn)細胞毒性。因此,選取5～50 μg/mL的濃度作為川芎嗪的給藥濃度。見圖1。

圖1 川芎嗪對HepG2細胞存活率的影響

3.2 川芎嗪對細胞熒光素酶活性的影響 熒光素酶活性結(jié)果顯示，與空白組相比，10 μg/mL川芎嗪組的CYP3A4熒光素酶活性值高于空白組(P<0.05)，20、50 μg/mL川芎嗪組的CYP3A4和PXR熒光素酶活性值顯著高于空白組(P<0.01)，表明中、高濃度的川芎嗪可顯著增加CYP3A4與PXR活性，且具有劑量依賴性，活性隨著川芎嗪濃度的增加而逐漸增強。同時，與空白對照組比較，Ket顯著抑制了CYP3A4和PXR熒光素酶活性(P<0.01)；與Ket組比較，20 μg/mL TMP+3 μmol/L Ket和50 μg/mL TMP+3 μmol/L Ket組中，川芎嗪顯著減弱了Ket對CYP3A4和PXR熒光素酶活性的抑制作用，對CYP3A4和PXR熒光素酶活性具有誘導作用，隨著川芎嗪濃度的增加，誘導作用也增強。見圖2。

圖2 川芎嗪對HepG2細胞熒光素酶活性的影響注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01;與Ket組比較， #P<0.05,##P<0.01

3.3 川芎嗪對CYP3A4和PXR蛋白水平表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，20、50 μg/mL川芎嗪組CYP3A4蛋白的表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明中、高濃度的川芎嗪均可顯著增加CYP3A4蛋白的表達，對CY3A4具有誘導作用。10 μg/mL川芎嗪組PXR蛋白表達高于空白組(P<0.05)，20、50 μg/mL川芎嗪組的PXR蛋白表達顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明低、中、高濃度的川芎嗪均可顯著增加PXR的蛋白表達。同時，與空白對照組比較，Ket顯著抑制了CYP3A4和PXR蛋白的表達(P<0.01)；與Ket組比較，20 μg/mL TMP+3 μmol/L Ket和50 μg/mL TMP+3 μmol/L Ket組中川芎嗪顯著減弱了Ket對CYP3A4和PXR蛋白表達的抑制作用，提示川芎嗪對CYP3A4和PXR表達具有促進作用，隨著川芎嗪濃度的增加促進作用也越強。見圖3、圖4。

圖3 川芎嗪對HepG2細胞CYP3A4和PXR蛋白表達的影響

圖4 川芎嗪對HepG2細胞CYP3A4和PXR蛋白表達的影響注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01;與Ket組比較， #P<0.05,##P<0.01

4 討論

CYP3A4作為肝細胞色素P450氧化酶中的一類重要亞族酶類，是一種重要的藥物氧化代謝酶，可參與臨床半數(shù)以上藥物的代謝。CYP3A4可被多種藥物誘導或抑制，當CYP3A4活性改變，藥物在體內(nèi)的代謝水平就會隨之改變，從而影響體內(nèi)藥物的吸收量和體內(nèi)藥物的停留時間。當CYP3A4活性被誘導時，可加快藥物的代謝，反之藥物代謝變慢，其活性可影響藥物的療效和毒性反應及藥物之間的相互作用，最終使藥物效應受到影響。近年來，中藥對肝藥物代謝酶作用的研究已取得一定進展，研究發(fā)現(xiàn)，甘草總提取物、麥冬提取物、人參皂苷和銀杏內(nèi)酯等對CYP3A及其亞型具有不同程度的誘導作用[9-12]，吳茱萸堿、金銀花提取物、三七總皂苷、仙茅等對CYP3A及其亞型具有不同程度的抑制作用[13-16]。

川芎嗪是從傳統(tǒng)中藥川芎中提取的有效活性成分，臨床中使用的鹽酸川芎嗪和磷酸川芎嗪為人工合成。藥代動力學研究表明，川芎嗪主要靶器官為肝臟，其代謝物主要經(jīng)腎臟排出，其他途徑較少。目前關于川芎嗪的研究較多，且多集中在藥效學和藥動學研究，而對其代謝、與其他藥物在體內(nèi)的相互影響、其對體內(nèi)代謝酶影響的研究較少。本文以HepG2細胞為對象，研究川芎嗪對藥物代謝酶CYP3A4的影響，結(jié)果顯示，川芎嗪可以使CYP3A4酶活性增加，Western blot結(jié)果表明，川芎嗪可以使人肝癌HepG2細胞中CYP3A4蛋白表達水平上調(diào)，表明川芎嗪對藥物代謝酶CYP3A4具有明顯的誘導作用。這與易飛等[17]報道磷酸川芎嗪對CYP3A4酶活性無顯著影響的結(jié)論不一致，可能與相關模型有關，有待進一步研究。另外，PXR作為核受體超家族成員，是CYP3A4的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在體內(nèi)藥物的吸收、分布、代謝和排泄過程中，PXR起到重要的調(diào)節(jié)作用。外源性藥物可使PXR構(gòu)象發(fā)生改變而激活，活化后的PXR可進入細胞核，與RXR形成二聚體[7]，從而與CYP3A4的核受體反應元件結(jié)合，調(diào)控CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達[18]，發(fā)揮誘導或抑制作用。因此，本文在研究川芎嗪對CYP3A4酶活性影響時，以PXR拮抗劑酮康唑作用于HepG2細胞，同時給予不同濃度的川芎嗪，研究其作用的相關機制。結(jié)果表明，川芎嗪能拮抗酮康唑?qū)YP3A4酶活性的抑制作用，提示川芎嗪是通過增加PXR的轉(zhuǎn)錄活性而增加人肝癌HepG2細胞藥物代謝酶CYP3A4的活性。

本文通過研究川芎嗪對藥物代謝酶CYP3A4的影響，為川芎嗪在臨床上的合理用藥提供理論基礎，在臨床上川芎嗪與CYP3A4的底物聯(lián)合使用時，需注意藥物代謝間的相互作用，降低和避免川芎嗪和其他藥物相互作用時產(chǎn)生不良反應。此外，本文還研究了川芎嗪對藥物代謝酶的作用機制，探討其對PXR的影響，但是仍然存在很多問題需要進一步解決，如PXR是否調(diào)節(jié)藥物相關代謝酶的其他亞型，不同的核受體在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程中有何關聯(lián)等。其確切作用機制還需要進行深入的研究，闡明川芎嗪代謝的酶學機制任重而道遠。

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EffectsoftetramethylpyrazineondrugmetabolizingenzymeCYP3A4inHepG2cellsanditsmechanism

WU Xiao-hua1,ZHANG Li2,ZHU Lei1,DAI Ya-ping2

(1.Department of Pharmacy,First People′s Hospital of Wujiang District, Suzhou 215200,China;2.Jiangsu Institute of Food and Drug Supervision and Inspection, Nanjing 210008,China)

ObjectiveTo study the effects of tetramethylpyrazineon on the activity of CYP3A4 in HepG2 cell and its mechanism.MethodsThe HepG2 cells were treated with different concentrations of tetramethylpyrazine for 48 hours and then the optical density (OD) value was determined by MTT,and the concentration was selected which had little influence on the survival rate of the cells.Blank group,ketoconazole group,group of different concentration of tetramethylpyrazine,and group of both ketoconazole and different concentration of tetramethylpyrazine were set up.CYP3A4 plasmid and PXR plasmid were transfected into the HepG2 cells and then different concentration of tetramethylpyrazine,ketoconazole and both ketoconazole and different concentration of tetramethylpyrazine were incubated with the HepG2 cells.Effects of different concentrations of tetramethylpyrazine on the activities of CYP3A4 and PXR enzymes were detected by luciferase reporter gene technique.The expression of CYP3A4 and PXR protein in HepG2 cells was detected by Western blot.ResultsTetramethylpyrazine could increase the activity of CYP3A4 in a dose-dependent manner,and also increase the expression level of CYP3A4 protein.Tetramethylpyrazine could increase the PXR transcription activity and increase the PXR protein level in a dose-dependent manner.ConclusionTetramethylpyrazine can induce the drug metabolizing enzyme CYP3A4 by activating PXR receptor.

Tetramethylpyrazine;HepG2 cell;CYP3A4;PXR

2017-04-14

1.蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，蘇州215200；

2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，南京 210008

10.14053/j.cnki.ppcr.201711003