丙酮酸激酶M2蛋白表達(dá)與各期胃癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

陳光俠 何曉華 吳倩倩 高立永 吳傳楠 陳卓

·論著·

丙酮酸激酶M2蛋白表達(dá)與各期胃癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性分析

陳光俠 何曉華 吳倩倩 高立永 吳傳楠 陳卓

目的觀察丙酮酸激酶M2(PKM2)蛋白在胃癌組織表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。方法淺表性胃炎病人20例(對照組)，早期胃癌組32例，進(jìn)展期胃癌組40例。應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測PKM2蛋白在上述組織中表達(dá)情況，并統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果對照組和早期胃癌組中PKM2陽性表達(dá)率分別為5%(1/20)和61.8%(21/34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)展期胃癌組織中PKM2蛋白表達(dá)水平與TNM分期、病理分級相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。早期胃癌PKM2表達(dá)強(qiáng)度越高，預(yù)后越差(P<0.05)；TNM分期是進(jìn)展期胃癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)KM2蛋白在胃癌組織中表達(dá)升高，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，并影響病人預(yù)后。PKM2蛋白表達(dá)與進(jìn)展期胃癌TNM分期、病理分級相關(guān)。

胃癌； 丙酮酸脫氫酶2； 臨床病理特征； 預(yù)后

有研究表明，丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)的高表達(dá)可促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移，并可作為預(yù)后不良的指標(biāo)，但對非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后評估卻毫無價(jià)值[1-2]。PKM2可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平Bcl-xL表達(dá)從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長[3]。我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測20例淺表性胃炎，32例早期胃癌及40例不同分期的進(jìn)展期胃癌PKM2蛋白的表達(dá)，并分析其表達(dá)與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

2006年1月～2013年12月，我院行胃癌切除的胃癌組織標(biāo)本40例(進(jìn)展期胃癌組)，行早期胃癌外科切除的早期胃癌標(biāo)本32例(早期胃癌組)，內(nèi)鏡下活檢淺表性胃炎組織標(biāo)本20例(對照組)，術(shù)前均未行放療、化療及免疫治療。共92例，其中男性45例，女性47例。年齡21～80歲，平均年齡55.39歲。胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)及臨床分期參照文獻(xiàn)[4]，早期胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]。

二、方法

20例淺表性胃炎、32例早期胃癌及40例進(jìn)展期胃癌組織蠟塊連續(xù)切片，采用免疫組化SP法，按照烤片、水化、抗原修復(fù)、封閉，1∶1000比例稀釋PKM2一抗，過夜后加入二抗，DAB顯色、蘇木素襯染、酒精分化，脫水，透明、中性樹膠封片、顯微鏡觀察等步驟進(jìn)行。兔抗人PKM2抗體均購自Abcam公司，SP檢測試劑盒及DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PKM2以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片由2位資深病理專家讀片，于400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野得分由陽性細(xì)胞比例或顯色強(qiáng)度決定。陽性細(xì)胞比例≤25%為0分，26～50%為1分，51～75%為2分，≥76%為3分；顯色強(qiáng)度未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，PKM2表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理因素之間的關(guān)系應(yīng)用Chi-square test或確切概率法，與生存時(shí)間的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存率曲線，運(yùn)用COX回歸模型進(jìn)行多因素比例風(fēng)險(xiǎn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PKM2在對照組、早期胃癌組和進(jìn)展期胃癌組中表達(dá)：均值分別為0.05、1.067、1.316，早期胃癌組及進(jìn)展期胃癌組中PKM2表達(dá)水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PKM2的表達(dá)水平在早期胃癌組即明顯升高，當(dāng)腫瘤繼續(xù)發(fā)展至進(jìn)展期，雖然其表達(dá)水平繼續(xù)升高，但在進(jìn)展期胃癌組與早期胃癌組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.PKM2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系：早期胃癌組織中PKM2表達(dá)陽性21例，陰性11例。PKM2表達(dá)與病人年齡、性別、病理分級無明顯相關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。進(jìn)展期胃癌組織中PKM2表達(dá)陽性28例，陰性12例。PKM2表達(dá)與TNM分期、病理分級相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與年齡、性別無明顯相關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 早期胃癌中PKM2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

注：統(tǒng)計(jì)方法為確切概率法

表2 進(jìn)展期胃癌中PKM2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

注：統(tǒng)計(jì)方法為Chi-square test

3.PKM2表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系：所有病例隨訪時(shí)間48～94個(gè)月，平均72.9個(gè)月。20例淺表性胃炎組病人全部完成隨訪，無死亡，存活率100%。32例早期胃癌組病人全部隨訪完成，隨訪率100%，因病死亡3例，采用Kaplan-Meier法對PKM2表達(dá)進(jìn)行累積生存時(shí)間分析；PKM2表達(dá)強(qiáng)度越高，預(yù)后越差(P<0.05)。見圖2A。40例進(jìn)展期癌病人，失訪23例，失訪率57.5%，存活10例，死亡7例，死亡率17.5%，同樣采用Kaplan-Meier法對PKM2表達(dá)進(jìn)行累積生存時(shí)間分析，PKM2表達(dá)與預(yù)后無明顯相關(guān)(P>0.05)。見圖2B。

(A)早期胃癌PKM2表達(dá)強(qiáng)度越高，預(yù)后越差(χ2=11.677，P=0.009)；(B)進(jìn)展期胃癌PKM2表達(dá)強(qiáng)度與預(yù)后無關(guān)。圖2 不同分期胃癌PKM2表達(dá)強(qiáng)度與病人預(yù)后的關(guān)系

4.胃癌病人生存時(shí)間的多因素分析：運(yùn)用COX回歸多因素模型分別對早期胃癌及進(jìn)展期胃癌各因素進(jìn)行分析，各變量賦值如下：年齡：<60歲賦值為0，≥60歲賦值為1；性別：女賦值為0，男賦值為1；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期賦值為0，Ⅲ/Ⅳ期賦值為1；病理類型：中高分化賦值為0，低分化/印戒細(xì)胞癌賦值為1；PKM2表達(dá)：無表達(dá)賦值為0，有表達(dá)賦值為1；T表示病人生存時(shí)間，單位為月；Y表示病人結(jié)局：死亡賦值為0，截尾賦值為1(早期胃癌組無TNM分期，病理類型：中高分化及瘤變賦值為0，低分化/印戒細(xì)胞癌賦值為1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：早期胃癌COX回歸多因素模型分析，各協(xié)變量對病人生存時(shí)間的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)展期胃癌COX回歸多因素模型(P<0.05)，此檢驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNM分期是進(jìn)展期胃癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。在進(jìn)展期胃癌中各協(xié)變量在均值時(shí)的生存曲線見圖3。

圖3 進(jìn)展期胃癌中各協(xié)變量在均值時(shí)的生存曲線

討 論

全球范圍內(nèi)，胃癌是第3位癌癥相關(guān)的死亡原因[6]。我國胃癌的發(fā)病率處于惡性腫瘤的第2位。腫瘤的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為是引起死亡的重要原因。腫瘤維持其惡性生物學(xué)行為需要充足的能量供給，糖代謝是腫瘤最主要的供能方式。根據(jù)“Warburg效應(yīng)”，腫瘤細(xì)胞在缺氧或不缺氧條件下，都優(yōu)先進(jìn)行糖酵解[7]，PKM2是糖酵解的關(guān)鍵酶[8]。有研究表明，在食管鱗癌組織中，PKM2表達(dá)升高，且與病人預(yù)后不良有關(guān)。PKM2亦可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，影響病人預(yù)后[9-10]。因此，靶向PKM2信號通路成為一種重要的抗腫瘤治療策略[11]。

我們通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，PKM2的表達(dá)水平在對照組僅有1例呈陽性表達(dá)，早期胃癌組即明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在早期胃癌，腫瘤就開始依靠著高水平的糖酵解提供生長代謝的能量來源，而當(dāng)胃癌繼續(xù)發(fā)展至進(jìn)展期，其表達(dá)水平繼續(xù)升高，但與早期胃癌組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明糖酵解的供能方式貫穿在整個(gè)胃癌的進(jìn)展過程中。行Kaplan-Meier法進(jìn)行累積生存分析發(fā)現(xiàn)，在早期胃癌組織中，PKM2表達(dá)強(qiáng)度越高，預(yù)后越差。進(jìn)展期胃癌預(yù)后差，5年生存率低，失訪率高。通過COX回歸多因素模型分析，在進(jìn)展期胃癌組織中，TNM分期的相對危險(xiǎn)度是8.925，是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。TNM分期能夠較好的反映腫瘤進(jìn)展的程度，TNM分期越高，病人預(yù)后越差。Angelov等[12]回顧性研究統(tǒng)計(jì)分析155例胃癌病人預(yù)后與臨床病理參數(shù)(包括年齡，性別，血型，腫瘤分化程度，腫瘤位置，手術(shù)類型和輔助治療)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNM分期是影響病人預(yù)后的唯一因素。在進(jìn)展期胃癌組織中，PKM2表達(dá)與TNM分期和病理分級有相關(guān)性，但在進(jìn)一步的COX多因素模型分析中，卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與各協(xié)變量之間相互作用及病例樣本量較少有關(guān)。

PKM2在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，阻斷其信號通路，有可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。有研究表明，二甲雙胍可通過抑制HIF1α/PKM2信號通路，從而抑制腫瘤糖代謝，進(jìn)一步抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為[13]。對內(nèi)鏡下活組織檢查或術(shù)后組織切片免疫組化檢測，PKM2可作為判斷早期胃癌病人預(yù)后的有用指標(biāo)。

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AcorrelationanalysisoftheexpressionofpyruvatekinaseM2andthepathologyandprognosisingastriccancer

CHENGuangxia，HEXiaohua，WUQianqian，etal.
(DepartmentofGastroenterology，DepartmentofPathology，F(xiàn)irstPeople'sHospitalofXuzhou，Xuzhou221000，China)

ObjectiveTo observe the expression of pyruvate kinase(PK)M2 in gastric cancer(GC)and analyze its relation with the clinicopathological features and prognosis and of GC.MethodsTwenty cases with superficial gastritis were made as control group，32 cases with early gastric carcinoma and 40 cases with advanced GC were made as experiment groups.Immunohistochemistry were used to detect the protein expression of PKM2 in GC tissues from the three groups.And the correlation between the expression level of PKM2 and clinicopathological characteristics and prognosis was analyzed.ResultsThe expression of PKM2 in the control group and early GC group was 5.0%(1/20)and 61.8%(21/34)，respectively，the difference was significant(P<0.05).The expression level of PKM2 was associated with TNM stage(P<0.05)and pathological grade(P<0.01)in the advanced GC group.The higher expression of PKM2 in early GC suggested its poorer prognosis(χ2=11.677，P=0.009).And TNM staging was an independent factor affecting the prognosis of advanced GC(P<0.05).ConclusionThe expression of PKM2 in GC tissue promotes the occurrence，development of GC and impacts on its prognosis.It is associated with TNM stage and pathological grade in advanced GC.

gastric cancer； pyruvate kinase M2； clinicopathological features； prognosis

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.11.019

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81602101)；江蘇省333工程科研項(xiàng)目資助(BRA2016277)；江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金(JLY20160145)；江蘇省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃基金(Q201413)；徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(社會(huì)發(fā)展- KC14SH007)，徐州市衛(wèi)計(jì)委青年后備人才資助(2014002)

221002 江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院消化科(陳光俠、何曉華、吳倩倩、吳傳楠、陳卓)；病理科(高立永)

何曉華，Email：hexiaohua00@126.com

2017-04-12)

楊澤平)