大孔樹脂分離純化訶子鞣質(zhì)的工藝研究*

李 菁，劉洪嬌，張 旭，林思土，賈 茹，于美娥，王 巍

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

大孔樹脂分離純化訶子鞣質(zhì)的工藝研究*

李 菁，劉洪嬌，張 旭，林思土，賈 茹，于美娥，王 巍*

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

本文研究了大孔樹脂分離純化訶子鞣質(zhì)的方法。先對(duì)7種大孔吸附樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附與解吸性能的考察，進(jìn)一步對(duì)性能相近的HPD600和NKA-9樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與洗脫效果比較，選定以NKA-9對(duì)訶子鞣質(zhì)進(jìn)行分離純化。優(yōu)化的工藝條件為：3BV濃度為66.7mg·mL-1的上樣液，以1BV·h-1速度通過層析柱，以3BV水洗脫，再以5BV的60%乙醇洗脫，洗脫流速均為3BV·h-1。結(jié)果表明，沒食子酸和鞣花酸的平均回收率分別為66.05%和84.12%，在干膏中的純度分別為3.71%和10.38%。經(jīng)過該工藝純化后，訶子鞣質(zhì)得到富集。

訶子；鞣質(zhì)；大孔樹脂；純化；HPLC

鞣質(zhì)為一類多元酚類化合物，分為可水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)，其中可水解鞣質(zhì)具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗脂質(zhì)過氧化等藥理作用，是許多常用中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。訶子是一種傳統(tǒng)中藥，主產(chǎn)于云南、廣西、廣東，為藏醫(yī)和蒙醫(yī)所常用，被稱為“蒙藥之王”[2]。訶子鞣質(zhì)為可水解鞣質(zhì)，以沒食子鞣質(zhì)和鞣花鞣質(zhì)為主，經(jīng)過對(duì)訶子鞣質(zhì)HPLC分析發(fā)現(xiàn)，沒食子酸可作為極性較大鞣質(zhì)的代表成分，而鞣花酸屬于極性偏小的成分。為了能夠得到更多、更純的訶子鞣質(zhì)，可以通過控制這兩個(gè)不同極性代表性成分的含量，對(duì)訶子鞣質(zhì)的收率和純度進(jìn)行衡量。本實(shí)驗(yàn)以HPLC法測(cè)定沒食子酸和鞣花酸含量，以此為基礎(chǔ)，采用大孔樹脂法對(duì)訶子鞣質(zhì)進(jìn)行純化，建立最佳純化工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫科技公司）；FA1004B分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（上海精密儀器儀表有限公司）；XMTD7000電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；EURSON優(yōu)盛電陶爐。

訶子藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室王添敏老師鑒定，為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實(shí)，產(chǎn)地廣西；沒食子酸和鞣花酸對(duì)照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司（含量測(cè)定用，純度＞98%）；甲醇為色譜純，乙醇、磷酸為分析純，均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸和鞣花酸的含量測(cè)定[3]色譜條件色譜柱：DiamonsilPlusC18-A柱（250×4.6mm，5μm）；以甲醇（A）-0.1%磷酸水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。0～10min，B 為 98%～90%；10～12min，B 為 90%～52%；12～25min，B 為 48%。檢測(cè)波長(zhǎng)為 270nm；柱溫：25℃；流速：1mL·min-1。

對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的沒食子酸和鞣花酸對(duì)照品適量，分別加甲醇配制成對(duì)照品貯備液。精密吸取各貯備液適量，配制得含沒食子酸 0.04704mg·mL-1和鞣花酸 0.0558mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

測(cè)定方法 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5μL，注入高校液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算沒食子酸和鞣花酸的含量。

1.2.2 總鞣質(zhì)的提取 取訶子藥材200g，砸取果肉，加70%乙醇8倍量，浸泡0.5h，回流提取2次，每次1.5h，合并提取液，減壓回收乙醇，水浴濃縮至藥液無醇味；藥渣再以6倍量水提取2次，每次1.5h。醇提后濃縮液與兩次水提所得的水提液合并，將總體積濃縮至藥材重的10倍量，經(jīng)臺(tái)式離心機(jī)4000r·min-1離心20min，作為樹脂純化上樣液備用。1.2.3 大孔吸附樹脂的選擇 樹脂的預(yù)處理取不同型號(hào)的樹脂，用95%乙醇充分浸泡24h后，用蒸餾水洗至無醇味。分別以4%鹽酸溶液3BV沖洗，蒸餾水洗至中性，再以5%氫氧化鈉溶液3BV沖洗，蒸餾水洗至中性，抽濾至不滴水，備用[4]。

靜態(tài)吸附與解吸性能比較 取上述處理后的不同型號(hào)樹脂各2g，置于50mL具塞錐形瓶中，分別精密加入上樣液（生藥質(zhì)量濃度c=100mg·mL-1）10mL，浸泡24 h（時(shí)時(shí)振搖），待充分吸附后，抽濾至干，濾液作為供試品溶液，測(cè)定未被吸附的沒食子酸和鞣花酸的量（Q1）。將抽干后的各型號(hào)樹脂中分別精密加入95%乙醇25mL，浸泡24h（時(shí)時(shí)振搖），抽濾至干，濾液，作為供試品溶液，測(cè)定被吸附后能夠被洗脫的沒食子酸和鞣花酸的量（Q2）。根據(jù)以下公式分別計(jì)算不同型號(hào)樹脂對(duì)沒食子酸和鞣花酸的吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）。

式中 Q：上樣量；Q1：未吸附量；Q2：洗脫量。

動(dòng)態(tài)吸附及洗脫能力考察取經(jīng)處理的樹脂3g（約5mL），裝入直徑為1cm，長(zhǎng)度為30cm的玻璃柱中。分別精密吸取上樣液20mL（4BV），控制流速為1.5BV·h-1，收集流出液，測(cè)定未被吸附的沒食子酸和鞣花酸的量（Q1）；樹脂床以 10mL（2BV）水洗，流速控制為 3BV·h-1，收集水洗液，測(cè)定水洗脫量（Q2）；樹脂床再以 15mL（3BV）60%乙醇洗脫（3BV·h-1），收集醇洗液，測(cè)定醇洗脫量（Q3）。分別計(jì)算動(dòng)態(tài)情況下樹脂對(duì)沒食子酸和鞣花酸的吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）。

1.2.4 樹脂純化工藝的建立[5,6]

上樣濃度考察 精密吸取1.2.2項(xiàng)下的上樣液4份，每份20mL，分別做以下處理：（1）水浴濃縮至10mL，使生藥濃度為 200mg·mL-1；（2） 保持原濃度不變；（3）加水稀釋至 30mL，使生藥濃度為 66.7mg·mL-1；（4）加水稀釋至40mL，使生藥濃度為50mg·mL-1。將4份溶液分別作為上樣液，按“動(dòng)態(tài)吸附及洗脫能力考察”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，考察上樣濃度對(duì)吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）的影響。

上樣液pH值考察 精密吸取上樣液3份，分別做以下處理，（1）保持原pH值不變，pH值為3.2；（2）調(diào)pH值為2.0；（3）調(diào)pH值為1.5。將3份溶液分別作為上樣液，按“動(dòng)態(tài)吸附及洗脫能力考察”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，考察上樣pH值對(duì)吸附率（A）、解吸率（D）和回收率（R）的影響。

動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線繪制 取直徑為1cm，長(zhǎng)度為30cm的玻璃柱3支，各裝入大孔樹脂6g（約10mL），以100mL藥液上樣，分別控制流速為1、2、3BV·h-1，每 1BV（10mL）收集一次，測(cè)定各流份中沒食子酸和鞣花酸的含量，繪制泄漏曲線，確定最佳上樣量及上樣速度。

洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)考察取上述玻璃柱2支，各裝入樹脂3g（約5mL），以15mL藥液上樣，控制流速為1BV·h-1，當(dāng)藥液全部流出后，以2BV水洗。（1）以10%→30%→50%→70%乙醇各3BV洗脫；（2）以20%→40%→60%→80%乙醇各3 BV洗脫，兩柱洗脫流速均為3BV·h-1，分別手機(jī)各段醇洗脫液，測(cè)定。洗脫曲線考察取上述玻璃柱3支，分別裝入樹脂6g（約 10mL），以 30mL藥液上樣，流速為 1BV·hL，當(dāng)藥液全部流出后，分別以4BV水洗，再以60%乙醇8BV 洗脫，流速控制為 1、2、3BV·h-1，每 1BV 收集一份洗脫液，測(cè)定，繪制洗脫曲線，確定最佳洗脫劑體積及洗脫速度。

1.2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取直徑為1.5cm，長(zhǎng)度為30cm的玻璃柱3支，將建立的純化工藝放大10倍，進(jìn)行初步驗(yàn)證試驗(yàn)，分別收集水洗液和醇洗脫液，回收溶劑，水浴濃縮至干，冷凍干燥制得干膏，HPLC法測(cè)定各干膏中沒食子酸和鞣花酸的含量，計(jì)算收率及純度。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附與解吸性能比較

考察7種不同極性的大孔吸附樹脂對(duì)訶子鞣質(zhì)的吸附與解吸性能，結(jié)果表明HPD600和NKA-9對(duì)沒食子酸和鞣花酸的吸附能力和洗脫能力均較好，回收率均可達(dá)80%以上，結(jié)果見表1。

表1 靜態(tài)吸附與解吸性能比較（%）Tab.1 Comparison of static adsorption and desorption performances

2.2 動(dòng)態(tài)吸附及洗脫能力考察

對(duì)HPD600和NKA-9兩種樹脂進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)態(tài)吸附與洗脫性能考察。結(jié)果表明，在動(dòng)態(tài)過程中，NKA-9對(duì)沒食子酸和鞣花酸的回收率優(yōu)于HPD600，因此，本試驗(yàn)采用NKA-9對(duì)訶子鞣質(zhì)進(jìn)行純化，建立純化工藝。結(jié)果見表2。

表2 動(dòng)態(tài)吸附與解吸能力比較（%）Tab.2 Comparison of dynamic adsorption and desorption performances

2.3 上樣濃度

考察 4種濃度下的沒食子酸吸附率分別為85.36%、74.43%、80.49%、74.69%，鞣花酸的吸附率分別為78.30%、88.22%、93.70%、92.68%；沒食子酸的回收率分別為83.18%、74.36%、79.65%、69.87%，鞣花酸的回收率分別為62.98%、83.31%、90.25%、88.19%?？梢娚蠘右簼舛葘?duì)沒食子酸的吸附率無明顯影響，隨著上樣液濃度變小，鞣花酸的吸附率有增大趨勢(shì)；隨上樣液濃度減小，沒食子酸的回收率會(huì)略有減小，但鞣花酸的回收率卻顯著增高。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮，確定上樣液為藥材提取后藥液適當(dāng)濃縮至藥材量15倍體積，即生藥濃度為66.7mg·mL-1比較合適。

2.4 上樣液pH值考察

由于鞣質(zhì)自身具有較強(qiáng)的酸性，為保證沒食子酸和鞣花酸在樹脂純化過程中不發(fā)生離解，需對(duì)上樣液pH值進(jìn)行考察。3種pH值條件下沒食子酸吸附率分別為81.23%、85.36%、88.49%，鞣花酸的吸附率分別為92.91%、72.14%、63.52%；沒食子酸的回收率分別為78.25%、80.86%、82.12%，鞣花酸的回收率分別為90.43%、67.45%、60.36%?？梢婋S上樣液pH值減小，沒食子酸的吸附率與回收率均略有升高，但鞣花酸的吸附率和回收率均顯著降低。由于鞣花酸在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是由兩分子沒食子酸縮合而成，上樣液酸性增強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致鞣花酸一定程度上的水解，因此在純化過程中，不宜采用較低的pH值環(huán)境，保持原有酸度即可。

2.5 泄漏曲線繪制

比較不同上樣速度時(shí)的動(dòng)態(tài)吸附性能，繪制吸附泄漏曲線。結(jié)果可以看出，由于訶子鞣質(zhì)自身極性比較大，即使選擇極性的大孔樹脂，其泄漏還是比較嚴(yán)重，并且上樣速度越快，泄漏越快。一般情況下常以10%為泄漏點(diǎn)，超過這個(gè)點(diǎn)認(rèn)為樹脂不能對(duì)化學(xué)成分有較好的吸附。本實(shí)驗(yàn)中以極性大的沒食子酸和極性相對(duì)小的鞣花酸為指標(biāo)綜合考慮樹脂的吸附能力，結(jié)合兩者的實(shí)際情況，以鞣花酸泄漏10%、沒食子酸泄漏20%為節(jié)點(diǎn)，進(jìn)行方法的確立，選擇上樣流速為1BV·h-1，上樣體積為3BV較為合適。不同流速下的泄漏曲線見圖1。

圖1 動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線Fig.1 Dynamic adsorption leakage curve

2.6 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)考察

上樣后分別以水洗和不同濃度的乙醇洗脫，每1 BV收集1份，計(jì)算累積解吸率，結(jié)果表明，沒食子酸極性較大，上樣后用水洗滌，即有70%左右被洗脫下來；鞣花酸水解吸率不高，但可被60%乙醇基本洗脫完全，因此，洗脫溶劑選擇先用水洗，再用60%乙醇洗脫。結(jié)果見圖2。

圖2 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on desorption performances

2.7 洗脫劑曲線考察

由于沒食子酸極性較大，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)上樣后以水沖柱，沒食子酸即可被洗脫，因此先后考察水洗用量和醇洗用量。結(jié)果表明，3BV水洗后增大洗脫用水量，解吸率沒有明顯變化，在75%～80%之間；鞣花酸的水解吸率均小于10%，但能夠被60%乙醇充分洗脫，當(dāng)洗脫劑用量為5BV時(shí)，解吸率可達(dá)94%以上，增大洗脫劑用量解吸率變化不大。比較不同流速下的解吸率，結(jié)果表明，洗脫速度對(duì)解吸率無顯著影響，為節(jié)省工時(shí)，可選擇3BV·h-1。結(jié)果見圖3。

圖3 動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.3 Dynamic elution curve

2.8 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)各試驗(yàn)項(xiàng)目考察結(jié)果，確定訶子鞣質(zhì)樹脂分離純化工藝為：以NKA-9為吸附樹脂，上樣液濃度為藥材重量的15倍體積，上樣藥液體積為3BV，吸附流速為1BV·h-1，當(dāng)藥液降至樹脂床頂端后，以3BV水洗脫，再以5BV的60%乙醇洗脫，洗脫流速均為3BV·h-1。將該工藝放大10倍進(jìn)行3份平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果沒食子酸和鞣花酸的平均回收率分別為66.05%和84.12%，在干膏中的純度分別為3.71%和10.38%。

3 結(jié)論

訶子鞣質(zhì)中各成分極性差異較大，以沒食子酸和鞣花酸為代表。沒食子酸在不同型號(hào)的大孔樹脂上吸附能力相對(duì)于鞣花酸都差得多，且非常容易被水洗脫，考慮到實(shí)際情況，盡可能兼顧沒食子酸和鞣花酸兩種成分，在洗脫過程中采用先水洗收集以沒食子酸為主的強(qiáng)極性鞣質(zhì)，再以醇洗脫，收集以鞣花酸為主的弱極性鞣質(zhì)，其中弱極性鞣質(zhì)純化效果較好，而強(qiáng)極性鞣質(zhì)可能與多糖、無機(jī)鹽等成分仍然混合，采用其他手段進(jìn)一步純化。

通常對(duì)鞣質(zhì)進(jìn)行純化工藝研究多采用磷鉬鎢酸-干酪素法測(cè)定總鞣質(zhì)的含量，本試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定大極性部分代表成分沒食子酸和小極性部分代表成分鞣花酸，通過控制兩種成分的含量，進(jìn)一步衡量訶子鞣質(zhì)的分離純化情況，可以減少分光光度法在顯色過程中存在的誤差，操作更簡(jiǎn)單，結(jié)果更準(zhǔn)確。

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Seperation an purification of tannins from terminalia chebula retz.by macroporous resin*

LI Jing，LIU Hong-jiao，ZHANG Xu，LIN Si-tu,JIA Ru，YU Mei-e,WANG Wei*
（School of Pharmacy,Liaoning University of TCM,Dalian 116600,China）

The method for seperation and purification of tannins from Terminalia chebula Retz.by macroporous resin were studied in this work.Firstly,seven kinds of macroporous resin were screened by studing on static adsorption and desorption properties,HPD600 and NKA-9 were choosed out.Then the dynamic adsorption and elution performances were compared between HPD600 and NKA-9,and NKA-9 was chosen as the purification macroporous resin of tannins of Terminalia chebula Retz..Finally,the optimum pruification conditions were determined as follows:3BV of 66.7mg·mL-1sample liquid was flowed through NKA-9 resin column at a speed of 1BV·h-1,then the adsorption tannins could be eluted successively with 3BV of H2O and 5 BV of 60%ethanol at 3BV·h-1.After purification,the average recovery rate of gallic acid and ellagic acid was 66.05%and 84.12%,the purity in dry paste was 3.71%and 10.38%respectively.After treatment with macroporous resin NKA-9,the tannins of Terminalia chebula Retz.were enriched.

terminalia chebula retz.;tannins;macroporous resin;seperation and purification;HPLC

R284.1

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171115

2017-07-27

遼寧省博士啟動(dòng)基金（NO.201501097）；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（No.201610162092）

李 菁（1995-），女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，中藥學(xué)專業(yè)，在讀本科生。

王 ?。?979-），女，博士，副教授，主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及新藥開發(fā)研究。