負(fù)載雙抗癌藥的雙層微球設(shè)計(jì)及藥物釋放

王曉丹，景曉燕，李茹民

(1.哈爾濱工程大學(xué) 材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)材料與工程中心，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150050)

負(fù)載雙抗癌藥的雙層微球設(shè)計(jì)及藥物釋放

王曉丹1,2，景曉燕1，李茹民1

(1.哈爾濱工程大學(xué) 材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)材料與工程中心，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150050)

為了研究親水性抗癌藥物和親油性抗癌藥物的共存問題，本文采用溶劑揮發(fā)法，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為載體，以姜黃素和阿霉素為模板藥物，合成了負(fù)載兩種抗癌藥物的雙層微球。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：合成的雙層微球粒徑分布均勻，分散性良好；由于雙層可降解聚合物的引入，微球的初期藥物釋放得到了降低，阿霉素和姜黃素的藥物釋放時(shí)間分別為34 d和39 d，兩種藥物的總釋放時(shí)間得到了延長；在21 d內(nèi)載藥微球進(jìn)行逐步的降解。為雙重載藥體系的研究打下了基礎(chǔ)。

雙層結(jié)構(gòu)； 微球； 給藥系統(tǒng)； 聚乳酸-羥基乙酸共聚物； 紅外光譜； 粒徑； 阿霉素； 姜黃素

藥物載體材料分為可降解生物材料和非降解生物材料兩類?？山到馍锊牧弦云湓诎b、生物材料、薄膜材料以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[1]。在諸多的可降解生物材料中，國際PDA組織認(rèn)證的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)以其良好的生物相容性、成球性、無毒性等性能在藥物輸送、醫(yī)用工程和分子成像等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。

載藥微球或微囊是應(yīng)用廣泛的功能性材料[4]。過去，研究者采用溶劑揮發(fā)法(W/O/W，O/W)制備了多種PLGA可生物降解單層載藥微球[5-6]。這些傳統(tǒng)的微球合成方法兩個(gè)最大的缺點(diǎn)是突釋效應(yīng)較大和釋放時(shí)間較短，從而降低了藥物的有效期和治療效果[7]。近幾年，研究者應(yīng)用不同方法合成的雙層微球有效的避免了以上缺點(diǎn)[8-9]。在眾多的制備方法中，W1/O1/O2/W2溶劑揮發(fā)法是一種能降低雙層微球的藥物突釋和延長藥物釋放時(shí)間的有效的方法[10]。Wang Zheng采用這種方法首次制備出了雙層載藥微球[11]。同時(shí)，Burcu Devrim等嘗試把卵清蛋白負(fù)載于雙層微球中[12]。對(duì)于載藥微球的研究，人們更多關(guān)注于負(fù)載一種藥物的微球或微囊的制備[13-14]。近年來，隨著載藥體系的迅速發(fā)展，對(duì)于雙重載藥體系的研究越來越受到人們的關(guān)注。單一給藥體系已經(jīng)不能滿足診療需求。一些可以進(jìn)行聯(lián)合使用的藥物對(duì)于特殊疾病的治療起到良好的治療效果。同時(shí)負(fù)載于體系中的雙重藥物可以對(duì)病患部位可以起到協(xié)同治療的作用，增強(qiáng)藥效[15-16]。而親水性藥物和親油性藥物由于其溶解性不同，又很難共存于同一體系中。在雙重給藥系統(tǒng)中，兩種藥物協(xié)同作用于病變部位，提高載藥系統(tǒng)的診療效果的同時(shí)降低了對(duì)生物體的毒副作用。目前，一些新型的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于合成雙層給藥系統(tǒng)。Xu Qingxing等利用粒子精密制造技術(shù)合成了負(fù)載殼聚糖p53和阿霉素的雙載藥系統(tǒng)[17]。Xu Jiqing 等把牛血清白蛋白和安息香包覆于殼聚糖微球中[18]。隨著研究者對(duì)于功能性單獨(dú)載藥微球或微囊研究的不斷成熟和完善，雙重抗癌藥物的研究已經(jīng)逐漸成為近年的研究熱點(diǎn)。雙重抗癌藥物共同作用于癌細(xì)胞，能夠提高治療效果。本文通過把溶劑揮發(fā)W1/O1/O2/W2法和雙重給藥體系結(jié)合起來，成功的把兩種有效的抗癌藥物姜黃素(親油性)和阿霉素(親水性)結(jié)合在同一系統(tǒng)中。

1 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析

1.1試劑與儀器

PLGA (50∶50) 和 PLGA (75∶25)購于山東醫(yī)療器械有限公司；阿霉素購于阿拉丁試劑公司；姜黃素購于合肥生物技術(shù)有限公司；聚乙烯醇 (分子量為1 750)和二氯甲烷購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，所有試劑均為分析純。

分析測(cè)試儀器如下：掃描電子顯微鏡-能譜儀(日本，JSM-6480 A型)；工作電壓20 kV，分辨率3 nm。紅外光譜儀(美國，Avater 370型)，溴化鉀壓片，掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為32次/min；粒徑分布議(LS603型)；紫外-可見分光光度計(jì)(日本，UV-1601型)；超聲波細(xì)胞破碎儀(中國，BILON96-I型)。

1.2實(shí)驗(yàn)過程

本文采用W1/O1/O2/W2法，成功合成出了負(fù)載雙重抗癌藥物的雙層微球。如圖1所示，實(shí)驗(yàn)過程如下：把150 mg姜黃素和300 mg PLGA 50∶50溶解于3 mL的二氯甲烷中，并在超聲清洗機(jī)中充分混合。在上述混合液中注入0.3 mL阿霉素溶液，并在超聲波細(xì)胞破碎儀下于180 W超聲破碎3 min(開3 s，停1 s)。然后將得到的乳化液和溶解二氯甲烷的PLGA 75∶25溶液(3 mL)再次超聲破碎乳化3 min。隨后把得到的二次乳化液在磁力攪拌下用注射器滴入到100 mL聚乙烯醇(質(zhì)量體積濃度為0.5%)中。同時(shí)在800 r/min下室溫?cái)嚢? h使有機(jī)溶劑二氯甲烷揮發(fā)徹底。用蒸餾水洗滌和離心機(jī)離心三次以去除雜質(zhì)。最后冰箱冷凍24 h，通過冷凍干燥得到的微球粉末。

圖1 制備流程圖和藥物釋放Fig.1 Schematic illustration of the preparation

單層微球的合成方法類似于上述雙層微球合成過程，不同之處在于第二步和PLGA 75∶25的乳化被省略。

1.2.2 載藥量和包封率的測(cè)定

通過紫外分光光度法來測(cè)定藥物的載藥量和包封率。1 mg微球溶解于磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，超聲30 s使其混和均勻。在密閉的環(huán)境下于37 ℃。

持續(xù)攪拌。通過紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm處測(cè)定阿霉素的吸光度值。然后進(jìn)行姜黃素載藥量和包封率的實(shí)驗(yàn)，1 mg微球溶解于包含0.2 %的十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，于相同溫度下攪拌。在426 nm處測(cè)定姜黃素的吸收峰。載藥量和包封率的計(jì)算公式如下

LE%=We/Wm×100%

(1)

ΝE%=Cf/Ct×100%

隨著我國社會(huì)的不斷進(jìn)步，我國對(duì)于農(nóng)業(yè)科研的投入也越來越大，在科研中也取得了許多成果。雖然我國的各大研究機(jī)構(gòu)和高校每年都會(huì)發(fā)布上百篇的成果論文和報(bào)告，但是科研成果與實(shí)際應(yīng)用之間存在的差距卻越來越明顯，最直接的表現(xiàn)就在于目前絕大部分地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)依然需要依靠傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式和技術(shù)，對(duì)于新的科研成果應(yīng)用存在著各種困難。在我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，需要的是成本合理、實(shí)用性強(qiáng)且操作便捷的生產(chǎn)技術(shù)，這與科研單位研究的國際高精尖技術(shù)是存在一定差距的，使得許多研究雖然已經(jīng)完成，卻無法將其應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)的過程中。如何更好的將科研成果轉(zhuǎn)化為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，是科研人員需要思考的一個(gè)問題。

(2)

式中：LE表示載藥量，We表示微球中藥物的質(zhì)量，Wm表示微球質(zhì)量，NE表示包封率，Cf表示微球中藥物的量，Ct表示投入藥量。

1.2.3 體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)

在模擬人體正常pH(7.4)和正常溫度37 ℃下，首先進(jìn)行阿霉素的體外釋放研究。將100 mg凍干樣品放入預(yù)先處理好的透析袋中。把透析袋浸入50 mL的磷酸鹽緩沖液 (pH=7.4)中持續(xù)緩慢磁力攪拌，使阿霉素藥物透過透析袋逐漸溶解于溶液中。在特定的間隔時(shí)間點(diǎn)，在燒杯中提取3 mL溶液在紫外分光光度計(jì)下于490 nm處進(jìn)行測(cè)試阿霉素的吸光度值。同時(shí)向燒杯中及時(shí)補(bǔ)充相同體積的新鮮的緩沖溶液以保持總液量不變。而后進(jìn)行姜黃素溶出的實(shí)驗(yàn)。姜黃素的藥物緩釋實(shí)驗(yàn)過程和上述阿霉素釋放的實(shí)驗(yàn)過程相似，在相同的溫度和pH下將100 mg樣品放入透析袋中，并在釋放介質(zhì)為含0.2%的十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液 (pH=7.4) 中持續(xù)攪拌24 h。在特定時(shí)間分別于426 nm處測(cè)定姜黃素的吸光度值。經(jīng)測(cè)定計(jì)算，阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為

y=0.012 4x+0.012 (R2=0.999 3)

姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為

y=0.100 5x+0.023 9 (R2=0.991 9)

將測(cè)定的阿霉素和姜黃素的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的藥物釋放量，再根據(jù)下式計(jì)算兩種藥物的釋放率：

式中MLD為載體負(fù)載藥物的最終質(zhì)量,MSD為某一時(shí)間藥物釋放量。

2 結(jié)果與討論

2.1雙層載藥微球的形成

本文通過W1/O1/O2/W2溶劑揮發(fā)法，制備出了一種新型的同時(shí)包覆姜黃素和阿霉素兩種抗癌藥物的雙層微球，使得親水藥物和親油藥物在同一體系內(nèi)可以共存。制備路線如圖1所示：親水性藥物阿霉素溶解于蒸餾水中形成W1相，親油性藥物姜黃素溶解于PLGA50∶50中形成O1相。在超聲乳化下，二者形成W1/O1體系。隨后，形成的初乳液再次和PLGA75∶25超聲乳化形成復(fù)乳液W1/O1/O2。最后，把復(fù)乳液迅速滴入聚乙烯醇中，形成W1/O1/O2/W2體系。磁力攪拌8 h以完全揮發(fā)二氯甲烷同時(shí)使微球固化。當(dāng)兩種聚合物的濃度達(dá)到臨界濃度的時(shí)候，微球的雙層結(jié)構(gòu)得以形成。在此結(jié)構(gòu)中，親水性抗癌藥物存在于W1相中，親油性藥物被包覆于O1中。把兩種不同溶解性的藥物分別設(shè)計(jì)到不同的相中，使得同一體系兼容水溶性和油溶性兩種物質(zhì)。同時(shí)，由于PLGA50∶50和PLGA75∶25兩層油相的雙層保護(hù)使載藥微球的突釋得到了降低，同時(shí)總藥物釋放時(shí)間得到了提高。

2.2微球的形貌

圖2為雙層載藥微球的表面和內(nèi)部掃描電鏡圖。圖2(a)為載藥微球的表面形貌圖。從圖中可以看出，樣品為形狀較規(guī)則的圓形微球，表面光滑，沒有明顯的孔洞和塌陷。微球分散性良好，沒有團(tuán)聚現(xiàn)象。圖2(b)為雙層載藥微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖，從破碎的球體中可以清晰地看出微球的內(nèi)外雙層結(jié)構(gòu)。內(nèi)層為內(nèi)油相(PLGA50∶50)，外層為外油相(PLGA75∶25)。

圖2 雙層微球的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of double-walled microsphere

2.3微球的粒徑分布

圖3(a)為雙層微球的粒徑分布圖。從圖中可以看出，雙層微球的平均尺寸為12.9 μm，此尺寸相較于其他雙層微球得到了降低[11-12]，在合成過程中，如果PLGA的濃度過高，會(huì)使溶液粘度增加，從而增加微球的粒徑。PLGA濃度過低，則成球形貌不好，可以通過控制成球材料濃度來改變粒徑。因此本實(shí)驗(yàn)通過適當(dāng)?shù)慕档蚉LGA50∶50和PLGA75∶25的濃度來降低雙層微球的粒徑。同時(shí)，把復(fù)乳液(W1/O1/O2)向聚乙烯醇轉(zhuǎn)移的過程中，用醫(yī)用最小型號(hào)注射器代替滴管進(jìn)行滴加，可以控制粒徑。另外，滴入的過程中，提高磁力攪拌速度也可以使體系在固化時(shí)形成更小的微粒，使微球的粒徑得到有效的降低。在最后一步離心洗滌微球時(shí)，對(duì)微球進(jìn)行差速分離，即在500 r/min的離心速度下離心5 min，把30 μm以上的微球分離掉；在1 500 r/min的離心速度下離心5 min，把20 μm以上的微球分離掉；將得到的20 μm以下的微球重新分散于蒸餾水中，在3 000 r/min的離心速度下離心5 min，分離出15 μm左右的微球。使用差速離心，有效的降低雙層微球粒徑，同時(shí)也對(duì)微球的粒徑分布進(jìn)行了控制。

圖3(b)為單層微球的粒徑分布圖,單層微球的平均粒徑為4.2 μm。同樣可以通過上述差速離心方法控制單層微球的粒徑大小和粒徑分布。比較單層微球和雙層微球的粒徑大小，可以看出雙層微球的粒徑得到了明顯的增大。原因是單層微球只有一層PLGA50∶50成球包覆材料，而雙層微球在單層微球的基礎(chǔ)上，又多了一層PLGA75∶25的包覆。通過粒徑分布分析，可以再次確定合成的樣品具有雙層結(jié)構(gòu)。

2.4微球的紅外光譜分析

圖4為在相同條件下測(cè)定的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物50∶50、純阿霉素、純姜黃素和雙層載藥微球的紅外光譜圖。通過分析聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)50∶50的一系列特征吸收峰得知：2 938 cm-1處吸收峰歸屬于 -CH, -CH2和-CH3的伸縮振動(dòng)，1 762 cm-1、1 183 cm-1處的特征吸收峰分別歸屬于-C=O 和C-O的伸縮振動(dòng)。從純阿霉素的紅外光譜圖中可以看出:1 900～1 650 cm-1處為C=O的吸收峰，1 600～1 900 cm-1處為醌基的吸收振動(dòng)峰。同時(shí)1 602 cm-1為姜黃素中C=C的吸收峰。通過載藥微球的光譜圖可以看出，各個(gè)對(duì)應(yīng)的特征吸收峰位置沒有明顯改變，程度得到了降低。該測(cè)試研究結(jié)果表明各個(gè)目標(biāo)材料均已存在于PLGA雙層微球中。

圖3 微球的粒徑分布圖Fig.3 Size distribution of microspheres

圖4 紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectrum

2.5載藥量和包封率

載藥量和包封率是評(píng)價(jià)載藥體系的一個(gè)重要因素。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法來評(píng)價(jià)載藥量和包封率。實(shí)驗(yàn)測(cè)定的相關(guān)數(shù)據(jù)通過式(1)、(2)進(jìn)行計(jì)算，得到最終結(jié)果。阿霉素的載藥量和包封率分別為6.7±0.1%和78.6±2.2%。姜黃素的載藥量和和包封率分別為14.8±0.1%和45.2±3.1%。

2.6體外藥物釋放

姜黃素作為姜黃的主要成分，被普遍用于醫(yī)藥、食品調(diào)味、著色等領(lǐng)域。同時(shí)，由于其具有抗炎癥、抗癌性能及抗氧化劑等作用在醫(yī)療界得到廣泛應(yīng)用[19-20]。阿霉素同樣是一種得到普遍認(rèn)可的抗癌藥物，尤其針對(duì)肺癌、肝癌、軟組織肉瘤、成骨肉瘤乳、腺癌和卵巢癌等諸多癌癥有著明顯地治療效果[21-22]。雙重抗癌藥物的協(xié)同釋放有利于控制增長較快的腫瘤細(xì)胞。在生物醫(yī)療臨床醫(yī)學(xué)中有重大的應(yīng)用價(jià)值。

藥物釋放曲線如圖5所示。圖5(a)為純的阿霉素和姜黃素在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中的藥物釋放曲線。從圖中可以看出，純的阿霉素在5 h內(nèi)釋放率達(dá)91.7 %。與此同時(shí)，純姜黃素在40 h內(nèi)釋放較快，最終在53 h內(nèi)達(dá)到89.3%的釋放率。油溶性藥物在介質(zhì)中的釋放要比水溶性藥物更加緩慢。圖5(b)為微球中的阿霉素和姜黃素的釋放曲線圖。如圖所示，阿霉素在34 d內(nèi)進(jìn)行持續(xù)的藥物釋放，釋放量達(dá)到81.3%。在1 d之內(nèi)的初期釋放率為6.2%。采用W1/O1/O2/W2 方法，制得的其他雙層微球也有類似的較小初期釋放率[23]。由此可見，該方法可以有效地降低藥物的突釋，使藥物有一個(gè)平緩的釋放過程。其原因是阿霉素包覆于微球的最內(nèi)層(W1)相，在釋放的過程中要受到來自于PLGA50∶50(O1)和PLGA75∶25(O2)的兩層阻礙，因此總的釋放時(shí)間比純阿霉素要大得多。在姜黃素的藥物釋放介質(zhì)pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中加入了十二烷基硫酸鈉，以幫助姜黃素的溶出。姜黃素總釋放量為82.5%，總釋放時(shí)間為39 d，藥物的釋放沒有明顯的突釋過程。相較于其他的單層微球中姜黃素的釋放，本實(shí)驗(yàn)中的姜黃素的釋放時(shí)間得到了延長，突釋率得到了降低。根本原因在于單層微球中，負(fù)載于O1相的姜黃素直接溶解于釋放介質(zhì)中。而在雙層微球中，同樣負(fù)載于O1相的姜黃素要穿過O2相才能溶入到溶解介質(zhì)中。通過以上討論，證明了阿霉素和姜黃素被包覆于微球中。同時(shí)在內(nèi)油相和外油相的雙重保護(hù)下，藥物分子的緩釋時(shí)間和突釋得到了明顯的改善。該研究在藥物緩釋系統(tǒng)中有重大研究意義。

2.7微球降解

藥物釋放的根本原因是可降解的天然或人工合成的生物大分子在自然條件下可以自行分解成較小的分子，最后裂解成穩(wěn)定基本單元結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)采用PLGA為包覆材料，其中的酯鍵不斷水解斷裂，最終分解成乳酸。藥物釋放過程示意圖如圖1所示，黃色顆粒為姜黃素，被負(fù)載于外油相(O2)中。隨著可降解聚合物PLGA75∶25的分解，藥物逐漸的溶解于釋放介質(zhì)中。紅色顆粒為阿霉素，被負(fù)載于內(nèi)油相(PLGA50∶50，O1)中，外面又多包覆一層油相。隨著兩層聚合物的降解，阿霉素逐步溶出。如圖6所示，在微球降解8 d之后，表面開始出現(xiàn)較多的孔洞，聚合物逐漸分解。在21 d之后，微球形貌已坍塌，聚合物發(fā)生大面積降解。隨著微球的降解，藥物逐漸進(jìn)行釋放。

圖5 阿霉素和姜黃素的藥物釋放曲線Fig.5 Release curves of DOX and cur

圖6 載藥微球的降解Fig.6 The degradation of microspheres

3 結(jié)論

1)本文設(shè)計(jì)了負(fù)載溶解性不同的雙重抗癌藥物微球，以溶解性不同的兩種抗癌藥物為基底材料，以聚合物PLGA 50∶50和PLGA75∶25為成球包覆材料，成功構(gòu)建了親水性和親油性共存的可降解生物載藥體系。

2)對(duì)兩種藥物進(jìn)行了藥物緩釋分析。相較于傳統(tǒng)的單層微球，該體系的藥物緩釋時(shí)間得到增加，同時(shí)初期釋放得到降低，為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域未來對(duì)雙抗癌藥物協(xié)同作用的研究提供了參考。

3)對(duì)雙層載藥微球的降解機(jī)理及降解過程進(jìn)行了探討。結(jié)果表明在21 d內(nèi)微球進(jìn)行逐步的降解，藥物隨之釋放。

盡管本實(shí)驗(yàn)通過改變實(shí)驗(yàn)條件，使雙層微球得粒徑得以進(jìn)一步降低，但仍存在相對(duì)于單層微球尺寸偏大的問題。如何降低雙層微球尺寸而又保證載藥量和包封率不減少，期待在未來的研究中能夠得到有效解決。

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本文引用格式：

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Designofdouble-walledmicrospheresloadedwithdual-anticancerdrugsandassociateddrugrelease

WANG Xiaodan1,2, JING Xiaoyan1, LI Rumin1

(1.College of Materials Science and Chemical Engineering, Center for Biomedical Materials and Engineering, Harbin Engineering University, Harbin 150001, China; 2.College of Materials and Chemical Engineering, Heilongjiang Institute of Technology, Harbin 150050, China)

To study the coexistence of hydrophilic and hydrophobic anticancer drugs, this study describes the use of poly (lactic-co-glycolic acid) double-walled microspheres loaded with doxorubicin and curcumin employing the solvent evaporation method. Results show that the microspheres have a uniform particle size and good dispersibility. The introduction of dual biodegradable polymers reduces the initial burst and prolongs the total release time for doxorubicin and curcumin, which respectively reach 34 days and 39 days, and the microspheres degrade gradually within 21 days. This study can be used as a foundation for establishing a dual-drugs system.

double-walled structure; microspheres; drug delivery system; poly(lactic-co-glycolic acid); infrared spectroscopy; particle size; doxorubicin; curcumin

10.11990/jheu.201703090

http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1390.u.20171016.1546.010.html

R945

A

1006-7043(2017)11-1817-06

2017-03-28.

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2017-10-16.

國家國際科技合作項(xiàng)目(2015DFR50050).

王曉丹(1977-), 女, 博士研究生；

景曉燕(1956-), 女, 教授,博士生導(dǎo)師；

李茹民(1973-)，男，副教授.

李茹民，E-mail:lirumin@hrbeu.edu.cn.