番瀉葉水提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、凋亡及脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響*

劉衛(wèi)紅，崔 琳，路玲玲，李 強(qiáng)

番瀉葉水提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、凋亡及脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響*

劉衛(wèi)紅1)△，崔 琳1)，路玲玲2)，李 強(qiáng)3)

番瀉葉水提物；3T3-L1前脂肪細(xì)胞；熒光素酶

目的：觀察番瀉葉水提物(FSAE)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖及凋亡影響，并進(jìn)一步研究FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA及脂聯(lián)素啟動(dòng)子熒光素酶活性的影響。方法體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，給予不同質(zhì)量濃度FSAE刺激24 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表達(dá)，熒光定量PCR、雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)FSAE對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA和脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果不同質(zhì)量濃度FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖有抑制作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高凋亡蛋白Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)；同時(shí)，F(xiàn)SAE能夠增加3T3-L1前脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)，提高其啟動(dòng)子活性。結(jié)論上述研究結(jié)果可能為FSAE抑制肥胖提供分子生物學(xué)依據(jù)。

肥胖在全球范圍內(nèi)流行，而它發(fā)生的病理生理學(xué)核心是脂肪細(xì)胞的增殖與分化。脂肪細(xì)胞可以產(chǎn)生多種具有生物活性的脂肪細(xì)胞分泌因子(adipokines，ADS)。ADS的表達(dá)異常與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的發(fā)生密切相關(guān)[1]。因此，以脂肪細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子為對(duì)象進(jìn)行肥胖機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)。中藥治療肥胖歷史悠久，已成為減肥藥物研發(fā)的寶貴資源。番瀉葉為豆科植物狹葉番瀉或尖葉番瀉的小葉，屬于天然藥物；現(xiàn)代藥理研究表明番瀉葉中含蒽醌衍生物，其瀉下作用及刺激較含蒽醌類的其他瀉藥更強(qiáng)[2-3]。作者選取番瀉葉水提物(FoliumSennaeaqueous extracts，F(xiàn)SAE)作為研究對(duì)象，擬觀察其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、凋亡、脂聯(lián)素mRNA及其基因啟動(dòng)子活性的影響，從分子生物學(xué)方面探討番瀉葉可能具有的降脂作用。

1 材料與方法

1.1主要材料番瀉葉藥材購(gòu)自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，提取方法參照文獻(xiàn)[4]并有所改進(jìn)。取藥材50 g，加入8倍量水，加熱回流提取2次(回流1.5 h/次),將所得藥液紗布過(guò)濾，離心后濃縮至100 mL,得 500 g/L的水提液，再次紗布過(guò)濾，灌裝密封，高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?T3-L1前脂肪細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，高糖DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清(美國(guó)Gibco公司)，胰蛋白酶、MTT(北京Solarbio公司)，pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)，Lipofectamine2000試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)，Caspase-3、Bax一抗(Abcam公司)，二抗(Santa Cruz公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，CK40倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，高速低溫離心機(jī)(德國(guó)heraus公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)。

1.2FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞在含有100 IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合后傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105mL-1的密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基。細(xì)胞分為正常組及不同劑量FSAE組。正常組加入普通培養(yǎng)基，F(xiàn)SAE低、中、高劑量組分別加入0.01、0.10和1.00 g/L的FSAE，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。均繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。之后更換無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄MTT，加入DMSO溶解沉淀，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度值(A)。

1.3FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞儀按照BD公司的細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，分組同1.2。繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液洗2次，取懸液100 μL，分別添加異硫氰酸熒光素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白和碘化丙啶各5 μL，室溫避光20 min，再添加400 μL 1×緩沖液，室溫避光染色30 min后上機(jī)檢測(cè)。1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)正常、凋亡和壞死的細(xì)胞，由FLOJO軟件分析凋亡率。每組6個(gè)復(fù)孔。

1.4促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達(dá)的Westernblot檢測(cè)將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以2×105mL-1的密度接種于6孔板，每孔1 000 μL，細(xì)胞分組同1.2。繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min 提取蛋白。100 g/L SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加Caspase-3和Bax單克隆抗體4 ℃過(guò)夜，TBST洗脫。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗脫。ECL發(fā)光試劑顯影，暗室曝光。以GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照，采用Image ProPlus圖像分析軟件分析各蛋白條帶的積分光密度值，以目的條帶與GAPDH條帶積分光密度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量

1.5FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素啟動(dòng)子熒光素酶活性的影響將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以1×105mL-1密度接種于24孔板中，每孔500 μL。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到融合后更換Opti-MEM培養(yǎng)基，正常對(duì)照組只加pGL3-Basic空白質(zhì)粒；低、中、高劑量FSAE組先加入0.01、0.10、1.00 g/L FSAE培養(yǎng)24 h，然后加入重組質(zhì)粒pGL3-Basic-ADI1100[5-9]。培養(yǎng)2 h更換普通培養(yǎng)基培養(yǎng)液，收集處理48 h后的樣品進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.6FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以2×105mL-1的密度接種于6孔板，每孔1 000 μL，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到融合后分為正常組及低、中、高劑量FSAE組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞懸液，置于滅活RNA酶的EP管內(nèi)，Trizol試劑提取RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以ACTIN為內(nèi)部對(duì)照，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算脂聯(lián)素mRNA的相對(duì)表達(dá)量。ACTIN上游引物序列：5’-CACACCCGCCACCAGTTCGC-3’，下游引物序列：5’-TTGCACATGCCGGAGCCGTT-3’；脂聯(lián)素上游引物序列：5’-GGGTCTGCCTGTCCCCATGAGT-3’，下游基因引物序列：5’-CCTGAGCCCTTTTGGT GTCGTC-3’。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較不同劑量FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、凋亡、Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)及脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞增殖、凋亡的影響見(jiàn)圖1、表1。如圖1所示，正常組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，伸展性良好。FSAE低、中、高劑量組刺激24 h后出現(xiàn)間隙變寬和形變，呈較為明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。FSAE中、高劑量組A值低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FSAE低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率較正常組上升(P<0.05)。

A：正常組，B～D:低、中、高劑量FSAE組。圖1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化

2.2FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)和脂聯(lián)素啟動(dòng)子活性及mRNA表達(dá)的影響見(jiàn)圖2、表2。

表1 FSAE對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖、凋亡的影響(n=6)

*：與正常組相比，P<0.05；#：與低、高劑量組相比，P<0.05。

1：正常組；2:FSAE低劑量組；3:FSAE中劑量組；4:FSAE高劑量組。圖2 各組細(xì)胞中Caspase-3和Bax 蛋白的表達(dá)

組別Caspase?3蛋白Bax蛋白脂聯(lián)素啟動(dòng)子活性比值脂聯(lián)素mRNA相對(duì)表達(dá)量正常組0．853±0．0260．680±0．0070．781±0．0051．000±0．067FSAE組低劑量組1．282±0．0591．076±0．0420．842±0．010?1．620±0．019?FSAE組中劑量組1．536±0．035?#1．456±0．425?#0．731±0．009?#2．422±0．013?#FSAE組高劑量組1．903±0．014?1．747±0．037?0．620±0．018?1．718±0．066?F417．259517．316525．686549．497P<0．001<0．001<0．001<0．001

*：與正常組相比，P<0.05；#：與低、高劑量組相比，P<0.05。

3 討論

脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的增大是肥胖的兩大表現(xiàn)。凋亡在病理及生理過(guò)程中都發(fā)揮重要的作用[10-12]。研究[13-15]表明，脂肪細(xì)胞數(shù)量受細(xì)胞增殖與凋亡雙重調(diào)控。許多天然的植物能抑制小鼠前脂肪細(xì)胞增殖活性并誘導(dǎo)其啟動(dòng)凋亡途徑，因此具有降低體重的潛力。脂肪細(xì)胞不僅是能量?jī)?chǔ)存器官，還是一種內(nèi)分泌組織，可分泌多種細(xì)胞因子和炎性蛋白；脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在肥胖時(shí)水平降低[16-17]。 本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)顯示，正常3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛，伸展性良好，呈鋪路石樣生長(zhǎng)。不同劑量FSAE作用24 h 后，3T3-L1前脂肪細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞間隙變寬，脫落細(xì)胞增多，呈較為明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)SAE作用3T3-L1前脂肪細(xì)胞24 h，能夠抑制細(xì)胞的增殖、增加細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，不同劑量FSAE作用于細(xì)胞24 h,能夠增加脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證番瀉葉分子生物學(xué)作用是否通過(guò)干預(yù)脂肪細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)將脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子片斷的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察番瀉葉處理對(duì)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的影響。通過(guò)啟動(dòng)子活性分析，發(fā)現(xiàn)與啟動(dòng)子區(qū)相應(yīng)DNA片段作用后，啟動(dòng)子活性受到顯著抑制，提示脂聯(lián)素啟動(dòng)子活性升高可能是番瀉葉誘發(fā)的脂聯(lián)素表達(dá)增高的原因之一。

總之，番瀉葉對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖具有抑制作用；提高細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)，提高脂聯(lián)素mRNA表達(dá)；番瀉葉還可能通過(guò)提高脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子活性而促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)，這些都為從分子生物學(xué)方面闡述番瀉葉可能具有的降脂作用提供了理論依據(jù)。

[1] 崔琳,李強(qiáng),路玲玲,等.脂聯(lián)素調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因熒光素酶活性的分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(6):211

[2] 魏賢坤.番瀉葉的臨床應(yīng)用與不良反應(yīng)[J].臨床合理用藥雜志,2011,4(8):88

[3] 陳思偉,唐哲,劉莉,等.小兒腹瀉外敷散對(duì)腹瀉大鼠小腸Cajal細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及血管活性腸肽受體1表達(dá)的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2015,40(1):22

[4] 崔蓉,孟憲麗,王平,等.黃芩水提取物對(duì)急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其與膽堿能抗炎通路的相關(guān)性研究[J].中草藥,2012,43(2):321

[5] 路玲玲,宰軍華,崔琳,等.人脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建[J].世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2013,15(1):55

[6] 劉小麗,薛曉鷗,唐炳華,等.金雀黃素對(duì)HEC-1B細(xì)胞增殖及熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)影響的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(4):236

[7] 李雄,羅成群,周建大,等.雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞熱休克轉(zhuǎn)錄因子1調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子kappa B活性的研究[J].激光生物學(xué)報(bào),2010,19(2):143

[8] 羅天霞,樊紅琨,芮丹丹,等.SK2和JPH2雙基因重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及再HEK293細(xì)胞中的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,51(5):580

[9] 陳競(jìng)紅,常志偉,賈永旭,等.AZIN1慢病毒的制備及EC109穩(wěn)定感染細(xì)胞株的建立[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,51(5):561

[10]王佳，張炯，蛇床子素通過(guò)抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)途徑減輕腦缺血再灌注損傷[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,38(1):131

[11]夏艷秋,王娜,闕菡雅,等.NOX1 siRNA對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,51(5):591

[12]張晨,呂雷鋒,李苗,藏紅花通過(guò)抗凋亡、抗炎和抗水腫機(jī)制發(fā)揮對(duì)大鼠脊髓損傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,38(2):280

[13]陳思凡,肖新才,孫延雙，等.白藜蘆醇對(duì)小鼠 3T3-L1 細(xì)胞增殖與分化的影響及其機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26(1):108

[14]張翔,黎文明,鐘賢武.白藜蘆醇通過(guò)降低LYRM1 mRNA表達(dá)抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖[J],食品科學(xué),2014,35(13):250

[15]王添,都鎮(zhèn)先,張海燕.白藜蘆醇增加脂肪細(xì)胞3T3-L1中脂聯(lián)素表達(dá)的作用機(jī)制探討[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,42(1):56

[16]孫陽(yáng),陳樹春.內(nèi)皮祖細(xì)胞與脂肪因子[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2012,32(6):1312

[17]楊再剛,陳玉娟,趙倩,等.不同胰島素水平和脂類飲食對(duì)小鼠肥胖和脂肪細(xì)胞的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,51(5):627

(2017-01-18收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Effect ofFoliumSennaeaqueous extracts on 3T3-L1 cell apoptosis and expression of adipokines

LIUWeihong1),CUILin1),LULingling2),LIQiang3)

1)CentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospital，HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000 2)PuyangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Puyang,Henan457001 3)HenanKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineControlforViralDiseases,Zhengzhou450000

FoliumSennaeaqueous extract;3T3-L1 cell;luciferase activity

Aim: To determine the effect ofFoliumSennaeaqueous extract(FSAE) on 3T3-L1 cell proliferation and apoptosis, and further study its effect on 3T3-L1 adiponectin mRNA and adiponectin promoter luciferase activity.Methods3T3-L1 cells were incubated with different concentrations of FSAE for 24 h, and cell proliferation was determined by MTT method;AnnexinV-FITC/PI double staining was used to detect cells apoptosis;Western blot was used to detect the expressions of Caspase-3 and Bax protein;Fluorescence quantitative PCR was used to detect adiponectin mRNA expression; double fluorescein enzyme report gene method was used to detect the influence of adiponectin gene promoter activity.ResultsDifferent concentration FSAE inhibited 3T3-L1 proliferation,promoted cell apoptosis, improved the expressions of apoptosis related protein Caspase-3 and Bax;At the same time, FSAE improved adiponectin mRNA expression, and enhanced its adiponectin promoter activity.ConclusionThis may provide a molecular basis for FASE inhibiting obesity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.021

*河南省教育廳自然科學(xué)研究資助計(jì)劃項(xiàng)目 2010B360009；鄭州市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 0910SGYS33391-1

1)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450000 2)濮陽(yáng)市中醫(yī)院康復(fù)科 河南濮陽(yáng) 457001 3)河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450000

△女，1970年10月生，碩士，副主任藥師，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail:lwh_c@163.com

R285.5