左心室肥厚兔緩慢型延遲整流鉀電流通道KCNQ1和KCNE1 mRNA表達的變化*

閆書妹，常 超，衡紫微，王彥茲，劉桂芝

左心室肥厚兔緩慢型延遲整流鉀電流通道KCNQ1和KCNE1mRNA表達的變化*

閆書妹，常 超，衡紫微，王彥茲，劉桂芝#

壓力超負荷；心肌肥厚；緩慢型延遲整流鉀電流；兔

目的：觀察左心室肥厚兔左心室內(nèi)外膜心肌細胞中緩慢型延遲整流鉀電流(IKs)通道KCNQ1和KCNE1 mRNA表達水平的差異，探討IKs通道在兔肥厚心肌復(fù)極離散度增大中的作用。方法55只雄性日本大耳白兔隨機分為實驗組30只和對照組25只。實驗組行腎上腹主動脈次全結(jié)扎，使腹主動脈縮窄50%～60%；對照組除不做絲線結(jié)扎外，其余處理同實驗組。術(shù)后8周處死動物，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測IKs通道KCNQ1和KCNE1 mRNA的表達。結(jié)果對照組左心室內(nèi)膜IKs通道m(xù)RNA表達水平低于心外膜(P<0.001)；實驗組左心室內(nèi)外膜IKs通道m(xù)RNA表達水平均低于對照組(P<0.001)。結(jié)論IKs通道減少使復(fù)極時限延長，其不均一性減小可能是肥厚心肌復(fù)極離散度增大的原因。

心肌肥厚是正常心肌細胞對負荷增加的一種適應(yīng)性反應(yīng)[1]，也是心血管事件的獨立危險因素[2-3]，對其心電生理機制的研究將為心肌肥厚性心律失常發(fā)生機制的研究提供理論依據(jù)。有文獻[4]報道，緩慢型延遲整流鉀電流(slowly activating delayed rectifier potassium，IKs)為復(fù)極期外向電流，其密度的減小意味著復(fù)極期外向電流減少，導(dǎo)致復(fù)極時間延長。雖然已有一些學(xué)者對IKs通道在肥厚心肌中的表達變化進行了研究，但結(jié)果迄今為止仍存在爭議。本實驗擬建立兔壓力超負荷左心室肥厚模型，觀察IKs通道KCNQ1和KCNE1 mRNA在左心室內(nèi)外層心肌細胞區(qū)域表達的差異，探討IKs通道在兔肥厚心肌復(fù)極離散度增大中的作用。

1 材料與方法

1.1動物來源及模型制備12周齡雄性日本大耳白兔[SYXK(豫)2011-0001]55只，體重2.0 ～ 3.0 kg，采用隨機數(shù)字表法分為實驗組30只和對照組25只，由河南省實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。實驗組采用側(cè)腹部入路腎上腹主動脈次全結(jié)扎法制作左心室高后負荷致左心室肥厚模型。動物術(shù)前禁食12 h，不禁水。200 g/L烏拉坦10 mL/kg腹腔注射麻醉，于左側(cè)腹部縱向切開，在腹膜外沿腎臟暴露腎動脈，于左腎動脈上5～10 mm鈍性分離腹主動脈。將20 mL注射器針頭與腹主動脈平行放置，將動脈與注射器針頭同時絲線結(jié)扎，撤出注射器針頭后腹主動脈縮窄50%～60%。術(shù)后依次縫合腹壁肌肉及皮膚，肌內(nèi)注射青霉素80萬U/d，共3 d。對照組除不行腹主動脈縮窄外，其余處理同實驗組。

1.2心電圖檢查實驗組和對照組兔分別于術(shù)前和術(shù)后8周行心電圖檢查。兔麻醉后仰臥位固定于兔臺上，針狀電極刺于皮下，電極位置與人描計心電圖位置大體相同，并用記號筆標(biāo)記，保證每次心電圖描記部位固定。調(diào)節(jié)走紙速度為50 mm/s，定標(biāo)電壓20 mm/mV，待心電圖基線穩(wěn)定以及無干擾偽差時描記12導(dǎo)聯(lián)心電圖，測量QTc。

1.3左心室質(zhì)量指數(shù)的計算術(shù)后8周用空氣栓塞法處死動物后稱重，開胸取出心臟，去除左右心房和右心室游離壁后稱重左心室，計算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)，LVMI(g/kg)=左心室質(zhì)量/體重。

1.4組織標(biāo)本的采集開胸取出心臟后迅速剪取左心室心內(nèi)膜(endocardium，Endo)和心外膜(epicardium，Epi)心肌組織，置凍存管中保存于-80 ℃冰箱中，供做熒光定量PCR用。取部分左心室心肌置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，做HE染色用。

1.5心肌組織中KCNQ1和KCNE1mRNA表達的檢測應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測。提取組織總RNA，參照TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄和擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)溶解曲線先排除非特異性擴增及引物二聚體現(xiàn)象，然后將由擴增曲線所得的Ct值轉(zhuǎn)換為2-ΔΔCt(以β-actin作為內(nèi)參)，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。KCNQ1上游引物：5’-CCTCCTGCTTCTCCGTCTTCG-3’，下游引物：5’-CCTCTGCTTCTGCTGGACCTTG-3’。KCNE1上游引物：5’-TTTCTCCAGTATCCGTCCCTTCCT-3’，下游引物：5’-GGCATCGCCTTCATCACTTCTAC-3’。β-actin上游引物：5’-CATCCTGACGCAAGTACCCGA-3’，下游引物：5’-CCACGCGAAGCTCGTTGTAGAA-3’。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行分析，應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較2組動物各觀察指標(biāo)術(shù)前術(shù)后差值的變化，應(yīng)用配對t檢驗比較2組動物左心室內(nèi)外膜KCNQ1和KCNE1 mRNA表達水平的差異，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1實驗動物基本情況實驗過程中共有5只動物死亡。對照組死亡2只，分別死于切口感染和麻醉過深；實驗組死亡3只，分別死于術(shù)中大血管破裂、心功能衰竭和足癬。實驗組兔于術(shù)后第3周開始，普遍出現(xiàn)活動減少、食量減少、精神狀態(tài)差及體重稍下降；對照組兔于術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)過程中無明顯異常表現(xiàn)。

2.2 2組兔心電圖檢查結(jié)果比較見表1～3和圖1。術(shù)后8周，與術(shù)前及對照組比較，實驗組兔QTC延長下壁及胸前各導(dǎo)聯(lián)QRS波振幅增高(P<0.001)。

表1 2組兔QTc的比較 ms

*：t=35.748,P<0.001。

表2 2組兔肢體導(dǎo)聯(lián)QRS波振幅變化 mV

表3 2組兔胸前導(dǎo)聯(lián)QRS波振幅變化 mV

A：實驗組；B：對照組；1：手術(shù)前；2：手術(shù)后。圖1 2組兔手術(shù)前后心電圖檢查結(jié)果

2.3 2組兔心肌組織LVMI及病理觀察比較實驗組LVMI[(1.687±0.120) g/kg]高于對照組[(1.098±0.045) g/kg]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.255，P<0.001)。病理結(jié)果顯示(圖2)，對照組兔心肌纖維排列整齊，大小正常，細胞外間質(zhì)無明顯增生；實驗組兔心肌細胞增生肥大，肌纖維排列紊亂，肌細胞間隙變寬，出現(xiàn)部分肌細胞的溶解和斷裂，可見空泡、脂肪變性及細胞外間質(zhì)的明顯增生。

2.4 2組兔左心室內(nèi)外膜KCNQ1和KCNE1mRNA表達水平的比較見表4。對照組IKs通道KCNQ1基因表達量左心室心外膜(left epicardium，L-Epi)為左心室心內(nèi)膜(left endocardium，L-Endo)的2.12倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。對照組IKs通道KCNE1基因表達量L-Epi為L-Endo的1.83倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比，實驗組KCNQ1基因在L-Epi的表達減

少37.57%，在L-Endo的表達減少28.29%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比，實驗組KCNE1基因在L-Epi的表達減少47.66%，在L-Endo的表達減少35.56%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖2 術(shù)后8周實驗組(左)和對照組(右)兔心肌組織病理觀察結(jié)果(HE，×200)

組別nKCNQ1mRNAL?EndoL?Epit(P)KCNE1mRNAL?EndoL?Epit(P)對照組230．126±0．0170．266±0．01766．796(<0．001)0．070±0．0040．128±0．01452．682(<0．001)實驗組270．090±0．0140．166±0．01744．078(<0．001)0．045±0．0040．067±0．00418．010(<0．001)t(P)20．181(<0．001)47．998(<0．001)22．216(<0．001)51．278(<0．001)

3 討論

心肌肥厚是正常心肌細胞對負荷增加的一種適應(yīng)性反應(yīng)[1]，是瓣膜病、缺血性心肌病、高血壓病等多種心血管疾病的共同的病理過程[5]；可引起心肌的電學(xué)重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，是引起室性心律失常的病理基礎(chǔ)。因此，對肥厚心肌心電生理機制的研究，揭示心律失常的發(fā)生機制，對臨床具有重要的指導(dǎo)意義。

本實驗采用王彥珍等[6-7]改良的側(cè)腹部入路腎上腹主動脈次全結(jié)扎法制作兔壓力超負荷左心室肥厚模型。該方法摒棄了傳統(tǒng)的腹正中切口開腹，可有效避免進入腹腔，避免損傷腸管，減少腸梗阻發(fā)生的可能，同時減少潛在感染風(fēng)險，且操作簡單。心電圖結(jié)果顯示，術(shù)后8周，與術(shù)前及對照組比較，實驗組兔下壁及胸前各導(dǎo)聯(lián)QRS波振幅增高，提示左心室肥厚模型制備成功。研究中LVMI及心臟病理結(jié)果均亦證實左心室肥厚模型制備成功。

目前研究[8]證明，心室三層心肌細胞存在電生理異質(zhì)性，造成復(fù)極電活動的不均一性，使其存在一定的室間及跨室壁復(fù)極離散度。左心室內(nèi)中外三層心肌細胞的心電生理異質(zhì)性與心律失常密切相關(guān)，心外膜下心肌細胞的動作電位時程(action potential duration，APD)最短，終止于體表心電圖T波的頂點，其次是心內(nèi)膜下心肌細胞，而中層M細胞APD最長，終止于T波的終點。本實驗數(shù)據(jù)顯示，對照組L-Epi IKs通道KCNQ1和KCNE1 mRNA的表達水平均高于L-Endo，因此推測IKs通道的區(qū)域異質(zhì)性可能是內(nèi)膜心肌細胞APD長于外膜心肌細胞的離子基礎(chǔ)。

當(dāng)心肌肥厚時，IKs通道的表達發(fā)生變化，目前已有學(xué)者對其進行研究，但仍存在爭議。在快速心室起搏致大鼠左心室肥厚模型中[9]，發(fā)現(xiàn)KCNQ1基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但調(diào)節(jié)KCNQ1蛋白的KCNE1基因在mRNA水平的表達卻升高。Akar等[10]利用犬制作心肌肥厚模型，顯示KCNQ1基因和KCNE1基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在Xu等[11]的實驗中亦發(fā)現(xiàn)左心室肥厚兔的心肌細胞與對照組相比，KCNQ1基因在mRNA和蛋白水平的表達均無顯著變化。本實驗發(fā)現(xiàn)：實驗組兔QTc顯著延長，并且實驗組兔KCNQ1和KCNE1 mRNA在左心室內(nèi)外膜心肌細胞中的表達水平均降低，使動作電位時程延長，同蔣詩琴等[12]的結(jié)論相同，并且與本研究肥厚模型中細胞電生理學(xué)的表現(xiàn)相一致。

研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚等病理情況可引起心室壁離子通道的重構(gòu)，使室壁三層心肌細胞APD不均一性延長。在本實驗中，與對照組相比，實驗組左心室內(nèi)外膜心肌細胞中IKs通道m(xù)RNA的表達存在不均一性下降，這種內(nèi)外膜不均一性下降可能會引起復(fù)極離散度的增大，是容易發(fā)生惡性心律失常的主要原因。Xu等[11]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，選擇性激活I(lǐng)Ks通道，增加IKs通道密度可以縮短APD和抑制早期后除極，并改善肥厚心肌的異常復(fù)極，有效減少心律失常和心力衰竭的發(fā)生率和死亡率。本研究實驗結(jié)果亦顯示，肥厚左心室外膜心肌細胞IKs通道m(xù)RNA表達降低更顯著，從而使外膜心肌細胞APD延長更加顯著，由此推測肥厚心肌復(fù)極離散度不一定增大。研究[15]發(fā)現(xiàn)，肥厚心肌復(fù)極離散度的增大可能與晚鈉電流(Late sodium current，INa-L)有關(guān)。INa-L在心室不同區(qū)域的心肌細胞分布不均一，且INa-L密度與心肌細胞APD的頻率依賴性呈正比，故推測其在跨壁復(fù)極離散中起主要作用。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，肥厚左心室肌通過增加心內(nèi)膜心肌細胞INa-L密度來增大跨室壁復(fù)極離散度，并通過動物實驗證實，當(dāng)兔左心室肥厚時，心肌細胞INa-L密度增加，其中內(nèi)膜心肌細胞INa-L增加的幅度遠大于心外膜，致使頻率依賴性跨壁復(fù)極離散度(transmural dispersion of repolarization，TDR)增大，是心室肥厚容易發(fā)生惡性心律失常的主要原因。

綜上所述，IKs通道減少可使復(fù)極時限延長，其不均一性減小可能是肥厚心肌復(fù)極離散度增大的原因。

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(2017-05-23收稿 責(zé)任編輯趙秋民)

Slowly activating delayed rectifier potassium expression at the mRNA level in hypertrophied left ventricular epicardium and endocardium of rabbits

YANShumei，CHANGChao，HENGZiwei，WANGYanzi，LIUGuizhi

PhysicsDiagnosticDivision,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

pressure overload; myocardial hypertrophy; slowly activating delayed rectifier potassium;rabbit

Aim: To reveal the regional heterogeneity of KCNQ1 and KCNE1 expression at the mRNA level in left ventricular epicardium and endocardium, and explore the effect of slowly activating delayed rectifier potassium(IKs) on the amplified transmural dispersion of repolarization in hypertrophied left ventricular epicardium and endocardium of rabbits.MethodsA total of 55 male Japanese rabbits were included and randomly assigned to experimental group(n=30) and control group(n=25). In the experimental group, abdominal artery of rabbits was subjected to 50%-60% reduction by partial ligation for 8 weeks to produce left ventricular hypertrophy(LVH).Real-time quantitative reverse transcription PCR was performed to detect levels of expression of KCNQ1 and KCNE1 mRNA.ResultsIn the control group, left epicardium(L-Epi) had higher expression levels of IKs than left endocardium (L-Endo)(P<0.001).Compared with control group, the expression of IKs in the expreimental group was significantly decreased in L-Endo and L-Epi(P<0.001).ConclusionThe decrease of IKs could prolong ventricular repolarization duration, the decreased heterogeneity of IKs may be the reason of amplified transmural dispersion of repolarization in hypertrophied myocardium.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.017

*河南省教育廳科技攻關(guān)項目 12A320034

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院物理診斷科 鄭州 450052

#通信作者，女，1962年12月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：心肌電生理，E-mail：15838023091@163.com

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