20(S)-原人參二醇通過調(diào)控miRNA-19b誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的觀察*

楊曉艷，覃熙媛，李 楠， 羅志勇，楊 芳#

20(S)-原人參二醇通過調(diào)控miRNA-19b誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的觀察*

楊曉艷1,2)，覃熙媛3)，李 楠1)， 羅志勇3)，楊 芳1)#

MCF-7細(xì)胞；20(S)-原人參二醇；miRNA-19b；TNFα；凋亡

目的：研究20(S)-原人參二醇[20(S)-PPD]通過調(diào)控miRNA-19b的表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡以及相關(guān)作用的機制。方法采用MTT比色法檢測30、40、50、60、70、80 μmol/L 20(S)-PPD處理48 h對MCF-7細(xì)胞存活率的影響;real-time PCR檢測30、50、80 μmol/L 20(S)-PPD處理MCF-7細(xì)胞48 h后miRNA-19b相對表達(dá)量的變化；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)活性檢測試劑盒檢測30、50、80 μmol/L 20(S)-PPD處理MCF-7細(xì)胞48 h對DNMT活性的影響。將MCF-7細(xì)胞分成瞬時轉(zhuǎn)染miRNA陰性對照模擬物+空白培養(yǎng)液組、瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-19b模擬物+20(S)-PPD組、瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-19b模擬物+空白培養(yǎng)液組、瞬時轉(zhuǎn)染miRNA陰性對照模擬物+20(S)-PPD組，real-time PCR檢測4組細(xì)胞miRNA-19b表達(dá)量的變化，Western blot檢測4組細(xì)胞中TNFα蛋白表達(dá)量的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測4組細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果20(S)-PPD可劑量依賴性地降低MCF-7細(xì)胞的存活率。隨著20(S)-PPD劑量的升高，miRNA-19b的表達(dá)量降低(P<0.05)。80 μmol/L的20(S)-PPD可增強DNMT活性(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miRNA-19b模擬物后，miRNA-19b的表達(dá)量上升，TNFα蛋白的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞凋亡率降低； 而加入65 μmol/L 20(S)-PPD后，miRNA-19b的表達(dá)下調(diào)，TNFα蛋白的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)論20(S)-PPD可能通過甲基化作用抑制miRNA-19b的表達(dá)，進而促進TNFα的表達(dá)，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤[1]，惡性程度不一，嚴(yán)重危害婦女身心健康。隨著乳腺癌綜合治療的開展，乳腺癌病死率呈下降趨勢。20(S)-原人參二醇[20(S)-protopanaxadiol, 20(S)-PPD]屬于異戊二烯單元三帖醇皂苷類中的二醇型皂元，是二醇型皂苷經(jīng)微生物降解后的終產(chǎn)物[2-3]，對人類乳腺癌[4-5]、卵巢癌[6]、前列腺癌[7]等多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用?，F(xiàn)在，DNA啟動子異常甲基化是哺乳動物基因組改變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的最常見的一種表觀遺傳學(xué)事件[8]。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸的胞嘧啶在5’碳原子位置上被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。DNA異常甲基化可直接引起抑癌基因失活、癌基因激活，也可導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定并間接誘導(dǎo)基因突變[9]。miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，10～25個核苷酸，主要通過與靶標(biāo)mRNA中的堿基互補配對，抑制或降解mRNA的翻譯，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)[10]。Iorio等[11]認(rèn)為miRNA表達(dá)失誤可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。miRNA-17-92在惡性腫瘤的調(diào)控過程中發(fā)揮了重要的作用，而miRNA-19b可能是miRNA-17-92中的關(guān)鍵致癌因子[12]。為此，該研究探討了20(S)-PPD通過調(diào)控miRNA-19b這一中間信號通路對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，為20(S)-PPD廣泛應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑乳腺癌MCF-7細(xì)胞系(中南大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室保存)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；20(S)-PPD購自吉林大學(xué)化學(xué)系；MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自美國BD公司；TNFα兔抗人多抗購自美國Bioworld公司；山羊抗兔IgG(二抗)購自北京鼎國公司；riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑、miRNA-19b 模擬物以及陰性對照購自廣州銳博公司；Trizol試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞在含有青、鏈霉素各100 U/mL以及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次，取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.3MTT法檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，每孔1 000個接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，分別用30、40、50、60、70、80 μmol/L的20(S)-PPD 培養(yǎng)液100 μL培養(yǎng)細(xì)胞48 h，每組設(shè)5個復(fù)孔，陰性對照組加入等體積的DMSO培養(yǎng)液，并設(shè)立調(diào)零孔。實驗終止前4 h每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，隨后小心棄掉上清液，每孔加100 μL DMSO，在低速振蕩器上振蕩10 min，最后用酶標(biāo)儀測定MCF-7細(xì)胞在490 nm處的吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.4real-timePCR法檢測miRNA-19b的表達(dá)分別取miRNA-RT 引物和 U6 RT 引物各1 μL和0、30、50、80 μmol/L 20(S)-PPD處理48 h后提取的總RNA 1 μg，加DEPC水至12 μL，混勻，65 ℃反應(yīng)5 min后迅速置于冰上。向反應(yīng)液中加入4 μL 5×反應(yīng)緩沖液、2 μL 10×脫氧核苷酸堿基、1 μL RNA酶抑制劑、1 μL RT酶。反應(yīng)條件: 42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，-20 ℃保存。以cDNA為模板進行PCR擴增。 PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。miRNA-19b的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。實驗重復(fù)3次。

1.5DNMT活性檢測0、30、50、80 μmol/L 20(S)-PPD處理MCF-7細(xì)胞48 h后提取核蛋白，將核蛋白中的DNMT結(jié)合到基質(zhì)膜上，與特異性的DNMT抗體結(jié)合，通過類酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)后測定450 nm處的OD值。 實驗重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染依據(jù)riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑說明書，取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞以 105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)30%～50%融合時進行處理。采用析因設(shè)計方法，將MCF-7細(xì)胞分4組：A組(瞬時轉(zhuǎn)染miRNA陰性對照模擬物+空白培養(yǎng)液)、B組[瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-19b 模擬物+20(S)-PPD 65 μmol/L]、C組(瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-19b模擬物+空白培養(yǎng)液)、D組[瞬時轉(zhuǎn)染miRNA陰性對照模擬物+20(S)-PPD 65 μmol/L]。4組細(xì)胞均培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實驗。

1.7miRNA-19b模擬物轉(zhuǎn)染效率檢測Cy3標(biāo)記的miRNA陰性對照模擬物轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率。瞬時轉(zhuǎn)染處理的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別收集細(xì)胞，Trizol提取總RNA，real-time PCR定量檢測轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞中miRNA-19b的表達(dá)水平，結(jié)果計算采用2-ΔΔCt法。實驗重復(fù)3次。

1.8TNFα蛋白印跡分析從A、B、C、D 4組經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的MCF-7細(xì)胞中提取總蛋白。取30 μg蛋白溶液與2×蛋白上樣緩沖液等體積混合，沸水加熱10 min后上樣進行電泳；電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后放入封閉液中，置于搖床室溫緩速振蕩1 h后，以TNFα兔抗人多抗作為一抗，4 ℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液洗滌PVDF膜后加入二抗；應(yīng)用化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)1 min，采用Image-Pro Plus 5.1軟件進行凝膠圖像分析。實驗重復(fù)3次。

1.9流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，以105個/孔接種于6 孔板內(nèi)，按照1.6實驗分組處理48 h后，胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，離心后棄掉上層液體，加入Binding Buffer重懸細(xì)胞。取100 μL懸浮液，分別加入5 μL的AnnexinV-APC和10 μL的PI，常溫下避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。各組細(xì)胞miRNA-19b相對表達(dá)量、DNMT活性的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-19b、TNFα蛋白相對表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率的比較采用2×2析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組MCF-7細(xì)胞存活率結(jié)果見圖1。20(S)-PPD的IC50為65 μmol/L。因此選用了低、中、高(30、50、80 μmol/L)3個濃度以及IC5065 μmol/L進行實驗。

圖1 MCF-7細(xì)胞存活率

2.2各組細(xì)胞miRNA-19b的表達(dá)情況結(jié)果見表1。20(S)-PPD作用后MCF-7細(xì)胞miRNA-19b表達(dá)水平降低。

表1 各組細(xì)胞miRNA-19b相對表達(dá)量的比較(n=3)

F=12.062,P=0.002;*:與陰性對照組比較，P<0.05。

2.3各組細(xì)胞DNMT活性檢測結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞DNMT活性比較(n=3)

F=12.333,P=0.017;*:與陰性對照組比較，P<0.05。

2.4miRNA-19模擬物轉(zhuǎn)染效率結(jié)果見圖2。Cy3標(biāo)記的miRNA-19b模擬物成功轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率>90%。

A：普通光源；B：熒光光源。圖2 Cy3標(biāo)記的轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞(×200)

2.5轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-19b的表達(dá)情況結(jié)果見表3。

表3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-19b的表達(dá)(n=3)

F藥物組間=48.465，F(xiàn)轉(zhuǎn)染組間=103.198，F(xiàn)交互=47.437，P均<0.001。

2.6轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞TNFα蛋白的表達(dá)情況結(jié)果見圖3和表4。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞TNFα蛋白的表達(dá)

藥物轉(zhuǎn)染miRNA陰性對照模擬物轉(zhuǎn)染miRNA?19b模擬物空白培養(yǎng)液0．236±0．0210．109±0．00665μmol/L20(S)?PPD0．786±0．0700．437±0．013

F藥物組間=276.956，F(xiàn)轉(zhuǎn)染組間=79.711，F(xiàn)交互=11.545，P均<0.05。

2.7轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率的比較結(jié)果見表5。

表5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率的比較(n=3)

F藥物組間=232.625，F(xiàn)轉(zhuǎn)染組間=68.432，F(xiàn)交互=66.269，P均<0.001。

3 討論

20(S)-PPD在二醇組人參皂苷中藥理活性最強[13]，研究[14]表明20(S)-PPD可調(diào)控miRNA而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和生物學(xué)特性。miRNA表達(dá)異常會誘發(fā)惡性腫瘤的發(fā)生[15]。該研究發(fā)現(xiàn)miRNA-19b在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮了原癌基因的作用，20(S)-PPD可下調(diào)miRNA-19b的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。因此miRNA-19b有望成為原癌基因的分子調(diào)控點。

通過生物信息學(xué)分析查詢靶基因預(yù)測軟件，miRNA-19b預(yù)測的靶基因之一為TNFα。TNFα是一種細(xì)胞因子，可以與Fas跨膜蛋白等結(jié)合，激活外源性凋亡通路，進而引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。該研究從蛋白質(zhì)水平驗證了miRNA-19b的過表達(dá)可以負(fù)向調(diào)控TNFα的表達(dá)，加入20(S)-PPD后，TNFα表達(dá)明顯回升，因而證實TNFα是miRNA-19b新的靶標(biāo)。但是20(S)-PPD下調(diào)miRNA-19b的作用是如何實現(xiàn)的？該研究發(fā)現(xiàn)20(S)-PPD可能通過增強miRNA-19b啟動子區(qū)域DNMT的活性，引起上游miRNA-19b啟動子區(qū)CpG島過度甲基化，從而導(dǎo)致miRNA-19b表達(dá)沉默。有研究[17]也發(fā)現(xiàn)，由于DNA 去甲基化導(dǎo)致miRNA-375過表達(dá)，從而使MCF-7細(xì)胞異常增殖。

綜上所述，20(S)-PPD對MCF-7細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，20(S)-PPD通過增強DNMT的活性下調(diào)miRNA-19b的表達(dá)，進而誘導(dǎo)TNFα的表達(dá)和細(xì)胞凋亡。miRNA-19b有望成為20(S)-PPD治療乳腺癌的靶點，為20(S)-PPD廣泛應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。

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(2016-12-28收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Observation of 20(S)-protopanaxadiol-induced apoptosis of breast cancer MCF-7 cellsviaregulating miRNA-19b

YANGXiaoyan1,2),QINXiyuan3),LINan1),LUOZhiyong3),YANGFang1)

1)DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,CollegeofXiangyaPublicHealth,CentralSouthUniversity,Changsha410078 2)DepartmentofPhysicalExaminationCenter，NorthDistrictofSuzhouMunicipalHospital,Suzhou,Jiangsu215008 3)DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,CollegeofLifeSciences,CentralSouthUniversity,Changsha410004

MCF-7 cell；20(S)-protopanaxadiol；miRNA-19b；TNFα；apoptosis

Aim: To investigate the possible mechanism of 20(S)-protopanaxadiol[20(S)-PPD] which could induce apoptosis of breast cancer MCF-7 cellsviaregulating miRNA-19b.MethodsMCF-7 cells were treated with 30,40,50,60,70,80 μmol/L 20(S)-PPD for 48 h and the cell viability was detected by MTT method.MCF-7 cells were treated with 30,50,80 μmol/L 20(S)-PPD for 48 h, the expression level of miRNA-19b was detected by real-time PCR, and DNMT activity assay kit was used to detect the DNMT activity. MCF-7 cells were divided into four groups: miRNA mimics plus blank medium group， miRNA-19b mimics plus 20(S)-PPD group, miRNA-19b mimics plus blank medium group, and miRNA mimics plus 20(S)-PPD group.The expression of miRNA-19b in the four groups was detected by real-time PCR. The protein expression level of TNFα in the four groups was detected by Western blot. The cell apoptosis in the four groups was tested by flow cytometry.Results20(S)-PPD could suppress the viability of MCF-7 cells concentration-dependently. 20(S)-PPD could significantly decrease the expression of miRNA-19b with the increase of the concentration(P<0.05).80 μmol/L 20(S)-PPD significantly enhanced the activity of DNMT(P<0.05). After transfecting miRNA-19b mimics, the expression of miRNA-19b upregulated,the expression of TNFα was repressed, and the apoptosis rate reduced(P<0.05).After joining 65 μmol/L 20(S)-PPD, the expression of miRNA-19b decreased，the expression of TNFα increased, and the apoptosis rate increased(P<0.05).ConclusionIn MCF-7 cells, 20(S)-PPD may inhibit the expression of miRNA-19b, increase the expression of TNFα, and induce apoptosis through its methylation role.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.011

*國家自然科學(xué)基金資助項目 81101655；湖南省自然科學(xué)基金資助項目 12JJ3099

1)中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系 長沙 410078 2)蘇州市立醫(yī)院北區(qū)體檢中心 江蘇蘇州 215008 3)中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 長沙 410004

#通信作者，女，1981年8月生，博士，副教授，研究方向：復(fù)雜疾病的遺傳流行病學(xué)、復(fù)雜疾病多組數(shù)據(jù)挖掘與統(tǒng)計分析方法，E-mail：yangfang2010@csu.edu.cn

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