長期乙醇暴露對(duì)大鼠肺組織中TREM-1/2通路表達(dá)的影響*

張偉宏,徐高磊，易詩琪，張譯錚，沈建明，楊靜塵，楊東斌

長期乙醇暴露對(duì)大鼠肺組織中TREM-1/2通路表達(dá)的影響*

張偉宏1,2),徐高磊3)，易詩琪4)，張譯錚4)，沈建明4)，楊靜塵4)，楊東斌2)#

肺；乙醇；TREM-1；TREM-2

目的：探討長期乙醇暴露對(duì)大鼠肺組織中TREM-1/2通路表達(dá)的影響。方法將40只SD大鼠隨機(jī)分為2組。乙醇組按2.5 mL/(kg·d)的劑量灌胃體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇；對(duì)照組灌胃等量清水。4周后，運(yùn)用免疫組化染色及Western blot技術(shù)檢測(cè)大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2及信號(hào)銜接蛋白DAP-12的表達(dá)。結(jié)果4周后，對(duì)照組大行動(dòng)敏捷，食欲良好，無腹瀉，體重增加明顯；與對(duì)照組比較，乙醇組大鼠體重?zé)o明顯增加，出現(xiàn)腹瀉癥狀，大鼠肺組織中TREM-1表達(dá)下調(diào)，TREM-2和DAP-12表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論長期乙醇暴露可能破壞大鼠肺巨噬細(xì)胞TREM-1/2通路的平衡，導(dǎo)致大鼠免疫力低下。

目前我國飲酒人數(shù)超過2億。酗酒是一個(gè)嚴(yán)重的全球問題，每年酗酒致死的人數(shù)占全球死亡人數(shù)的3.8%[1]。單核巨噬細(xì)胞作為肺部抵御外界入侵的防線，在特異性和非特異性免疫中均起著重要作用。機(jī)體攝入的乙醇在代謝過程中會(huì)造成氧化負(fù)荷加重[2]、肺巨噬細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度減少[3]等現(xiàn)象，并通過一系列分子機(jī)制導(dǎo)致肺免疫功能受損。髓系細(xì)胞觸發(fā)受體 (triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM)是于2000年被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)免疫球蛋白超家族受體，目前已證實(shí)有TREM-1、TREM-2和TREM-3[4]。TREM-1是IgG超家族的細(xì)胞膜受體，在肺組織里主要選擇性表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞表面。TREM-1活化可促使TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放[5]，促進(jìn)并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[6]。TREM-2與TREM-1作用相反[7-9]。適配器DNAX激活蛋白12(DNAX-activation protein 12，DAP-12)是一種信號(hào)銜接蛋白，存在于巨噬細(xì)胞表面，通過與TREM-1及TREM-2結(jié)合，影響巨噬細(xì)胞的功能[10]。該實(shí)驗(yàn)擬采用長期乙醇暴露下的SD大鼠模型，研究乙醇暴露對(duì)肺巨噬細(xì)胞TREM-1/DAP-12、TREM-2/DAP-12信號(hào)通路的影響，從信號(hào)傳導(dǎo)途徑揭示乙醇誘導(dǎo)的肺免疫功能改變的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究相關(guān)疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組將健康成年SD大鼠(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)分區(qū)分籠飼養(yǎng)。所有動(dòng)物均排除肺部和全身疾病，實(shí)驗(yàn)過程中維持標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境條件，動(dòng)物飼以標(biāo)準(zhǔn)化顆粒飼料(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，可以自由進(jìn)食、飲水，自然晝夜節(jié)律。選取成年大鼠40只，隨機(jī)分為兩組，每組20只。乙醇組以2.5 mL/(kg·d)的劑量灌胃體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇，持續(xù)4周；對(duì)照組給予清水。

1.2肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的Westernblot法檢測(cè)山羊抗鼠TREM-1多克隆抗體(E-19)、山羊抗鼠TREM-2多克隆抗體(G-16)和山羊抗鼠DAP-12多克隆抗體(A-20)購自美國Santa Cruz公司。Western blot具體步驟：大鼠頸椎脫臼處死，迅速剝離肺組織，用勻漿器碾碎部分(n=12)組織，提取蛋白并測(cè)定蛋白濃度，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后加入E-19(稀釋度1500)、G-16(稀釋度11 000)、A-20(稀釋度1500)4 ℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌3×10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG二抗(稀釋度11 000，碧云天公司)室溫?fù)u床孵育2 h，TBST振蕩洗滌3×10 min，加入ECL試劑反應(yīng)4 min，最后用X光膠片壓片，顯、定影后拍照并分析。以β-actin作為內(nèi)參。以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化法檢測(cè)另取適量的肺組織(n=20)于多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片，切片厚度 5～8 μm。脫蠟后，0.1 mol/L PBS漂洗3×5 min，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗2次，加入10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)以修復(fù)抗原，PBS清洗，血清封閉，滴加E-19(稀釋度1300)、G-16(稀釋度1500)、A-20(稀釋度1300)4 ℃過夜。PBS 沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育10～30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(PBS 稀釋)37 ℃孵育10～30 min， DAB顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。用Image J軟件分析計(jì)算單位面積中的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠行為及外觀的比較乙醇組大鼠體毛發(fā)黃、光澤不佳，動(dòng)作遲緩，嗜睡，實(shí)驗(yàn)期間體重?zé)o明顯增加，食量較小，出現(xiàn)腹瀉癥狀。上述表現(xiàn)隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間越長而更為顯著。對(duì)照組大鼠體毛光澤自然，行動(dòng)敏捷，食欲良好，無腹瀉，體重增加明顯。

2.2兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的Westernblot法檢測(cè)結(jié)果見圖1、表1。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，乙醇組大鼠肺組織中TREM-1蛋白表達(dá)水平降低，TREM-2和DAP-12蛋白表達(dá)水平升高。

1：對(duì)照組；2：乙醇組。圖1 兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的Western blot法檢測(cè)

組別nTREM?1TREM?2DAP?12對(duì)照組120．59±0．060．50±0．100．71±0．06乙醇組120．28±0．070．97±0．071．07±0．11t8．0606．4504．590P<0．001<0．001<0．001

2.3兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化檢測(cè)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，TREM-1陽性細(xì)胞主要分布于肺泡壁間隙，肺泡腔內(nèi)也可見少量陽性細(xì)胞；TREM-2陽性細(xì)胞主要分布于肺間質(zhì)內(nèi)；DAP-12蛋白表達(dá)呈陽性(圖2)。與對(duì)照組比較，乙醇組TREM-1蛋白表達(dá)水平降低，TREM-2、DAP-12蛋白表達(dá)水平升高(表2)。

1：對(duì)照組;2：乙醇組；A:TREM-1；B：TREM-2；C：DAP-12。圖2 兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化法檢測(cè)

表2 兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化檢測(cè)結(jié)果的比較個(gè)/mm2

3 討論

TREM-1多在單核巨噬細(xì)胞表達(dá)，雖然其天然配體至今未知，但TREM-1激動(dòng)性抗體誘導(dǎo)受體交聯(lián)后，受體與DAP-12結(jié)合，可導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)事件，包括磷脂酶、細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶(ERK)1/2磷酸化，以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和促炎癥細(xì)胞因子的分泌[11]，放大炎癥反應(yīng)。與TREM-1相反，TREM-2通過TREM-2/DAP-12介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，可活化免疫受體的酪氨酸殘基，傳遞激活信號(hào)，從而激活一系列的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白磷酸化以及相關(guān)的酶促反應(yīng)，影響巨噬細(xì)胞的活動(dòng)，抑制TREM-1對(duì)炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用。兩者之間隨著外界環(huán)境的變化，維持著一定的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)機(jī)體的炎癥反應(yīng)及免疫能力起著重要的調(diào)節(jié)作用。

該研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠比較，乙醇組大鼠肺組織中TREM-1表達(dá)水平降低，而TREM-2和DAP-12表達(dá)水平顯著升高，提示TREM-1與TREM-2之間的平衡被破壞，而這種失衡可能是大鼠免疫能力下降的關(guān)鍵因素。長期乙醇暴露條件下，大鼠肺組織中TREM-2與DAP-12水平升高，高水平的TREM-2通過與TREM-1競(jìng)爭(zhēng)DAP-12，從而抑制細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，減少肺部巨噬細(xì)胞的募集，致使肺部免疫力下降，一旦病原體等外來入侵物增加，機(jī)體就不能通過炎癥反應(yīng)來抵御外部入侵，導(dǎo)致肺部感染的發(fā)生[12]。

綜上所述，長期乙醇暴露可使大鼠肺組織中TREM-1和TREM-2的表達(dá)失衡，從而導(dǎo)致大鼠的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生缺陷，進(jìn)而造成免疫功能下降，其具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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(2017-03-22收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of long-term alcohol exposure on TREM-1/2 pathway expression in rat lung tissue

ZHANGWeihong1,2),XUGaolei3),YIShiqi4),ZHANGYizheng4)，SHENJianming4)，YANGJingchen4)，YANGDongbin2)

1)SchoolofNursing,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)ThePeople'sHospitalofHebiCity,Hebi，Henan458030 3)DepartmentofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 4)ClinicalMedicineCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

lung；alcohol；TREM-1；TREM-2

Aim: To investigate the effect of long-term alcohol exposure on the expressions of TREM-1,TREM-2 and DAP-12 in rat lung tissue.MethodsForty SD rats were allocated into 2 groups randomly. The rats in alcohol group were lavagely given alcohol(volume fraction of 20%) at dose of 2.5 mL/(kg·d), and those in control group were given water. After four weeks, immunohistochemical staining and Western blot technique were used to detect the expressions of TREM-1,TREM-2 and DAP-12 in lung tissue.ResultsAfter 4 weeks, the control rats had agile action, good appetite, no diarrhea, and gained weight obviously. Compared with control group, the rats in alcohol group had no significant weight gain, and showed diarrhea symptoms, TREM-1 expression in rat lung tissue decreased, and TREM-2 and DAP-12 expressions increased(P<0.05).ConclusionLong-term alcohol exposure may destroy the balance of TREM-1/2 pathway, thereby cause low immunity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.008

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 U1404814；河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃 17HASTIT048

1)鄭州大學(xué)護(hù)理學(xué)院 鄭州 450001 2)鶴壁市人民醫(yī)院 河南鶴壁 458030 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052

#通信作者，男，1974年2月生，博士，在站博士后，研究方向：慢性病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：dongbinyang@126.com

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