等離子體誘變微生物育種

李翔

摘要：介紹了一種新型誘變育種技術——等離子體誘變育種。首先對等離子體誘變的機理作了詳細地闡述；其次分析了氣體組分、氣壓、功率、氣流速率和誘變時間五個影響等離子體誘變的主要外界因素；最后簡單論述了在生物學領域中，等離子體誘變?nèi)〉玫某晒⒄雇鋺们熬啊?/p>

關鍵詞：誘變；等離子體；活性氧自由基；微生物育

中圖分類號：TB文獻標識碼：Adoi：10.19311/j.cnki.16723198.2017.35.093

等離子體是除固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)之外的第四種物質狀態(tài)，由大量的離子、電子以及中性粒子組成。等離子體是由于物質分子熱運動相互碰撞使氣體分子電離出自由電子，電子在電場或磁場中加速形成高能電子，進而碰撞氣體分子使其電離，往復循環(huán)，最終形成大量中性粒子、離子和電子的混合物質。由于電離過程中正離子帶的電荷和電子總是對應出現(xiàn)，所以等離子體中正離子帶的電荷數(shù)和電子的總數(shù)大致相等，總體來看為電中性。反過來，可以把等離子體定義為：正離子和電子的電荷密度大致相等的電離氣體。

等離子體根據(jù)其粒子的溫度不同可分為高溫等離子體和低溫等離子體，高溫等離子體中所有粒子溫度都處于較高的溫度，而低溫等離子體中只有電子處于較高溫度，有較高的能量，其他粒子則處于常溫。根據(jù)其產(chǎn)生方式不同，等離子體可分為微波等離子體、射頻等離子體、介質阻擋放電等離子體、電暈等離子體、電弧等離子體等。

等離子體誘變是在其滅菌原理基礎上，近幾年才起步發(fā)展的一種誘變方法。在誘變育種的應用中，由于生物的熱敏性只能采用冷等離子體誘變，該方法既彌補了化學方法的高污染性和變異單一性，解決了傳統(tǒng)物理誘變法的遺傳不穩(wěn)定、變異率低等缺點。與近些年興起的離子注入誘變法相比，等離子體誘變技術對真空的要求不高，不會因真空產(chǎn)生的低溫或由離子束產(chǎn)生的高溫而使細胞失活，該誘變技術可以較大程度的提高細胞存活率，提高誘變效率，是一種適合于微生物誘變育種的技術。

1等離子體誘變原理

微生物的變異是指外界因素使細胞內(nèi)的DNA分子被破壞，使其大量的堿基配對錯誤，從而導致在DNA復制時產(chǎn)生基因突變，子代出現(xiàn)不同的基因型和表現(xiàn)型。冷等離子體中富含各種射線和粒子，等離子體誘變技術是通過對細胞有影響的光、荷電粒子和中性粒子等離子體對生物表層及遺傳物質造成損傷、引發(fā)細胞修復，從而導致生物體表型和基因的改變。

在等離子體誘變中，射線和粒子對細胞表層造成的直接刻蝕作用。電子、自由基等對細胞壁造成直接損傷，改變細胞膜的通透性，從而使各種誘變因子易于進入細胞而與DNA發(fā)生作用。電子具有較高的能量，但其能量碰到分子易損失，只能作用于細胞表層與細胞壁上的大分子，使其在一定程度上受損。各種活性氧自由基與細胞壁的大分子產(chǎn)生復雜的化學效應和生物效應，也會對細胞壁和細胞膜的結構造成損傷。研究人員發(fā)現(xiàn)等離子體處理過的微生物胞內(nèi)蛋白和核酸濃度減少，而胞外溶液中蛋白和核酸濃度增加，這表明等離子體可以破壞細胞壁和細胞膜結構，對細胞表層造成直接刻蝕，這樣紫外線及各種粒子可以很容易地進入細胞與胞內(nèi)物質反應。

當細胞的表層遭到破壞以后，進入細胞的各種誘變因子與細胞中的DNA產(chǎn)生作用。冷等離子體對微生物DNA產(chǎn)生傷害及誘變效應的可能原因有三種：（1）是紫外線直接照射DNA引起基因突變。對DNA有明顯傷害作用的紫外線波段是200-280nm，而等離子體中此波段的紫外線劑量不足，難以對DNA造成較大的傷害。（2）是原子通過紫外線照射與微生物DNA分子結合形成不穩(wěn)定化合物，造成微生物變異。在充入惰性氣體的等離子體中，原子在紫外照射下也難以與其他物質反應，也不會對DNA造成損傷，但會產(chǎn)生自由基，通過自由基對DNA分子造成損傷。（3）是活性氧自由基與微生物DNA分子產(chǎn)生氧化反應，造成微生物變異。Mathieu Leduc等將裸露的DNA分別由充氦氣的介質阻擋放電等離子體和大氣壓輝光等離子體炬處理后均會得到斷裂的DNA片段，并證實了活性氧自由基是造成DNA斷裂的主要因素。因此活性氧自由基是等離子體誘變的主導因素。

誘變過程中，活性氧自由基進入細胞后，首先與DNA分子中的堿基或脫氧核糖發(fā)生反應生成其它自由基，如胸腺嘧啶經(jīng)過氧化，生成胸腺嘧啶二羥基醇，鳥嘌呤被氧化后生成8-氧橋鳥嘌呤；導致DNA堿基被破壞，當細胞中DNA分子中高密度長片段發(fā)生損傷，會導致DNA復制過程受到抑制，激發(fā)細胞的修復機制，即SOS修復，在DNA分子的復制受到抑制時，會產(chǎn)生一種具有較低特異性的聚合酶、重組酶等。這些酶可催化損傷部位的DNA復制，使細胞得以存活，在DNA復制時導致堿基的錯配、DNA鏈斷裂，進而導致染色體重復、倒位、易位或缺失，使遺傳性質發(fā)生較大變化，進而易引發(fā)廣泛、長期的突變，形成新的表現(xiàn)型和基因型。

2影響等離子體誘變的因素

影響等離子體誘變的因素可以分為兩類：一是等離子體產(chǎn)生的條件，包括氣體氣壓、氣流速率、組分或功率等）；二是誘變操作的條件（如誘變時間）。

等離子體中通入氣體的組分對等離子體產(chǎn)生自由基的種類影響很大，不同的氣體組分會產(chǎn)生不同的反應，形成不同的自由基，如通入氫氣會產(chǎn)生氫自由基， 氧氣會產(chǎn)生氧自由基，水蒸氣會產(chǎn)生羥基自由基。Xianhui Zhang等在研究大氣壓介質阻擋放電等離子體對鏈球菌的作用時發(fā)現(xiàn)通入氦氣和少量氧氣時產(chǎn)生氦、羥基和氧三種自由基，實驗證明使鏈球菌失活的主要是羥基和氧自由基。由此可證明，氧氣在等離子體中產(chǎn)生活性氧自由基，這種活性氧自由基對細胞的破壞作用是至關重要的。研究表明不同自由基的氧化性不同，對微生物的誘變效果也不同，如羥基自由基對大腸桿菌造成的傷害很小，而氧自由基和一氧化氮自由基對大腸桿菌造成的傷害較大，一氧化二氮自由基和過氧化物自由基對大腸桿菌造成的傷害更為明顯。即使同種自由基對于不同的微生物造成的傷害也有差異，羥基自由基對于大腸桿菌造成的傷害很小，而對鏈球菌造成的傷害很大。因此，某種或幾種能在等離子體中產(chǎn)生多種活性氧自由基的氣體組分對等離子體誘變起著積極的作用，選取氣體組分時也應考慮對特定微生物的針對性。endprint

氣壓對等離子體誘變過程中細胞的存活率有一定影響，也會對活性氧自由基的濃度產(chǎn)生影響?？捎糜谡T變的等離子體有低壓等離子體和大氣壓等離子體，一般氣體壓力低于1×103Pa的為低壓等離子體，主要用于輝光等離子體。由于低壓會造成細胞在未誘變之前死亡，也會降低等離子體產(chǎn)生自由基的濃度，從而影響誘變效果，因此現(xiàn)在大部分誘變利用大氣壓等離子體實現(xiàn)。然而低壓會使等離子體中電子的自由程增加，可能會產(chǎn)生氧化性更強的自由基，對誘變產(chǎn)生一定的正面影響。因此氣壓對誘變效果的影響還需要進一步的驗證。

等離子體的功率對誘變的影響是間接的，功率是通過電子的能量和自由基的氧化性來使細胞變異的，功率的大小會直接影響電子的能量大小及活性氧自由基的形成，從能量的傳遞方面來講，功率越大對細胞的破壞就越強。Bo Yang等在研究大氣壓冷等離子體滅菌時，功率越高細菌存活率越低，功率達到15W時，只需處理9s，細菌死亡率就達100%。對于誘變來說，需要找到一個合適的誘變功率，使致死率和正突變率均達到最佳的水平。

氣體的流速對于誘變的影響在于它能控制等離子體的形態(tài)和自由基的密度，而等離子體發(fā)光影像的形狀與其各部分的自由基密度有關。等離子體剛產(chǎn)生時離子化不穩(wěn)定，這會導致電荷收縮到電極表面，引起局部溫度升高，高溫會導致離子化程度更高，使整體的離子化程度不均一，而氣體的流動會帶走多余的熱量使離子化穩(wěn)定。氣體流速過高又會帶走大量自由基，使活性氧自由基密度減小。J Goree等發(fā)現(xiàn)，等離子體發(fā)光影像在氣體低流速時為實心圓形，高流速時為環(huán)形，與高能電子的空間分布有關，發(fā)現(xiàn)氣體流速決定了自由基產(chǎn)生的位置。

誘變時間對等離子體誘變的影響非常明顯，一般誘變時間越長，細胞的存活率就越低，夏書琴等利用大氣壓輝光放電冷等離子體對鏈霉菌孢子進行誘變時，得到菌體致死率隨時間的延長而逐漸增加，到6min時達100%。而董曉宇等人通過大氣壓冷等離子介質阻擋放電法，對產(chǎn)1，3-丙二醇的克雷伯氏菌誘變，制得隨誘變時間增加細胞存活率下降的曲線，但細胞存活率下降到一定值會飽和，細胞自我修復機制的激活會導致存活率有所上升。由于誘變裝置和誘變菌種的差異，以上兩者的致死率隨時間變化的曲線稍有不同，然而其總體趨勢是一致的。

以上五種誘變因素都會不同程度地影響誘變效果，其中誘變時間和氣體組分有較系統(tǒng)的報道，而其他三種因素沒有系統(tǒng)的研究報道，氣壓對誘變影響的有關文獻資料尤其少，因此這些有待于進一步研究。等離子體誘變的裝置有多種，它們對于同種微生物誘變特點的比較也有待于進一步研究。

3等離子體在生物領域的應用前景

等離子體在生物領域有著一定程度的應用。近幾年，等離子體誘變技術雖取得了階段性成果，得到了快速發(fā)展，但應用并不廣泛。Yuan Lu等人利用大氣壓室溫等離子體誘變，制得突變體，其產(chǎn)氫量約1.134 molH2/ mol葡萄糖，是原菌株的126.4%倍。夏書琴等人也利用大氣壓輝光放電冷等離子體，對茂源鏈輪絲菌03-10進行誘變，制得高產(chǎn)谷氨酰胺轉氨酶的突變株G2-1，酶活高達到2.73U/mL，是出發(fā)菌株的182% 倍，具有較穩(wěn)定的遺傳性。Xiufu Hua等人利用大氣壓常溫輝光等離子體對腸桿菌進行誘變，制得耐鹽性腸桿菌（MU-1），其耐鹽性高達7.5%，是野生菌種的三倍多。董曉宇等人亦采用大氣壓冷等離子介質阻擋放電法對產(chǎn)1， 3-丙二醇的克雷伯氏菌進行誘變，制得突變株，其對甘油的質量轉化率高達0.57g/g，是野生菌株的158%倍。

等離子體誘變技術應用用育種領域，相比于傳統(tǒng)技術，具有效率高，操作簡單，綠色環(huán)保等優(yōu)點，但是作為一種創(chuàng)新性誘變方法，技術方面仍需探索，逐步完善，逐步成為可以得到廣泛應用的誘變育種方法。

參考文獻

[1]菅井秀郎. 等離子體電子工程學[M].北京：科學出版社，OHM社， 2002.

[2]Mathieu Leduc et al. Effects of non-thermal plasmas on DNA and mammalian cells[J].Plasma Process.Polym，2010， （7）： 899909.

[3]夏書琴等. 大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變選育谷氨酰胺轉胺酶高產(chǎn)菌株[J].微生物學通報，2010， 37（11）： 16421649.endprint