氮摻雜高量子產(chǎn)率熒光碳點的制備及其體外生物成像研究

姜 杰， 李士浩， 嚴一楠， 何丹農(nóng)*

(1. 上海交通大學 材料科學與工程學院， 上海 200240；2. 納米技術及應用國家工程研究中心， 上海 200241)

氮摻雜高量子產(chǎn)率熒光碳點的制備及其體外生物成像研究

姜 杰1,2， 李士浩1,2， 嚴一楠2， 何丹農(nóng)1,2*

(1. 上海交通大學 材料科學與工程學院， 上海 200240；2. 納米技術及應用國家工程研究中心， 上海 200241)

為獲得高量子產(chǎn)率的碳點，以檸檬酸為碳源，苯二胺的3種同分異構體為氮源，采用兩步溶劑熱法制備了氮摻雜熒光碳點。利用透射電子顯微鏡(TEM)、紫外-可見吸收光譜 (UV-Vis)、熒光光譜、紅外光譜 (FTIR)、X射線光電子能譜(XPS)對樣品進行表征，并考察了碳點的細胞毒性和體外生物成像。實驗結果表明：3種高量子產(chǎn)率碳點(Y=52%，60.4%，53.2%)的粒徑均一，具有較好的分散性，平均尺寸分別為4.5，5.3，5.2 nm。碳點表面含有羥基、羧基、胺基等基團，在紫外光激發(fā)下均能發(fā)出明亮的藍色熒光，并具有穩(wěn)定的熒光性能。細胞實驗表明：3種碳點具有較好的生物相容性，能夠快速進入細胞并成功應用于細胞的熒光成像。

碳點； 高量子產(chǎn)率； 體外生物成像

1 引 言

近年來，碳納米材料諸如碳納米管、富勒烯、石墨烯等，因其獨特的性質及在生物傳感、成像等領域的潛在應用，受到廣泛關注[1-2]。碳點(Carbon dots)作為一種新型的熒光碳材料，引起了科學界廣泛的研究興趣[3]。2004年，Xu等[4]在純化由電弧放電法制備的單壁碳納米管的過程中，首次分離出一種熒光碳納米顆粒。2006年，Sun等[5]利用表面鈍化，獲得了熒光性能較好的碳納米顆粒，并命名為“碳點”。碳點是粒徑不超過10nm的近球形熒光顆粒，主要由碳、氫、氧、氮等元素組成。碳點不僅具有與半導體量子點相媲美的熒光性能，同時還具有生物相容性、低毒性、低成本、制備簡單、易于功能化等獨特優(yōu)勢，因此有望取代半導體量子點應用于細胞標記、生物成像、生物傳感、催化、藥物輸送等領域[6-11]。

然而，與傳統(tǒng)的量子點相比，碳點的熒光量子產(chǎn)率相對較低，限制了其作為熒光探針在生物成像等領域的應用[12-13]。目前，氮元素摻雜是提高碳點熒光量子產(chǎn)率的一種常用的方法。例如，Liu等[14]以檸檬酸為碳源，甘氨酸為氮源，制備了量子產(chǎn)率達到59.8%的氮摻雜碳點，與單純以檸檬酸分子為原料制備的碳點相比(Y<10%)，經(jīng)過氮摻雜后量子產(chǎn)率顯著提高[15-16]。Yang等[17]以檸檬酸和乙二胺作為原料，同樣合成了氮摻雜碳點，其熒光量子產(chǎn)率高達80%。因此，以檸檬酸為碳源，同時進行氮摻雜不失為一種提高碳點量子產(chǎn)率的方法。本文以檸檬酸為碳源，分別以苯二胺的3種同分異構體為氮源，兩步溶劑熱法成功制備了3種氮摻雜的具有高熒光量子產(chǎn)率且熒光性質穩(wěn)定的藍色熒光碳點。該方法制備的碳量子點具有較好的生物相容性，可應用于細胞熒光成像。

2 實驗材料及方法

2.1主要原料

采用的主要原料有：檸檬酸，鄰苯二胺，間苯二胺，對苯二胺，無水乙醇和硫酸奎寧，購自國藥集團化學試劑北京有限公司，AR；二氯甲烷和甲醇，購自上海泰坦科技股份有限公司，AR；硅膠，購自上海泰坦科技股份有限公司，200-300目，AR。

2.2苯二胺-檸檬酸碳點的兩步法制備

2.2.1苯二胺碳核的制備

將苯二胺的3種同分異構體(鄰、間、對)分別溶于無水乙醇，將其加入到水熱反應釜中，于180℃條件下反應6h，自然冷卻至室溫，得到3種不同的苯二胺碳核粗產(chǎn)物。以甲醇/二氯甲烷的混合溶液為洗脫劑進行柱層析提純，旋蒸除去溶劑后分散于去離子水中，對應得到3種碳核C1、C2、C3。

2.2.2苯二胺-檸檬酸碳點的制備

將以上3種碳核溶液分別與檸檬酸水溶液混合均勻，180℃條件下反應6h，自然冷卻至室溫，即得到3種碳點粗產(chǎn)物。其他步驟與2.2.1相同。得到3種對應的苯二胺-檸檬酸碳點OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs。

2.3儀器和表征

透射電子顯微鏡(TEM，Jeol，2100F)用于表征碳點的大小和形貌，TEM樣品制備是通過將一滴碳點溶液滴到超薄銅網(wǎng)上，室溫下晾干。紅外光譜(FTIR)是應用傅里葉轉換紅外光譜分析儀(FT-IR，Nicolet，170SX)，在650～2000cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)得到的用于獲得碳點的表面基團信息。X射線光電子能譜(XPS，Kratos，AXIS Ultra DLD)用于表征碳點元素構成。紫外分光光度計(UV-Vis，PerkinElmer，Lambda950)和熒光光譜儀(Hitachi，F(xiàn)-7000)用于表征碳點的光學性質。

2.4熒光量子產(chǎn)率的測定

將硫酸奎寧(Y=0.54)溶解在0.1mol/L的硫酸溶液中，并以其作為參比物，在同一激發(fā)波長下分別測定碳點稀溶液和參比物稀溶液的積分熒光強度以及對應該激發(fā)波長的吸光度(吸光度均小于0.05)。碳點量子產(chǎn)率的計算遵循以下公式：

(1)

其中，Y是量子產(chǎn)率，F(xiàn)是積分熒光強度，A是吸光度，n代表溶劑的折射率(二者均為1.33)。下標u表示樣品，S則代表參比物。

2.5細胞毒性

采用CCK-8法檢測材料對細胞的毒性。將NIH3T3細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中(37℃,5% CO2)培養(yǎng)24h，然后加入不同濃度的碳點溶液，分別培養(yǎng)12，24，48h。接著，加入10% CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2～4h。最后，用酶標儀(Bio-Rad,iMark/xMark)測定每孔細胞在450nm處的吸光度，記錄并處理實驗結果。

2.6細胞成像

利用激光共聚焦顯微鏡(Leica,TCS SP5)對碳點在細胞內(nèi)的分布進行觀察。樣品制備：分別將NIH3T3細胞和Hela細胞以每孔5×103～1×104個接種于四分皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中(37℃,5% CO2)培養(yǎng)12h，然后加入一定濃度的碳點溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2～4h，吸棄舊的溶液，PBS清洗3次。樣品加入4%的多聚甲醛固定10min，PBS清洗3次，用PBS浸沒四分皿后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3 結果與討論

3.1碳點的制備及表征

圖1為3種高熒光量子產(chǎn)率碳點制備示意圖。碳點由苯二胺和檸檬酸經(jīng)過兩步溶劑熱反應合成：(1)在高溫高壓條件下，苯二胺的3種同分異構體分別經(jīng)過水解、聚合及碳化作用，形成碳核；(2)檸檬酸在碳核的表面進一步聚合碳化，最終得到碳點。

圖1 高量子產(chǎn)率碳點的合成示意圖

圖2 C1(a))、C2(b)和C3(c)以及OP-CCDs(d)、MP-CCDs(e)和PP-CCDs(f)的TEM圖。

圖2分別為碳核及碳點的TEM圖片。碳核及碳點的粒徑分布均勻，具有良好的分散性。經(jīng)統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，碳核C1、C2、C3的平均尺寸為2.0，2.3，2.2nm，碳點OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的平均尺寸為4.5，5.3，5.2nm。顯然，在加入檸檬酸經(jīng)過二次碳化后，粒徑明顯增大，說明檸檬酸在碳核表面發(fā)生了聚合碳化。

圖3 碳點的FTIR譜圖(a)和XPS全譜圖(b)

Fig.3FTIR spectra(a) and XPS spectra of carbon dots(b)

圖4 OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的C1s (a～c)、N1s (d～f)和O1s (g～i)分譜。

3.2高量子產(chǎn)率碳點的光學特性

OP-CCDs、MP-CCDs的乙醇溶液在可見光下為黃綠色溶液，而PP-CCDs為棕色，但3種碳點在365nm的紫外光激發(fā)下均能發(fā)出明亮的藍色熒光，如圖5(c)插圖所示。圖5(a)是OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的紫外-可見吸收光譜，三者均在紫外光區(qū)有吸收，并且一直延續(xù)到可見光區(qū)。圖5(b)是碳點的激發(fā)光譜，OP-CCDs的最強激發(fā)波長在362nm處，MP-CCDs在359nm，而PP-CCDs在356nm。圖5(c)是碳點在365nm激發(fā)光下的發(fā)射光譜，它們的最強發(fā)射波長分別為425，435，438nm，說明在紫外光激發(fā)下的發(fā)射波長均位于藍光區(qū)，與插圖結果一致。通過計算，3種碳量子點在365nm激發(fā)下的量子產(chǎn)率分別為50.2%、54.3%和48.7%。

圖6是OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs在不同的激發(fā)波長下的發(fā)射光譜。隨著激發(fā)波長的增大，對應的發(fā)射波長向長波方向移動，且熒光強度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，表現(xiàn)出碳點典型的激發(fā)波長依賴性[25]。在生物成像應用中，根據(jù)這一特性，可以通過改變激發(fā)波長實現(xiàn)多色成像。OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs的最強發(fā)射波長分別為432，436，436nm，對應的激發(fā)波長為380，360，360nm，以硫酸奎寧作為參比物的熒光量子產(chǎn)率分別達到52%、60.4%和53.2%，與傳統(tǒng)的熒光染料如硫酸奎寧(54%)以及包括ZnS(50%)、CdSe(40%～50%)在內(nèi)的一些傳統(tǒng)量子點的量子產(chǎn)率相當[26]。

圖5碳點的紫外吸收光譜(a)、激發(fā)光譜(b)和在365nm激發(fā)下的發(fā)射光譜(c)。插圖為碳點在可見光及紫外光下的圖片。

Fig.5UV-Vis absorption spectra (a), excitation spectra (b) , and emission spectra excited by365nm (c). Inset shows the photograph of carbon dots under visible light and UV light.

圖6 OP-CCDs (a)、 MP-CCDs (b)和PP-CCDs (c)在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜。

圖7 碳點的光穩(wěn)定性

圖7是OP-CCDs、MP-CCDs和PP-CCDs在365nm激光持續(xù)照射下得到的光穩(wěn)定性圖。在經(jīng)過48h的持續(xù)照射之后，熒光強度仍能夠保持在80%、78%和75%，可見所制備的樣品在具有較高量子產(chǎn)率的同時也具有超越一般半導體量子點的光學穩(wěn)定性，這有利于碳點的長時間造影。

3.3碳點的體外生物成像研究

在碳點作為熒光探針用于生物成像前，常利用CCK實驗檢測碳點的細胞毒性。將不同濃度的碳點與正常組織細胞NIH3T3分別共孵育12，24，48h, 隨著材料濃度的增加及共孵育時間的延長，細胞存活率整體呈下降趨勢，但始終保持較高的生物相容性。在碳點濃度為40mg/mL的情況下，與NIH3T3細胞共孵育48h后, 細胞的存活率仍接近90%，說明所制備的碳點具有較低的細胞毒性，有利于細胞的生物成像應用(圖8)。

圖8 OP-CCDs (a)、MP-CCDs (b)、PP-CCDs (c)的細胞毒性評估。

圖9 OP-CCDs(a)、MP-CCDs(b)、PP-CCDs (c)及PBS(d)與NIH3T3細胞共孵育6 h的熒光成像。

Fig.9Fluorescence imaging of OP-CCDs (a), MP-CCDs (b), PP-CCDs (c), and PBS(d) incubated with NIH3T3cells for6h, respectively.

圖9(a)～(c)是OP-CCDs、MP-CCDs、PP-CCDs與正常組織細胞NIH3T3共孵育6h后的共聚焦圖,(d)為空白對照組。在405nm的激發(fā)下，經(jīng)3種碳點處理的細胞都呈現(xiàn)出明亮的藍色熒光，且熒光信號在細胞質和細胞核中均有分布，主要集中于細胞質中;而在同樣條件下，對照組中無熒光，說明碳點成功進入細胞并發(fā)出熒光。

4 結 論

本文以3種苯二胺和檸檬酸為原料，利用兩步溶劑熱法成功合成了3種高量子產(chǎn)率(Y>50%)的熒光碳點。所制備碳點的分散良好，平均粒徑在5nm左右，表面含有豐富的基團，如羥基、羧基、氨基等。在紫外光激發(fā)下，3種碳點均能發(fā)出明亮的藍色熒光，在經(jīng)過48h的持續(xù)照射之后，3種碳點仍能保持75%以上的熒光強度，具有光學穩(wěn)定性。同時，隨著激發(fā)波長的增大，對應的發(fā)射光譜向長波方向移動，且熒光強度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，表現(xiàn)出激發(fā)波長依賴性。此外，3種碳點具有較好的生物相容性，并且能夠被細胞被動吞噬，在405nm的激發(fā)下發(fā)出明亮的藍色熒光，說明所制備的碳點可以作為熒光探針用于細胞成像。

[1] PRATO M. Fullerene chemistry for materials science applications [J].J.Mater.Chem., 1997, 7(7):1097-1109.

[2] YANG S T, CAO L, LUO P G,etal.. Carbon dots for optical imaginginvivo[J].J.Am.Chem.Soc., 2009, 131(32):11308-11309.

[3] 婁慶, 曲松楠. 基于超級碳點的水致熒光“納米炸彈” [J]. 中國光學, 2015, 8(1):91-98.

LOU Q, QU S N. Water triggered luminescent ‘nano-bombs’ based on supra-carbon-nanodots [J].Chin.Opt., 2015, 8(1):91-98. (in Chinese)

[4] XU X, RAY R, GU Y,etal.. Electrophoretic analysis and purification of fluorescent single-walled carbon nanotube fragments [J].J.Am.Chem.Soc., 2004, 126(40):12736-12737.

[5] SUN Y P, ZHOU B, LIN Y,etal.. Quantum-sized carbon dots for bright and colorful photoluminescence [J].J.Am.Chem.Soc., 2006, 128(24):7756-7757.

[6] WANG W, LI Y M, CHENG L,etal.. Correction: water-soluble and phosphorus-containing carbon dots with strong green fluorescence for cell labeling [J].J.Mater.Chem. B, 2013, 2(1):46-48.

[7] ZHUO Y, MIAO H, ZHONG D,etal.. One-step synthesis of high quantum-yield and excitation-independent emission carbon dots for cell imaging [J].Mater.Lett., 2015, 139:197-200.

[8] WANG X, CAO L, YANG S T,etal.. Bandgap-like strong fluorescence in functionalized carbon nanoparticles [J].Angew.Chem.Int.Ed., 2010, 49(31):5310-5314.

[9] CAO L, SAHU S, ANILKUMAR P,etal.. Carbon nanoparticles as visible-light photocatalysts for efficient CO2conversion and beyond [J].J.Am.Chem.Soc., 2011, 133(13):4754-4757.

[10] WANG Q L, HUANG X X, LONG Y J,etal.. Hollow luminescent carbon dots for drug delivery [J].Carbon, 2013, 59:192-199.

[11] LIM S Y, SHEN W, GAO Z. Carbon quantum dots and their applications [J].Chem.Soc.Rev., 2015, 44(1):362-381.

[12] ZHAO H X, LIU L Q, LIU Z D,etal.. Highly selective detection of phosphate in very complicated matrixes with an off-on fluorescent probe of europium-adjusted carbon dots [J].Chem.Commun., 2011, 47(9):2604-2606.

[13] DMITRI V T, ANDREY L R, KORNOWAKI A,etal.. Highly luminescent monodisperse CdSe and CdSe/ZnS nanocrystals synthesized in a hexadecylamine-trioctylphosphine oxide-trioctylphospine mixture [J].NanoLett., 2001, 1(4):207-211.

[14] LIU P P, ZHANG C C, LIU X,etal.. Preparation of carbon quantum dots with a high quantum yield and the application in labeling bovine serum albumin [J].Appl.Surf.Sci., 2016, 368:122-128.

[15] DONG Y Q, SHAO J W, CHEN C Q,etal.. Blue luminescent graphene quantum dots and graphene oxide prepared by tuning the carbonization degree of citric acid [J].Carbon, 2012, 50(12):4738-4743.

[16] ZHANG Y, CUI P P, ZHANG F,etal.. Fluorescent probes for “off-on” highly sensitive detection of Hg2+and L-cysteine based on nitrogen-doped carbon dots [J].Talanta, 2016, 152:288-300.

[17] ZHU S J, MENG Q N, WANG L,etal.. Highly photoluminescent carbon dots for multicolor patterning, sensors, and bioimaging [J].Angew.Chem.Int.Ed., 2013, 52(14):3953-3957.

[18] HU Y, YANG J, TIAN J,etal.. Waste frying oil as a precursor for one-step synthesis of sulfur-doped carbon dots with pH-sensitive photoluminescence [J].Carbon, 2014, 77:775-782.

[19] QU S N, WANG X Y, LU Q P,etal.. A biocompatible fluorescent ink based on water-soluble luminescent carbon nanodots [J].Angew.Chem.Int.Ed., 2012, 51(49):123821-12384.

[20] ZHAI X, ZHANG P, LIU C,etal.. Highly luminescent carbon nanodots by microwave-assisted pyrolysis [J].Chem.Commun., 2012, 48(64):7955-7957.

[21] PARAKNOWITSCH J P, ZHANG Y, WIENERT B,etal.. Nitrogen- and phosphorus-co-doped carbons with tunable enhanced surface areas promoted by the doping additives [J].Chem.Commun., 2012, 49(12):1208-1210.

[22] 王子儒, 張光華, 郭明媛. N摻雜碳量子點光穩(wěn)定劑的制備及光學性能 [J]. 發(fā)光學報, 2016, 37(6):655-661.

WANG Z R, ZHANG G H, GUO M Y. Preparation and optical properties of N-doped carbon dots as light stabilizer [J].Chin.J.Lumin., 2016, 37(6):655-661. (in Chinese)

[23] LI X, ZHU G, XU Z. Nitrogen-doped carbon nanotube arrays grown on graphene substrate [J].ThinSolidFilms, 1959, 520(6):1959-1964.

[24] YANG Z, XU M, LIU Y,etal.. Nitrogen-doped, carbon-rich, highly photoluminescent carbon dots from ammonium citrate [J].Nanoscale, 2014, 6(3):1890-1895.

[25] LIU R, WU D, LIU S,etal.. An aqueous route to multicolor photoluminescent carbon dots using silica spheres as carriers [J].Angew.Chem.Int.Ed., 2009, 48(25):4598-4601.

[26] HEDI M, J M M, ELLEN R G,etal.. Self-assembly of CdSe-ZnS quantum dot bioconjugates using an engineered recombinant protein [J].J.Am.Chem.Soc., 2000, 122(122):12142-12150.

PreparationofN-dopedFluorescentCarbonDotswithHighQuantumYieldforIn-vitroBioimaging

JIANGJie1,2,LIShi-hao1,2,YANYi-nan2,HEDan-nong1,2*

(1.SchoolofMaterialsScienceandEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China;2.NationalEngineeringResearchCentreforNanotechnology,Shanghai200241,China)

In order to obtain carbon dots with high quantum yield, a simple two-step solvothermal method was used to prepare fluorescent N-doped carbon dots with citric acid as carbon source and three isomers of phenylenediamine as nitrogen source. The carbon dots were characterized by Transmission electron microscopy (TEM), ultraviolet-visible spectrophotometry (UV-Vis), fluorescence spectrophotometry, Fourier transform infrared spectra (FTIR), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), followed by studying the cytotoxicity andin-vitrobioimaging. The results show that three kinds of high quantum yield carbon dots (Y=52%,60.4% and53.2%) possessing uniform size and excellent dispersibility have been successfully prepared, and the average size is4.5,5.3,5.2nm. The prepared carbon dots with hydroxyl, carboxyl, amine and other groups on the surface can emit bright blue fluorescence under the excitation of ultraviolet light, holding favorable optical stability at the same time. In addition, the cell imaging experiments indicate that the three kinds of carbon dots have good biocompatibility, capable of rapidly entering cells and successfully applied to fluorescence imaging of cells.

carbon dots; high quantum yield;in-vitrobioimaging

2017-04-21；

2017-09-07

上海市浦江人才項目(15PJ1432200)； 國家重點研發(fā)計劃(2016YFA0201204)； 上海市科學技術委員會項目(174419048000)； 上海市青年科技啟明星項目(17QB1402900)資助

Supported by Pujiang Talent Project of Shanghai (15PJ1432200); National Key Research and Development Plan (2016YFA0201204); Project of Shanghai Municipal Science and Technology Committee (174419048000); Youth Science and Technology Star Project of Shanghai (17QB1402900)

1000-7032(2017)12-1567-08

O482.31

A

10.3788/fgxb20173812.1567

*CorrespondingAuthor,E-mail:hdn_nercn@163.com

姜杰(1993-)，男，上海人，碩士，2017年于上海交通大學獲得碩士學位，主要從事碳量子點的制備及在腫瘤成像中的應用的研究。E-mail： 691150276@qq.com

何丹農(nóng)(1956-)，男，上海人，教授，博士生導師，主要從事納米材料與應用技術的研究。E-mail： hdn_nercn@163.com