藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建

劉紹偉 王 洋 田喜鳳

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)學(xué)科 河北唐山 063000

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建

劉紹偉 王 洋 田喜鳳

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)學(xué)科 河北唐山 063000

①目的 構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒，為賈第素功能的研究奠定基礎(chǔ)。②方法 從α-4賈第素克隆載體pGM-T-α-4中雙酶切獲得α-4賈第素編碼序列，與酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7在DNA連接酶的作用下進(jìn)行重組，重組載體通過(guò)熱休克法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，大腸桿菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、篩選，堿裂解法提取質(zhì)粒酶切鑒定獲得pGBKT7-α-4誘餌載體。并對(duì)誘餌載體進(jìn)行自激活驗(yàn)證，利用Western blot鑒定誘餌蛋白的表達(dá)情況。③結(jié)果 經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，獲得了pGBKT7-α-4誘餌載體。轉(zhuǎn)化子Y187酵母細(xì)胞在SD/-Trp平板上能夠生長(zhǎng)；而在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade平板上不能生長(zhǎng)。說(shuō)明pGBKT7-α-4質(zhì)粒無(wú)自我激活作用。Western blot鑒定結(jié)果顯示，pGBKT7-α-4轉(zhuǎn)化酵母菌在52KD 水平位置可檢測(cè)到α-4 融合C-Myc蛋白的表達(dá)。④結(jié)論 構(gòu)建α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒。誘餌蛋白質(zhì)粒無(wú)自我激活作用，在酵母菌株中表達(dá)良好，為賈第素功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

α-4賈第素 構(gòu)建誘餌蛋白質(zhì)粒 酵母雙雜交

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)是一種原始的單細(xì)胞真核生物，常引起賈第蟲(chóng)病[1]。賈第蟲(chóng)病通過(guò)糞口途徑傳播，患者通過(guò)飲用含有賈第蟲(chóng)包囊的水感染，賈第蟲(chóng)病具有傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高的特點(diǎn)，在醫(yī)療衛(wèi)生條件較差的國(guó)家和地區(qū)常呈爆發(fā)性流行。鞭毛、腹吸盤(pán)等與賈第蟲(chóng)感染過(guò)程密切相關(guān)，主要由細(xì)胞骨架構(gòu)成。而賈第素是賈第蟲(chóng)特有的骨架蛋白[2,3]，在致病過(guò)程中起著重要的作用，可分成α、β、γ、δ四大類(lèi)[4～6]，其中最大的一族是α賈第素。目前，大部分賈第素的定位已經(jīng)清楚，但每種α賈第素的具體功能尚未明晰[7]。

在生物體內(nèi)，任何一種細(xì)胞骨架蛋白需要與其他蛋白接觸聯(lián)合發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)相互作用的研究可以對(duì)生命活動(dòng)有更好的認(rèn)識(shí)。酵母雙雜交技術(shù)是近年來(lái)研究蛋白質(zhì)的一種重要方法[8]。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒，為α-4賈第素功能的研究提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 菌株和質(zhì)粒；pGBKT7質(zhì)粒購(gòu)自Clontech公司，大腸桿菌菌株XL1-Blue儲(chǔ)存于本實(shí)驗(yàn)室；Mate & PlateTM文庫(kù)構(gòu)建試劑盒購(gòu)自Clontech公司；DNA片段凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自百泰克公司； EcoRⅠ、T4 DNA連接酶，限制型內(nèi)切酶 NdeⅠ購(gòu)自NEB公司；瓊脂糖凝膠購(gòu)自BIOWEST公司；蛋白酶抑制劑cocktail、細(xì)胞裂解液、PMSF購(gòu)自生工生物公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體、低背景化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、小鼠抗c-Myc標(biāo)簽單克隆抗體購(gòu)自康為世紀(jì)公司；酵母提取物、胰化蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid公司；卡那霉素購(gòu)自Sigma公司；氯化鈣、無(wú)水乙醇等均購(gòu)于天津北科天津北科化學(xué)有限責(zé)任公司。自配試劑：LB培養(yǎng)基、PBS緩沖液、50×TAE電泳緩沖液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、4×SDS凝膠加樣緩沖液、4×轉(zhuǎn)移緩沖液。

1.2儀器 倒置顯微鏡CKX31、超凈工作臺(tái)ZHJH-C1112B、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)3K30、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)Heraeus X1R、恒溫水浴箱HH-W、CO2孵箱2406、低溫循環(huán)水浴、超微量核酸蛋白測(cè)定儀Scandrop2000、PCR擴(kuò)增儀T100、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-6C、凝膠成像系統(tǒng)92-1292、高壓蒸汽滅菌鍋SQ510C、氣浴振蕩搖床ZHWY-100D。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建 α-4克隆質(zhì)粒PGM-T-α-4和pGBKT7 載體經(jīng)EcoRⅠ和NdeⅠ酶切作用，酶切產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，利用DNA片段膠回收試劑盒，回收pGBKT7 載體和α-4 賈第素基因。α-4 賈第素基因與pGBKT7 載體在DNA連接酶作用下進(jìn)行重組。重組載體轉(zhuǎn)化XL1-blue感受態(tài)大腸桿菌。大腸桿菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，堿裂解法小量提取質(zhì)粒。

1.3.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和NdeⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物。獲得的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。正確重組質(zhì)粒命名為pGBKT7-α-4，其對(duì)應(yīng)的菌液繼續(xù)增菌培養(yǎng)，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒并純化、備用。

1.3.3α-4賈第素自激活實(shí)驗(yàn) pGBKT7-α-4質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化感受態(tài)的酵母細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子分成3份涂于不同平板上，1/3 涂在SD/-His/-Leu/-Trp，1/3 涂在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，最后1/3 涂在SD/-Leu/-Trp上。30℃培養(yǎng)3～5天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。缺陷性平板篩選轉(zhuǎn)化子。

1.3.4Western Blot 驗(yàn)證誘餌蛋白的表達(dá) pGBKT7-α-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母，經(jīng)培養(yǎng)后，裂解轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，收集裂解產(chǎn)物，其中包含裂解蛋白質(zhì)。Western blot檢測(cè)誘餌蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1α-4賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建 從α-4賈第素克隆載體pGM-T-α-4經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切下來(lái)的α-4賈第素全長(zhǎng)基因與pGBKT7載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切作用。電泳結(jié)果顯示，克隆1、2分別在約900bp出現(xiàn)了目的基因片段，在約7.3kb出現(xiàn)了pGBKT7載體片段，提示構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序，證實(shí)連入的確實(shí)為α-4賈第素基因，見(jiàn)圖1。

注：Marker：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：克隆1；2：克隆2

圖1重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和NdeⅠ酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離結(jié)果

2.2自激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將對(duì)照質(zhì)粒和重組質(zhì)粒小量轉(zhuǎn)化Y187，轉(zhuǎn)化子鋪板，3天后觀察。陽(yáng)性對(duì)照pCL1 在缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化酵母菌能夠生長(zhǎng)，見(jiàn)圖2。陽(yáng)性對(duì)照 (pGBKT7-53和pGADT7-T)，在缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化酵母菌均有克隆生長(zhǎng)，見(jiàn)圖3。陰性對(duì)照(pGBKT7)轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)；但在缺乏組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)平板上，基本上不生長(zhǎng)，見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)組 pGBKT7-α-4轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)；但在缺乏組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)平板上，基本上不生長(zhǎng)。說(shuō)明pGBKT7-α-4質(zhì)粒無(wú)自我激活作用，見(jiàn)圖5。

注：A：SD/-Leu；B：SD/-Leu/-His；C：SD/-Leu/-Ade

圖2在缺陷培養(yǎng)基上pCL1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌的成長(zhǎng)情況

注：A：SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade；B：SD/-Trp/-Leu

圖3陽(yáng)性對(duì)照(pGBKT7-53和pGADT7-T)共轉(zhuǎn)化酵母菌在缺陷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

注：A：SD/-Trp；B：SD/-Trp/-His；C：SD/-Trp/-Ade

圖4缺陷培養(yǎng)基上pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母菌的生長(zhǎng)情況

注：A：SD/-Trp；B：SD/-Trp/-His；C：SD/-Trp/-Ade

圖5重組載體pGBKT7-α-4的自激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3重組載體pGBKT7-α-4的表達(dá)情況鑒定 采用western blot鑒定pGBKT7-α-4在酵母菌中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在 52 KD 水平可檢測(cè)到α-4X融合C-Myc蛋白的表達(dá)?？蛰d體對(duì)照組可在20KD左右處檢測(cè)到C-Myc-Tag蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖6，證明重組載體表達(dá)良好。

圖6 Western blot鑒定pGBKT7-α-4在Y187酵母菌中的表達(dá)

3 討論

賈第素是賈第蟲(chóng)特有的骨架成分[2,3]，與賈第蟲(chóng)的致病性關(guān)系密切[9～12]。賈第素蛋白成員眾多，其中α賈第素家族是其中最大的一族，共有21個(gè)成員，其大部分成員的具體功能未知[7]。本研究主要探索α-4 賈第素的功能，以便了解賈第蟲(chóng)的致病機(jī)理。

酵母雙雜交技術(shù)是應(yīng)用較為廣泛的研究方法，在研究中具有很多的優(yōu)勢(shì)[13,14]，所以，在蛋白質(zhì)的研究[15～17]、基因的研究[18～20]、蛋白連鎖圖的建立[21,22]、藥物及其作用位點(diǎn)[23]、抗原抗體反應(yīng)[24]、病毒[25～27]、寄生蟲(chóng)[28]等的研究中被廣泛應(yīng)用。利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建和自激活功能的研究，為最終通過(guò)賈第素相互作用蛋白以證實(shí)賈第素功能的研究奠定基礎(chǔ)。

若要構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒，首先需要獲得α-4 賈第素基因與pGBKT7 載體。本研究利用α-4克隆質(zhì)粒PGM-T-α-4和pGBKT7 質(zhì)粒在雙酶切作用下分別獲得α-4 賈第素基因和 pGBKT7 載體編碼序列，并對(duì)其進(jìn)行回收。重組后，轉(zhuǎn)化XL1-blue 感受態(tài)大腸桿菌中。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、篩選、提取，獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，其正確性仍需進(jìn)行驗(yàn)證。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后電泳分離，從研究結(jié)果來(lái)看，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切電泳顯示，克隆1、2分別在約900bp出現(xiàn)了目的基因片段，在約7.3kb出現(xiàn)了pGBKT7載體片段，提示本次α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒構(gòu)建成功。為更進(jìn)一步精確驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，本研究還采用基因測(cè)序的方法，再次對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)測(cè)序證實(shí)連入的確實(shí)為α-4賈第素基因。含有pGBKT7-α-4質(zhì)粒的大腸桿菌繼續(xù)增菌培養(yǎng)，最后經(jīng)菌體破壞、收集、提取、純化獲得pGBKT7-α-4質(zhì)粒。

α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒是否能滿足實(shí)驗(yàn)要求，除質(zhì)粒構(gòu)建成功外，需進(jìn)行自激活能力的驗(yàn)證，以排除自激活帶來(lái)的假陽(yáng)性的發(fā)生[29]。除此之外，成功轉(zhuǎn)化的酵母菌株誘餌蛋白能夠正常表達(dá)。這兩個(gè)條件缺一不可。將對(duì)照質(zhì)粒和重組質(zhì)粒小量轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)種在缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

從培養(yǎng)結(jié)果可以看出，pCL1質(zhì)粒由于含有編碼亮氨酸(Leu)和野生型 GAL4的基因，因此不需要外界提供Leu、組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)，在相應(yīng)的缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化菌可以生長(zhǎng)。因此，在SD/-Leu，SD/-Leu/-His，SD/-Leu/-Ade 平板上，轉(zhuǎn)化酵母菌均有生長(zhǎng)，和預(yù)期一致。

在酵母細(xì)胞內(nèi)，pGBKT7-53可表達(dá)GAL4 BD domain和鼠p53的融合蛋白，pGADT7-T表達(dá)GAL4 AD domain和large T-antigen的融合蛋白，兩融合蛋白通過(guò)BD-AD相互結(jié)合，p53和SV40 large T-antigen發(fā)揮激活活性，報(bào)告基因表達(dá)組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)，接種到缺陷培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化菌可以生長(zhǎng)。從培養(yǎng)結(jié)果可以看出，在缺陷培養(yǎng)基上pGBKT7-53和pGADT7-T轉(zhuǎn)化酵母菌均能生長(zhǎng)，和預(yù)期一致。

pGBKT7 質(zhì)粒能夠表達(dá)色氨酸(Trp)，不能表達(dá)組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)。因此，不需要外界提供Trp，將轉(zhuǎn)化菌接種到缺Trp培養(yǎng)平板上，可以生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化菌接種到缺乏His或Ade的培養(yǎng)平板上，不能生長(zhǎng)。從培養(yǎng)結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)化酵母菌在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)；但在缺乏組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)平板上，基本不生長(zhǎng)，和預(yù)期一致。

實(shí)驗(yàn)組pGBKT7-α-4質(zhì)粒由于含有編碼色氨酸(Trp)的基因，不需要外界提供Trp，將轉(zhuǎn)化菌接種到缺乏Trp的培養(yǎng)平板上，可以生長(zhǎng)。若pGBKT7-α-4質(zhì)粒無(wú)自激活作用，則報(bào)告基因不會(huì)激活，也就不能表達(dá)組氨酸(His)或腺嘌呤(Ade)，在相應(yīng)缺陷培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化菌則不能生長(zhǎng)。因此，在SD/-Trp平板上，轉(zhuǎn)化酵母菌有生長(zhǎng)；而在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade平板上，轉(zhuǎn)化菌不能生長(zhǎng)。說(shuō)明pGBKT7-α-4質(zhì)粒無(wú)自我激活作用。

將α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的酵母菌株中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，進(jìn)行裂解，收集裂解產(chǎn)物。檢測(cè)誘餌蛋白的表達(dá)。經(jīng)證實(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別在52KD 、20KD水平檢測(cè)到α-4 融合 C-Myc蛋白和C-Myc-Tag蛋白的表達(dá)，證明重組載體表達(dá)良好。

通過(guò)本次研究，利用酶切作用對(duì)α-4克隆質(zhì)粒PGM-T-α-4和pGBKT7 質(zhì)粒進(jìn)行酶切獲得α-4 賈第素基因和 pGBKT7 載體片段，并利用DNA連接酶進(jìn)行基因重組，經(jīng)過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，最終成功構(gòu)建α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒。α-4 賈第素誘餌蛋白質(zhì)粒無(wú)自我激活作用；在酵母菌株中表達(dá)良好。為賈第素功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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(2017-09-16 收稿)(庫(kù)雪飛 編輯)

Constructionofα-4giardindecoyproteinparticles

LIUShaowei,WANGYang,TIANXifeng

(PathogenicBiology,CollegeofElementaryMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveConstruction ofα-4 giardin decoy protein particles.In order to study the function of giardin.MethodsThe α-4 giardin encoding sequence was obtained by double enzyme digestion from the α-4 giardin cloning vector pGM-T-α-4. Under the action of DNA ligase, the α-4 giardin coding sequence was combined with the yeast expression plasmid pGBKT7. The recombinant plasmid transformed the competent cells of escherichia coli by heat shock. Coli was cultured and screened.Finally,the plasmid was extracted by alkaline lysis and identified by enzyme digestion.The pGBKT7-α-4 decoy vector was obtained.In addition, the self activation capability of bait vector was verified,and the expression of bait protein was identified by wstern blot.ResultsThe pGBKT7-alpha-4 decoy vector was obtained by restriction enzyme digestion and sequencing.Transformants Y187 yeast cells could grow on SD/-Trp plates, but not on SD/-Trp/-His and SD/-Trp/-Ade plates. Therefore, there was no self activation of pGBKT7-α-4 plasmid.Western blot identification showed that the expression ofα-4 fusion C-Myc protein could be detected at the level of 52KD in pGBKT7-α-4 transformed yeast.ConclusionSuccessful construction of α-4 giardin decoy protein particles.The bait protein granules show no self activation and are well expressed in yeast strains.It lays a foundation for the study of giardin function.

α-4 giardin.Construction of bait protein particles.Yeast two hybrid

R 37

A

2095-2694(2017)06-421-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31471954)。

劉紹偉(1987- )，男，碩士研究生。研究方向：藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)α-4賈第素功能研究。

田喜鳳。