高遷移率族蛋白1在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用

熊婧，陳真真，張兆輝

高遷移率族蛋白1在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用

熊婧1，陳真真2，張兆輝1

目的：觀察高遷移率族蛋白1（HMGB1）在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的帕金森?。≒D）細(xì)胞模型中的作用，探討HMGB1在PD發(fā)病機(jī)制中的作用。方法使用魚(yú)藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞建立PD細(xì)胞模型；免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)HMGB1、α-synuclein及微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）的表達(dá)及定位；免疫印跡法檢測(cè)不同濃度魚(yú)藤酮作用下及siRNA-HMGB1干擾HMGB1后HMGB1、LC3II/I、自噬底物P62及Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)水平；通過(guò)雷帕霉素（Rap）和3-甲基腺嘌呤（3-MA）分別激活或抑制自噬，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HMGB1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果在PD細(xì)胞模型中，HMGB1出現(xiàn)胞漿轉(zhuǎn)位，并與胞漿中α-synuclein及LC3顆粒樣聚集物共定位；隨著魚(yú)藤酮濃度增加，HMGB1蛋白表達(dá)上調(diào)，伴有LC3II/I比例增高、P62及TLR4蛋白水平降低；Rap和3-MA分別激活或抑制自噬可引起HMGB1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相應(yīng)增加或降低；干擾HMGB1表達(dá)可抑制自噬的激活。結(jié)論胞漿轉(zhuǎn)位的HMGB1通過(guò)作用于自噬溶酶體途徑參與PD的發(fā)病，可能是PD治療的新靶點(diǎn)。

高遷移率族蛋白1；帕金森?。蛔允?；胞漿轉(zhuǎn)位

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是中老年常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，65歲以上人群中發(fā)病率達(dá)1%[1]，典型病理改變?yōu)楹谫|(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞丟失及殘存神經(jīng)元中路易小體形成。在PD患者尸檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)路易小體中存在高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）表達(dá)，并與路易小體的α-synuclein共定位[2]。研究還發(fā)現(xiàn)HMGB1可能參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及神經(jīng)退變過(guò)程[3]。筆者推測(cè)HMGB1可能參與了PD的發(fā)病過(guò)程。本研究將在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的體外多巴胺能細(xì)胞模型中探討HMGB1在PD發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SH-SY5Y）購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心；小鼠抗HMGB1抗體購(gòu)自Abcam公司，兔抗α-synuclein抗體及兔抗Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體購(gòu)自cell signal technology公司，兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3多克隆抗體（anti-LC3B）及兔抗P62多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗兔熒光二抗、羅丹明（Tritc）標(biāo)記羊抗小鼠二抗及Hoechst 33258染料購(gòu)自ProteinTech Group公司；siRNA-HMGB1干擾質(zhì)粒購(gòu)自吉?jiǎng)P基因公司；魚(yú)藤酮（Rotenone，Rot）、雷帕霉素（Rapamycin，Rap）、3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞置于含10%（體積分?jǐn)?shù)）滅活胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%～80%豐度時(shí)，0.25%胰酶消化傳代或用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SH-SY5Y細(xì)胞置于12孔板培養(yǎng)，生長(zhǎng)豐度至60%左右時(shí)轉(zhuǎn)染。將siRNA-HMGB1干擾質(zhì)粒與Lipofectamine 2000按2 μg/μL比例混合，制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合體，加入無(wú)血清培養(yǎng)基中與細(xì)胞共培養(yǎng)6 h后換用含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。之后加魚(yú)藤酮（2.5 μM）處理24 h后用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 免疫熒光染色 制備SH-SY5Y細(xì)胞爬片，魚(yú)藤酮（2.5 μM）處理24 h后，棄培養(yǎng)基，漂洗，4%多聚甲醛固定，破膜，5%BSA封閉，分別加入小鼠抗HMGB1（1:500），兔抗α-synuclein（1:200）抗體及兔抗LC3（1:200）抗體于4℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫后加入FITC標(biāo)記羊抗兔熒光二抗、Tritc標(biāo)記羊抗小鼠二抗37℃孵育1 h，Hoechst33258染色，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫印跡法檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞分別經(jīng)0.5 μM、1 μM、2.5 μM及5 μM魚(yú)藤酮作用24 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后置于冰上裂解30 min，4℃12000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，分別加入小鼠抗 HMGB1、兔抗 α-synuclein、兔抗 LC3、兔抗 P62及TLR4抗體4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h后顯色、曝光。轉(zhuǎn)染siRNA-HMGB1干擾質(zhì)粒后的SH-SY5Y細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，分別經(jīng)魚(yú)藤酮處理24 h，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，分別加入小鼠抗HMGB1、兔抗LC3抗體4℃孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h后顯色、曝光。

1.2.5 HMGB1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 分別使用100 nM的Rap（自噬增強(qiáng)劑）預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，5 mM的3-MA（自噬抑制劑）預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞2 h，然后加入魚(yú)藤酮（2.5 μM）作用 24 h，Trizol法提取SHSY5Y細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR后行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HMGB1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 魚(yú)藤酮誘導(dǎo)HMGB1胞漿轉(zhuǎn)位，并與α-synuclein共定位

在對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞中，HMGB1均勻分布于細(xì)胞核，胞漿中未見(jiàn)α-synuclein聚集顆粒。魚(yú)藤酮 2.5 μM處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，細(xì)胞核中HMGB1表達(dá)增加，同時(shí)胞漿中可見(jiàn)HMGB1及α-synuclein顆粒狀聚集物，部分HMGB1及α-synuclein顆粒狀聚集物共定位，見(jiàn)圖1。

2.2 魚(yú)藤酮誘導(dǎo)HMGB1胞漿轉(zhuǎn)位，并與LC3共定位

魚(yú)藤酮2.5 μM處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，LC3在胞漿中形成散在顆粒樣聚集體，提示自噬體形成，同時(shí)看到胞漿中也出現(xiàn)HMGB1顆粒樣聚集物，并有部分HMGB1及LC3顆粒狀聚集物共定位；對(duì)照組細(xì)胞中LC3均勻分布于細(xì)胞中，HMGB1均一分布于細(xì)胞核中。

2.3 魚(yú)藤酮誘導(dǎo)HMGB1、LC3及TLR4表達(dá)改變

不同濃度的魚(yú)藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h，隨著藥物濃度的增加，HMGB1的表達(dá)增加，自噬分子LC3II/LC3I的比例增加，自噬底物P62的含量減少，提示自噬途徑激活，而HMGB1下游的炎癥因子TLR4表達(dá)降低，見(jiàn)圖3。

2.4 魚(yú)藤酮模型中HMGB1與自噬的相互作用

魚(yú)藤酮2.5 μM處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，HMGB1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加，Rap（100 nM）預(yù)處理24 h激活自噬途徑后，細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組增高；3-MA（5 mM）預(yù)處理2 h抑制自噬途徑后，HMGB1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組減少，見(jiàn)圖4A。魚(yú)藤酮2.5 μM作用于細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)LC3II/LC3I比例較對(duì)照組增高，提示自噬激活，但通過(guò)siRNAHMGB1干擾HMGB1表達(dá)后，魚(yú)藤酮作用于細(xì)胞將不引起LC3II/LC3I比例改變，見(jiàn)圖4B1-B2。

3 討論

遺傳基因突變、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)異常聚集、自噬/泛素蛋白酶體功能障礙及炎癥反應(yīng)等均與PD的發(fā)病密切相關(guān)。尋找在上述途經(jīng)中發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子并加以干預(yù)將為PD的治療提供重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型中可以由細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)位，與Lewy小體中的關(guān)鍵蛋白α-synuclein和自噬標(biāo)志蛋白LC3共定位，且HMGB1與自噬途徑有直接關(guān)系，激活自噬時(shí)伴有HMGB1表達(dá)增加，抑制自噬時(shí)伴有HMGB1表達(dá)減少，而干擾HMGB1的表達(dá)則會(huì)抑制自噬途徑的激活，提示HMGB1可能通過(guò)影響自噬溶酶體途徑而干擾αsynuclein的降解，從而參與PD的發(fā)病。

圖1 魚(yú)藤酮處理24 h后HMGB1及α-synuclein的表達(dá)情況（×400）

圖2 魚(yú)藤酮處理24h后HMGB1及LC3的表達(dá)情況（×400）

圖3 不同濃度魚(yú)藤酮作用后對(duì)HMGB1、LC3、P62、TLR4蛋白表達(dá)水平的影響

HMGB1是一種高度保守的非組蛋白的染色體結(jié)合蛋白，主要存在于真核細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，參與DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)[4]，也可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，作為信號(hào)分子，參與細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化[5,6]；HMGB1也是氧化應(yīng)激的一個(gè)重要效應(yīng)分子，可能與缺血再灌注損傷[7]、動(dòng)脈粥樣硬化及衰老等密切相關(guān)[8]；在氧化應(yīng)激刺激下，HMGB1會(huì)與胞漿內(nèi)Beclin1結(jié)合使Beclin1-Bcl-2復(fù)合體解聚，啟動(dòng)自噬溶酶體途徑應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激損害[9]；體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胞漿外的HMGB1會(huì)持續(xù)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎性物質(zhì)及引起氧化應(yīng)激，使得與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡[10]；此外，HMGB1在線粒體功能異常時(shí)也能調(diào)節(jié)線粒體自噬，保護(hù)細(xì)胞功能[11]。以上提示HMGB1與PD發(fā)病機(jī)制中的多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)。

此外，有證據(jù)顯示HMGB1也參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病。如在阿爾茨海默病的細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，HMGB1與β淀粉樣蛋白結(jié)合，影響小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)β淀粉樣蛋白的清除[12]；在亨廷頓病和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)HMGB1與疾病標(biāo)志性蛋白huntingtin及ataxin-1存在相互作用并導(dǎo)致可溶性HMGB1蛋白的減少[13]；PD患者尸檢中也發(fā)現(xiàn)，其腦組織黑質(zhì)區(qū)路易小體中也存在HMGB1與α-synuclein的共定位，并且在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)HMGB1與聚集狀態(tài)的α-synuclein具有高親合力[2]。本研究也證實(shí)了HMGB1在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD體外模型中可以出現(xiàn)胞漿轉(zhuǎn)位，并與α-synuclein共定位，提示HMGB1可能與細(xì)胞內(nèi)異常蛋白如αsynuclein的聚集及路易小體的形成有關(guān)。

圖4 魚(yú)藤酮模型中干擾自噬對(duì)HMGB1轉(zhuǎn)錄的影響及抑制HMGB1對(duì)自噬途徑激活的影響

細(xì)胞內(nèi)異常蛋白主要是通過(guò)自噬溶酶體途徑及泛素蛋白酶體途徑降解。本研究中也發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中觀察到胞漿轉(zhuǎn)位的HMGB1與自噬標(biāo)志蛋白LC3存在共定位，并且隨著魚(yú)藤酮濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)HMGB1表達(dá)增加，同時(shí)自噬標(biāo)志分子LC3II/I的比值升高、自噬的降解底物P62表達(dá)減少，提示自噬途徑激活。使用自噬抑制劑3-MA處理后，細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，而使用自噬激活劑雷帕霉素處理后，細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平增高，干擾HMGB1的表達(dá)也抑制了細(xì)胞內(nèi)自噬途徑的激活。Tang D等[9]在饑餓或雷帕霉素誘導(dǎo)的鼠胚胎成纖維細(xì)胞及某些腫瘤細(xì)胞系的自噬激活過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)存在HMGB1向胞漿轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)自噬的活性。因此推測(cè)HMGB1可能通過(guò)胞漿轉(zhuǎn)位調(diào)解PD的自噬活性。

HMGB1也是重要的炎癥介質(zhì)，PD的發(fā)病與炎癥反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)，研究認(rèn)為，HMGB1可以通過(guò)激活TLR4等下游通路，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)及神經(jīng)炎癥反應(yīng)的激活，誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡[10]。本研究中觀察到HMGB1表達(dá)增加的同時(shí)不伴有下游炎癥受體TLR4的表達(dá)上調(diào)，反而有下降趨勢(shì)，提示在此過(guò)程中HMGB1沒(méi)有導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的激活，而主要通過(guò)調(diào)節(jié)自噬溶酶體途徑影響異常蛋白的降解，參與PD發(fā)病。

綜上所述，HMGB1是PD發(fā)病中的重要分子，可能通過(guò)胞漿轉(zhuǎn)位參與自噬溶酶體途徑而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而具體的相關(guān)作用機(jī)制還需進(jìn)一步探明。

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The Role of High Mobility Group Box 1 in Dopaminergic Neuronal Damage Induced by Rote?none

XIONG Jing1,CHEN Zhen-zhen2,ZHANG Zhao-hui1.1.Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;2.Department of Neurology,The Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430020,China

Objective:To identify the role of high mobility group box 1(HMGB1)in dopaminergic neuronal damage induced by rotenone.Methods:SH-SY5Y cells were treated with rotenone with different concentration to make cell model of Parkinson’s disease(PD).The expression and location of HMGB1,α-synuclein and LC3 were analyzed by immnofluorescence staining.The protein expression of HMGB1,LC3II/I,P62 and TLR4 were assessed by western blot.Activated or inhibited autophagy by rapamycin or 3-MA,the transcription level of HMGB1 mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.Results:HMGB1 translocated in cytoplasm and colocalized with α-synuclein and LC3 in PD cells,accompanied by enhanced autophagy.Increased autophagosomes of autophagy directly increased the expression of HMGB1.Knocked down HMGB1 expression using RNA interferenc inhibited the intracellular activation of autophagy pathway.Conclusion:HMGB1 cytoplasmic translocation is involved in the activation of autophagy in PD,which may be a novel therapeutic target for PD.

high mobility group box 1;Parkinson’s disease;autophagy;cytoplasmic translocation

R741；R741.02；R742

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.002

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科武漢430060 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430020

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（No.81501107）

2017-09-06

張兆輝zhzhqing1990@163.com

（本文編輯：唐穎馨）