不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳能力的影響

古麗娜·巴克，迪麗胡瑪·吐?tīng)栠d，阿拉努爾·庫(kù)爾班，馬爾哈巴·帕爾哈提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳能力的影響

古麗娜·巴克，迪麗胡瑪·吐?tīng)栠d，阿拉努爾·庫(kù)爾班，馬爾哈巴·帕爾哈提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

【目的】用植物雌激素亞麻籽木脂素（SDG）處理奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞，觀察SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳能力的影響。【方法】將用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，即0 μg/mL的SDG組和添加1、10、50、100、150、200 μg/mL SDG的試驗(yàn)組，分別處理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖能力及活力以及奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白分泌情況?！窘Y(jié)果】不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞均有提高增殖能力及活力的作用，且添加不同劑量的SDG均具有促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌β-酪蛋白作用，且呈明顯的劑量依賴(lài)性?！窘Y(jié)論】濃度為150 μg/mL的SDG培養(yǎng)奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞48 h，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖能力與活力以及分泌β-酪蛋白的效果最好。

SDG；乳腺上皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞活力；泌乳性能

植物雌激素（Phytoestrogen，PE）是一類(lèi)來(lái)源于植物的具有類(lèi)雌激素活性的非甾族雜環(huán)多酚類(lèi)化合物。因植物雌激素的雜環(huán)多酚母核與內(nèi)源雌激素的甾體結(jié)構(gòu)相似，可與雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）結(jié)合，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[1]。目前研究較深入的植物雌激素主要有異黃酮類(lèi)（Isoflavones）、木脂素類(lèi)（Lignans）、二苯乙烯類(lèi)（Stibenes）、香豆雌酚類(lèi)（Coumestans）和真菌類(lèi)（Mycoestrogen）等[2]。研究報(bào)道，亞麻籽中富含木脂素[3,4]，而亞麻籽木脂素（SDG）也是一種具有雌激素樣活性的物質(zhì)[1,2]，能促進(jìn)大鼠乳腺發(fā)育并提高產(chǎn)奶量[5,6]。近年來(lái)，利用激素調(diào)控奶牛乳腺細(xì)胞的增殖已成為科研人員研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。然而，目前SDG在乳腺細(xì)胞方面的研究主要集中在動(dòng)物模型大小白鼠上，而截止目前為止，SDG在奶牛乳腺細(xì)胞方面的研究幾乎空白。因此，本研究以體外培養(yǎng)泌乳期奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和分化效果，為今后SDG在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購(gòu)于Gibco公司產(chǎn)品；β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和乳糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司；其他常規(guī)試驗(yàn)藥品及試劑為國(guó)產(chǎn)。

SDG（含量40%）購(gòu)自陜西錦泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

P1201高效液相色譜儀（中國(guó)遼寧）；QP-80型CO2培養(yǎng)箱（國(guó)產(chǎn)）；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀（美國(guó)Thermo electron公司）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；DFC280倒置相差顯微鏡（德國(guó)LEICA）；Model DT CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（CASY，德國(guó)）。

1.3 乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

將奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞稀釋至1×105/mL并接種于培養(yǎng)瓶，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，之后換1次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%即可開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將1.3中培養(yǎng)好的奶牛乳腺上皮細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，之后將每3孔設(shè)為一組進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，即對(duì)照組添加0 μg/mL SDG，試驗(yàn)組分別添加1、10、50、100、150、200 μg/mL SDG組。分別處理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

試驗(yàn)方法參考[7-9]。

（1）將乳腺細(xì)胞懸液200 μL以1×105/mL接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，去除96孔板加入20 μL/孔MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；

（2）去除96孔板，并輕輕吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL/孔DMSO液，在室溫條件下，將96孔板置于震蕩器上震蕩10 min至藍(lán)紫色結(jié)晶物充分溶解；

（3）全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀設(shè)定波長(zhǎng)為490 nm用于檢測(cè)各孔OD值。

1.6 CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞增殖能力與活力

重新在6孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1×105/mL的密度乳腺上皮細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后用無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再進(jìn)行分組試驗(yàn)。試驗(yàn)分組情況同1.4。分別收取處理24 h、48 h、72 h后的各組細(xì)胞樣品，用Model DT CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞增殖能力與活力。

1.7 乳蛋白的測(cè)定

乳蛋白的測(cè)定方法參考[10]。

β-酪蛋白的含量采用高效液相色譜測(cè)定（HPLC）。HPLC的檢測(cè)條件：Φ7.8 mm×300 mm的TSK凝膠柱、室溫、280 nm波長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)0.22 μm無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾超聲脫氣的超純水、0.60 mL/min的流速、10 μL的進(jìn)樣體積作為流動(dòng)相。用0.22 μm無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾超聲脫氣的超純水溶解β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，分別按照1、5、10、15、20 mg/mL的濃度進(jìn)樣，以β-酪蛋白濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。分別收集已處理48 h的乳腺細(xì)胞培養(yǎng)液，液相色譜檢測(cè)β-酪蛋白含量。設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法測(cè)定不同濃度SDG培養(yǎng)液處理奶牛乳腺細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

表1、圖1顯示：與對(duì)照組（0 μg/mL）相比，1 μg/mL的SDG無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基乳腺細(xì)胞，不同時(shí)間段增值效果差異均不顯著（P＞0.01）；10 μg/mL的SDG血清DMEM/F12培養(yǎng)基乳腺細(xì)胞12、24、72 h，與對(duì)照組比較各組乳腺細(xì)胞的增值效果差異均極顯著（P＜0.01），而48 h各組乳腺細(xì)胞的增值效果差異顯著（P＜0.05）；50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL的SDG無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基乳腺細(xì)胞，與對(duì)照組比較各組乳腺細(xì)胞的增值差異均極顯著（P＜0.01）；且48 h 150 μg/mL的SDG組乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)最好。

圖1 不同濃度SDG培養(yǎng)液處理乳腺細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.2 CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖能力及活力的影響

由表2得知，隨著添加的SDG濃度的增高，細(xì)胞的增殖能力與活力均得到明顯的提高，尤其是當(dāng)培養(yǎng)液中添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時(shí)，細(xì)胞的增殖能力與活力均顯著提高（P＜0.05），且有一定的劑量依賴(lài)性，除去SDG濃度為150、200 μg/mL之間外，其他各組間均差異顯著（P＜0.05）；且從結(jié)果也可以看出，培養(yǎng)液中SDG的添加濃度為150 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的增殖能力與活力為最好。

表2 不同濃度SDG培養(yǎng)液處理乳腺細(xì)胞48 h對(duì)細(xì)胞增殖能力及活力的影響（OD490nm，n=3）

2.3 SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白分泌情況的影響

2.3.1 β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

將β-酪蛋白濃度設(shè)定為橫坐標(biāo)，峰面積設(shè)定為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得回歸方程。在1～20 μg/mL的范圍內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣，R2均在0.9996。

圖2 β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3.2 不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白分泌的影響

由表3可知，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時(shí)，細(xì)胞分泌β-酪蛋白的量較對(duì)照組分別顯著提高了3.50%、6.74%、9.16%、8.36%（P＜0.05），且各組間差異顯著（P＜0.05）；而添加濃度為1、10 μg/mL時(shí)，細(xì)胞分泌的β-酪蛋白與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；且當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中SDG的添加量為150 μg/mL時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞分泌的β-酪蛋白的效果最好。

表3 不同濃度SDG對(duì)乳腺上皮細(xì)胞分泌β-酪蛋白的影響（n=3）

3 討論

3.1 不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞增殖與活力的影響

植物雌激素的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源雌激素的甾體結(jié)構(gòu)相似，可與雌激素受體結(jié)合，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[1]，亞麻籽木脂素是植物雌激素的一種，能與乳腺細(xì)胞ER結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-生長(zhǎng)激素軸或催乳素軸來(lái)分泌GH和PRL，從而調(diào)控乳腺發(fā)育[11-15]。穆瑩等[10]研究報(bào)道，乳腺上皮細(xì)胞中加入不同濃度植物雌激素大豆黃酮培養(yǎng)24 h可一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖；歐陽(yáng)五慶等[16]試驗(yàn)報(bào)道，植物雌激素大豆黃酮能促進(jìn)大鼠乳腺上皮細(xì)胞的增殖；而劉春龍[17]發(fā)現(xiàn)，植物雌激素大豆黃酮能加速奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。在本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)液中添加50、100、150、200 μg/mL濃度植物雌激素亞麻籽木脂素（SDG）時(shí)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖能力與活力均顯著高于0 μg/mL的對(duì)照組（P＜0.05）。可能的機(jī)制是：SDG通過(guò)作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞上的ER，并與之結(jié)合，產(chǎn)生一定的雌激素效應(yīng)，作用于乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增值與分化。

3.2 不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白分泌的影響

β-酪蛋白是檢測(cè)奶牛乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，牛乳中β-酪蛋白含量高牛乳質(zhì)量好，反之牛乳質(zhì)量差。β-酪蛋白的分泌受多重因素的調(diào)控，而內(nèi)分泌激素是重要的調(diào)控因子。Akers[18]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺上皮細(xì)胞中添加17β-雌二醇可以顯著增加催乳素誘導(dǎo)的α-乳白蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時(shí)，細(xì)胞分泌β-酪蛋白的量顯著提高，表明一定濃度的SDG具有增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成β-酪蛋白的能力。這一結(jié)果也為今后SDG的功能研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

MTT法測(cè)定不同濃度SDG處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞時(shí)，SDG具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，且最佳作用時(shí)間為48 h和最佳濃度為150 μg/mL；

用CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)不同濃度SDG對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖能力及活力，發(fā)現(xiàn)SDG的添加濃度為150 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的增殖能力與活力為最好；

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時(shí)，細(xì)胞分泌β-酪蛋白的量顯著提高，且呈明顯的劑量依賴(lài)性，且SDG的添加量為150 μg/mL時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞分泌的β-酪蛋白的效果最好。

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Effects of Different Concentrations of SDG on the Mammary Gland Epithelial Cells Proliferation and Lactating Capacity in Cow

GULIA·Bake，DILIHUMA·Tursun，AILANUER·Kurba，MAIERHABA·Parhat
（College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

s：The effects of different concentrations of flaxseed lignans（SDG）on the mammary gland epithelial cells proliferation and lactating capacity was investigated.DMEM/F12free serum culture medium added 1，10，50，100，150，200 μg/mL SDG were using primary mammary epithelial cells culture.After culture 0 h，12 h，24 h，48 h and 72 h，detection of proliferation and beta casein secretion.The result show that treatment with all concentrations of SDG can promote the proliferation and beta casein secretion of bovine mammary epithelial cells.For primary mammary epithelial cells，using the culture medium added 150 μg/mL SDG and cultured after 48 h culture is potent for cell proliferation and beta casein secretion.

SDG；mammary gland epithelial cells；cell proliferation;cell viability；lactation capacity

S823.9+1

A

1003-6377（2017）06-0005-06

新疆少數(shù)民族科技人才特殊培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目“亞麻籽木脂素對(duì)奶牛乳腺發(fā)育影響極其作用機(jī)理研究”（201523127）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“亞麻籽木脂素的雌激素樣活性研究”（220141063）

古麗娜·巴克（1976-），女（維吾爾族）,新疆阿克蘇人，講師，博士。E-mail：gulnar@xjau.edu.cn

2017-09-16，

2017-09-28

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.06.002