共生菌Arsenophonus、水稻品種和溫度對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響

朱歡歡 陳洋 萬(wàn)品俊 王渭霞 賴?guó)P香 傅強(qiáng)

(中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006；*通訊聯(lián)系人，E-mail: fuqiang@caas.cn)

共生菌Arsenophonus、水稻品種和溫度對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響

朱歡歡 陳洋 萬(wàn)品俊 王渭霞 賴?guó)P香 傅強(qiáng)*

(中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006；*通訊聯(lián)系人，E-mail: fuqiang@caas.cn)

【目的】研究共生菌 Arsenophonus、水稻和溫度對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響，揭示影響褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病的重要因子?！痉椒ā客ㄟ^(guò)共生菌Arsenophonus（感染和未感染）與水稻品種（TN1、IR56和Mudgo）以及 Arsenophonus與溫度（21℃、23℃、25℃、27℃、29℃和 31℃）兩個(gè)二因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，觀察噴黃綠綠僵菌孢子懸浮液后不同時(shí)間褐飛虱黃綠綠僵菌的發(fā)病率。【結(jié)果】噴黃綠綠僵菌孢子懸浮液后，不同水稻品種上褐飛虱發(fā)病率均以含Arsenophonus的試蟲較低，而不同溫度下的褐飛虱發(fā)病率則僅噴菌處理后第3 d和5 d時(shí)在25℃、27℃和29℃時(shí)含Arsenophonus的試蟲發(fā)病率顯著較低，其他溫度下無(wú)顯著差異。雙因素方差結(jié)果表明，Arsenophonus與水稻品種雙因素試驗(yàn)中均以含 Arsenophonus褐飛虱黃綠綠僵菌的發(fā)病率顯著較低，而Arsenophonus與溫度雙因素試驗(yàn)中僅在噴菌處理后第3 d、5 d以含Arsenophonus褐飛虱黃綠綠僵菌的發(fā)病率顯著較低。溫度顯著影響褐飛虱的發(fā)病率，23℃～29℃條件下褐飛虱的發(fā)病率較高，LT50較短，為黃綠綠僵菌侵染褐飛虱的適溫范圍。其中，27℃時(shí)發(fā)病率最高，LT50最短，最為適宜；31℃和21℃條件下褐飛虱發(fā)病率較低，LT50較長(zhǎng)，不利于黃綠綠僵菌對(duì)褐飛虱的侵染。溫度還影響含Arsenophonus與不含Arsenophonus試蟲LT50的相對(duì)大小。其中，含Arsenophonus試蟲LT50在27℃、29℃時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，在其他溫度下則相同甚至較短?！窘Y(jié)論】共生菌Arsenophonus顯著抑制黃綠綠僵菌對(duì)褐飛虱的致病力，且該作用受到溫度的顯著影響；溫度亦顯著影響褐飛虱的黃綠綠僵菌發(fā)病率，而水稻品種以及Arsenophonus和水稻品種間、Arsenophonus和環(huán)境溫度間的交互作用均無(wú)顯著影響。

褐飛虱；黃綠綠僵菌；Arsenophonus；溫度；水稻品種

褐飛虱[Nilaparvata lugens (St?l)]屬于半翅目飛虱科(Hemiptera: Delphacidae)，是我國(guó)及南亞、東南亞國(guó)家水稻上的主要害蟲[1]；主要通過(guò)口針吸食水稻莖稈韌皮部的液汁為害，消耗稻株水分和養(yǎng)分，造成谷粒灌漿不飽滿，千粒重下降，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，田間形成“虱燒”；還可以傳播水稻草狀矮縮病(Rice grassy stunt virus，RGSV)和齒葉矮縮病(Rice ragged stunt virus，RRSV)等病毒，間接對(duì)稻株造成危害[2-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)自20世紀(jì)80年代以來(lái)，褐飛虱的發(fā)生面積約占水稻種植面積的50%，年均損失稻谷仍達(dá)10億～15億kg[1]，亞洲范圍內(nèi)每年由褐飛虱引起的水稻產(chǎn)量的損失高達(dá)3億美元[5]。

目前，化學(xué)殺蟲劑是防治褐飛虱的主要手段。然而，由于化學(xué)殺蟲劑的長(zhǎng)期、大量、不合理使用，導(dǎo)致褐飛虱對(duì)吡蟲啉、噻嗪酮等生產(chǎn)上常用殺蟲劑產(chǎn)生了高抗藥性[5-7]，進(jìn)一步加劇農(nóng)藥的過(guò)量使用。利用病原微生物是減少褐飛虱防控對(duì)化學(xué)農(nóng)藥依賴程度的重要手段之一。

黃綠綠僵菌(Metarhizium flavoviride Gams amp;Rozsypal)是一類重要的稻飛虱病原真菌[8-10]。環(huán)境溫度及寄主昆蟲褐飛虱自身生理狀況是影響綠僵菌致病力的重要因素，但有關(guān)的研究不多。關(guān)于環(huán)境溫度的影響主要為溫度對(duì)綠僵菌菌株生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的影響。常金梅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，綠僵菌MC3在23℃～26℃時(shí)，隨著溫度的升高，生長(zhǎng)速度顯著加快；岳梅等[12]報(bào)道綠僵菌LA菌株在前12 h孢子萌發(fā)速率從高到低為30℃＞35℃＞25℃＞20℃＞40℃，24 h內(nèi)20℃～35℃下孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上，而40℃下無(wú)萌發(fā)現(xiàn)象；李佳穎等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃綠綠僵菌SM076在17℃～32℃溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，26℃下菌落生長(zhǎng)速率最快，孢子萌發(fā)率最高，而23℃左右則最適產(chǎn)孢。關(guān)于綠僵菌對(duì)稻飛虱的侵染致病溫度條件的研究較少。杜光祖等[14]指出，24℃～30℃下，黃綠綠僵菌對(duì)灰飛虱3齡若蟲均有致病力，其中，27℃和30℃下的致病力較強(qiáng)。

褐飛虱自身生理狀況的影響則主要集中在褐飛虱的齡期及所含共生菌的研究。耿博聞等[15]指出黃綠綠僵菌對(duì)不同發(fā)育階段褐飛虱的毒力不同，其毒力順序?yàn)槌上x期＞高齡若蟲期＞低齡若蟲期，對(duì)成蟲的LT50為5.66 d；李茂業(yè)等[16]報(bào)道，黃綠綠僵菌Mf82對(duì)褐飛虱除2齡若蟲以外的其余各個(gè)蟲態(tài)的累積死亡率均大于50%，其中褐飛虱成蟲的致死率可達(dá)85.7%。類似地，杜光祖等[14]發(fā)現(xiàn)黃綠綠僵菌KM1104對(duì)灰飛虱成蟲的致病力高于3齡若蟲。陳宇等[17]則報(bào)道含有Arsenophonus類共生細(xì)菌的褐飛虱對(duì)黃綠綠僵菌的抵抗能力顯著提高。

Arsenophonus是褐飛虱體內(nèi)的一類非專性內(nèi)生共生細(xì)菌，屬于變形菌門(Proteobacteria)γ亞類腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，由母體垂直傳遞給子代[18]，其提高褐飛虱對(duì)黃綠綠僵菌抵抗力的作用是否受到環(huán)境溫度的影響尚不清楚。此外，采用水稻抗性品種是防治褐飛虱的經(jīng)濟(jì)有效措施[19]，不利于褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育或繁殖，是否會(huì)進(jìn)而使Arsenophonus對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌致病力的影響發(fā)生變化，這亦是一個(gè)值得關(guān)注的重要問(wèn)題。為此，本研究擬通過(guò)兩個(gè)雙因素實(shí)驗(yàn)開展兩方面的研究：1)共生菌Arsenophonus與水稻品種(TN1、IR56和Mudgo)對(duì)黃綠綠僵菌致病褐飛虱的影響；2)Arsenophonus和溫度(21℃、23℃、25℃、27℃、29℃和31℃)對(duì)綠僵菌侵染褐飛虱的影響。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試?yán)ハx：褐飛虱采自浙江富陽(yáng)田間，參照王渭霞等[18]的方法篩選出含Arsenophonus和不含Arsenophonus的兩個(gè)褐飛虱種群，用TN1稻苗室內(nèi)飼養(yǎng)。羽化24 h內(nèi)的雌成蟲用于本研究。

供試菌株：采自浙江富陽(yáng)稻田的褐飛虱罹病蟲體。參照吳發(fā)紅等[21]的方法進(jìn)行分離及鑒定，確定為黃綠綠僵菌ARSEF 1764。其孢子懸浮液的配制步驟如下：將黃綠綠僵菌接(平行劃線)到PDA培養(yǎng)基平板上，在(25±1)℃下黑暗培養(yǎng)10 d。待菌株充分產(chǎn)孢后，用滅菌過(guò)的接種環(huán)輕輕將該菌株的分生孢子粉刮到盛有10 mL 0.05% Tween-20濕潤(rùn)劑的三角瓶中，在渦旋混合器上充分振蕩30 min，無(wú)菌紗布過(guò)濾菌液，獲得孢子懸浮液母液。用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每mL母液的分生孢子含量，然后配制成1.0×108個(gè)/mL的孢子懸浮液，備用。

1.2共生菌Arsenophonus和水稻品種對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響

取含Arsenophonus和不含Arsenophonus共生菌的褐飛虱初羽化雌成蟲，噴5 mL的黃綠綠僵菌孢子懸浮液后分別轉(zhuǎn)移至TN1、Mudgo和IR56稻苗上籠罩飼養(yǎng)，以噴5 mL 0.05% Tween-20為對(duì)照，共12個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次。每個(gè)重復(fù)接蟲40頭。黃綠綠僵菌孢子懸浮液或Tween-20均勻噴至稻苗與試蟲體表。處理后置于溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度(85±5)%和光周期14 L/10 D的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。

處理后第1天去除死蟲，將剩余活蟲作為基數(shù)從噴菌后第3天開始觀察褐飛虱的死亡情況，隔日觀察至處理后第9天。每次檢查后移出死蟲，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中繼續(xù)保濕培養(yǎng)，3 d后記錄各重復(fù)的發(fā)病蟲數(shù)(包括體表長(zhǎng)出黃綠綠僵菌菌絲的僵蟲及經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的未長(zhǎng)出菌絲的死蟲)，計(jì)算各處理的發(fā)病率。若未噴綠僵菌的試蟲出現(xiàn)病蟲，則并以同次觀察的同一品種上同類試蟲的Tween-20對(duì)照為參照計(jì)算校正發(fā)病率。其中死蟲黃綠綠僵菌的PCR檢測(cè)參照吳發(fā)紅等[21]的方法；校正發(fā)病率按校正發(fā)病率(%)= (處理組發(fā)病率－對(duì)照組發(fā)病率)/(1－對(duì)照組發(fā)病率)×100計(jì)算。

1.3共生菌Arsenophonus和不同溫度對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響

取含Arsenophonus或不含Arsenophonus的褐飛虱初羽化雌成蟲，經(jīng)黃綠綠僵菌噴菌處理后接到TN1稻苗上，以0.05% Tween-20為對(duì)照。試驗(yàn)在不同溫度(21℃、23℃、25℃、27℃、29℃和31℃)的培養(yǎng)箱(相對(duì)濕度 85%±5%、光周期14 L/10 D)中進(jìn)行。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)接蟲40頭。

處理后第2 d開始，每日觀察褐飛虱的死亡情況直至試蟲全部死亡，并按“1.2”的方法觀察病蟲，計(jì)算發(fā)病率和校正發(fā)病率。

小孫啊，你不要緊張，我找你來(lái)隨便聊聊。前天下午，我收到你夫人趙穎春給我寫的一封信……周書記說(shuō)到這里故意停頓了一下，而我的頭已經(jīng)大了，心里罵道，這個(gè)該死的臭婆娘，嘴里卻趕緊說(shuō)，周書記，對(duì)不起，穎春她不懂事……

1.4統(tǒng)計(jì)分析

利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件(V14.10)[22]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。處理后各個(gè)時(shí)間同一品種或同一溫度下含Arsenophonus與不含Arsenophonus試蟲發(fā)病率間的單因素比較采用兩樣本率比較法進(jìn)行。Arsenophonus與水稻品種或環(huán)境溫度的雙因素方差分析則采用二因素完全隨機(jī)區(qū)組模塊，百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析前反正弦平方根轉(zhuǎn)換；各因素內(nèi)不同處理間采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。不同溫度處理下的致死中時(shí)間(LT50)計(jì)算則采用死亡率-時(shí)間機(jī)率值分析模塊進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1共生菌Arsenophonus和水稻品種對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響

黃綠綠僵菌處理后，各水稻品種上含Arsenophonus與不含Arsenophonus褐飛虱的發(fā)病率均以含Arsenophonus的試蟲為低，無(wú)一例外，且除TN1上處理9 d后未達(dá)顯著水平，TN1上處理后3 d和Mudgo上處理后7 d僅達(dá)0.10顯著水平外，其余均達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)或極顯著水平(P＜0.01)(圖1)。

不噴菌試蟲的發(fā)病率均為零，我們以噴菌試蟲的發(fā)病率進(jìn)行共生菌Arsenophonus與水稻品種的雙因素方差分析，結(jié)果表明，處理后3～9 d，Arsenophonus對(duì)褐飛虱發(fā)病率有顯著影響(P＜0.05)，且均以含Arsenophonus的褐飛虱發(fā)病率顯著低于不含Arsenophonus的褐飛虱(圖2)；而水稻品種及其與共生菌的交互作用對(duì)發(fā)病率均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。顯然，Arsenophonus降低了褐飛虱對(duì)黃綠綠僵菌的感染率，而水稻品種的抗性及其與Arsenophonus的交互作用對(duì)褐飛虱綠僵菌感染率無(wú)顯著影響。

從圖2還可以看出黃綠綠僵菌處理后褐飛虱發(fā)病率的時(shí)間動(dòng)態(tài)，處理后第3天發(fā)病率較低，之后迅速上升，至第7天趨于穩(wěn)定。

2.2共生菌Arsenophonus和溫度對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響結(jié)果

黃綠綠僵菌處理后，6個(gè)溫度條件下，含Arsenophonus與不含Arsenophonus褐飛虱發(fā)病率的差異在21℃、23℃、31℃下各觀察時(shí)間均不顯著(P＞0.05)；而在25℃、27℃和29℃下，僅噴菌處理后3 d和5 d時(shí)差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)，且均以含Arsenophonus的試蟲發(fā)病率較低，但處理后7 d、第9 d這種差異縮小，未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)(圖3)，表明Arsenophonus對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率有抑制作用，且該作用受到溫度的顯著影響。

不噴黃綠綠僵菌時(shí)，有超過(guò)半數(shù)的對(duì)照(56.3%)出現(xiàn)0.8%～4.9%的發(fā)病率，因此以校正發(fā)病率為指標(biāo)進(jìn)行Arsenophonus共生菌與溫度的雙因素方差分析，結(jié)果表明，Arsenophonus對(duì)褐飛虱校正發(fā)病率的影響僅在處理后3 d、5 d顯著(P＜0.05)，其中，以含Arsenophonus試蟲的校正發(fā)病率較低；而處理后7 d、9 d不顯著(P＞0.05)。溫度對(duì)褐飛虱校正發(fā)病率在處理后4個(gè)時(shí)間均有顯著影響(Plt;0.05)，溫度顯著影響褐飛虱的綠僵菌發(fā)病率。其中，處理后3 d，21℃～29℃的校正發(fā)病率無(wú)顯著差異，且高于31℃，但只有25℃、27℃與31℃差異顯著；處理后5 d，27℃的校正發(fā)病率顯著高于其他5個(gè)溫度，而其他5個(gè)溫度間無(wú)顯著差異；處理后7 d、9 d，25℃、29℃的校正發(fā)病率與27℃無(wú)顯著差異，23℃則顯著高于21℃和31℃，但顯著低于27℃，其中處理后第7 d還顯著低于25℃和29℃(圖4)。總體上，6個(gè)溫度下的校正發(fā)病率由高到低依次為27℃、25℃、29℃、23℃、21℃和31℃。

圖1 黃綠綠僵菌處理后三個(gè)水稻品種上含Arsenophonus與不含Arsenophonus褐飛虱發(fā)病率的比較Fig. 1. Incidence rate of Metarhizium flavoviride-infected brown planthoppers with and without Arsenophonus reared on three rice varieties.

圖2 共生菌Arsenophonus(左)和水稻品種(右)對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig. 2. Effects of Arsenophonus (left) and rice varieties (right) on the incidence rate of Metarhizium flavoviride-infected brown planthoppers ( Mean ± SE ).

圖3 黃綠綠僵菌處理后在不同溫度條件下含Arsenophonus與不含Arsenophonus褐飛虱發(fā)病率的比較Fig. 3. Incidence rate of Metarhizium flavoviride-infected brown planthoppers with and without Arsenophonus under different temperatures,respectively.

進(jìn)一步分析不同溫度條件下褐飛虱試蟲的致死中時(shí)間(LT50)(表1)發(fā)現(xiàn)，23℃～29℃條件下LT50較短(4.7～7.6 d)，且27℃時(shí)最短(4.7～5.3 d)；21℃、31℃時(shí)均較長(zhǎng)，其中，不含Arsenophonus的試蟲超過(guò)10.2 d，含Arsenophonus的試蟲在8.8 d以上。結(jié)合前文不同溫度下試蟲校正發(fā)病率的排序結(jié)果，可以認(rèn)為23℃～29℃是黃綠綠僵菌侵染褐飛虱的適宜溫度范圍，且以27℃最為適宜，溫度過(guò)高(31℃)或過(guò)低(21℃)均不利于黃綠綠僵菌對(duì)褐飛虱的侵染。

含Arsenophonus與不含Arsenophonus試蟲的LT50相比，27℃、29℃時(shí)均以含Arsenophonus試蟲較長(zhǎng)，但25℃時(shí)兩類試蟲相同，且21℃、23℃、31℃三個(gè)溫度下均以含Arsenophonus試蟲的LT50較短，進(jìn)一步說(shuō)明環(huán)境溫度影響Arsenophonus共生菌對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的抑制作用。

3 討論

綠僵菌(Metarhizium. Sp)是一類重要的生防真菌，全世界大約有200多種昆蟲、線蟲及螨類可以被其感染致死[23-25]，是全世界研究應(yīng)用最多的蟲生真菌之一。黃綠綠僵菌作為一種潛在的稻飛虱生防菌倍受關(guān)注[14-16,26]，但迄今尚未在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用。探明黃綠綠僵菌侵染稻飛虱的重要影響因子是推進(jìn)其應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。綠僵菌對(duì)昆蟲的侵染，除取決于綠僵菌菌株自身因素(如菌株的生化特性[27]、菌株繼代次數(shù)[28])之外，寄主昆蟲體內(nèi)的共生菌[17,29]和環(huán)境溫度[12,30-31]是重要因素。

本研究進(jìn)一步證實(shí)感染Arsenophonus可降低褐飛虱黃綠綠僵菌的發(fā)病率。類似的現(xiàn)象亦見于其他昆蟲的相關(guān)研究報(bào)道。豌豆蚜體內(nèi)的Rickettsia insecticola降低了真菌的傳播速度，有效地抵抗真菌的侵染[29]。歐洲狼蜂(Philanthus Triangulum)可以利用觸角中的Streptomyces保護(hù)幼蟲免受致病真菌侵害[32]。木虱Psyllid體內(nèi)的Arsenophonus可以抵抗擬寄生物Psyllaphaegus bliteus的寄生[33]。目前，共生菌影響昆蟲抵御病原菌或其他天敵的機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者推測(cè)共生菌通過(guò)誘導(dǎo)宿主昆蟲免疫反應(yīng)來(lái)提高宿主抗性[32]。筆者亦觀察到，黃綠綠僵菌侵染褐飛虱時(shí)，含Arsenophonus的褐飛虱雌成蟲的漿血胞數(shù)量顯著高于不含Arsenophonus的褐飛虱(待發(fā)表資料)，似表明Arsenophonus共生菌通過(guò)血細(xì)胞免疫系統(tǒng)而影響褐飛虱黃綠綠僵菌感病性，但尚需進(jìn)一步探明。

水稻品種抗性是控制稻飛虱的第一道屏障，含Bph1抗蟲基因的水稻品種曾在東南亞及我國(guó)水稻生產(chǎn)中得到大面積應(yīng)用，近年來(lái)含Bph3抗蟲基因的水稻品種的選育亦在我國(guó)得到重視[1]。本研究明確水稻品種[TN1、IR56(含抗蟲基因Bph3)和Mudgo(含抗蟲基因Bph1)]對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌的發(fā)病率無(wú)顯著影響，且與褐飛虱Arsenophonus共生菌無(wú)交互作用，這可能表明水稻抗性品種盡管不利于褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，但并未影響褐飛虱對(duì)黃綠綠僵菌的敏感性。不過(guò)，本研究中的水稻品種有限，該現(xiàn)象是否適合于其他抗性水稻品種尚不清楚。

溫度是影響黃綠綠僵菌對(duì)褐飛虱的侵染的重要因素，這與前人[14,30]的結(jié)果類似。溫度對(duì)綠僵菌的作用體現(xiàn)在對(duì)產(chǎn)孢能力和致病力兩個(gè)方面的影響[11,12,31]。綠僵菌孢子侵染寄主的過(guò)程中需產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶來(lái)溶解寄主表皮以完成侵染，而綠僵菌的蛋白酶活性是其毒力的決定因素之一[34-36]，溫度通過(guò)對(duì)酶活的影響進(jìn)而影響綠僵菌孢子的侵染和毒力。對(duì)東亞飛蝗的研究表明，在極限高溫和極限低溫時(shí)，綠僵菌LA菌株的胞外蛋白酶產(chǎn)量明顯減少，其對(duì)飛蝗5齡若蟲的毒力降低；在最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，LA菌株的毒力也較強(qiáng)[12]。在溫度的具體影響方面，本研究發(fā)現(xiàn)23℃～29℃是黃綠綠僵菌ARSEF1764致病褐飛虱的適溫范圍，27℃為最適宜溫度，溫度為31℃或21℃時(shí)綠僵菌致病力顯著降低，這與李佳穎等[13]的黃綠綠僵菌SM076在26℃下菌落生長(zhǎng)速度最快、孢子萌發(fā)率最高以及杜光祖等[14]黃綠綠僵菌對(duì)灰飛虱3齡若蟲在27℃下致病力較強(qiáng)的結(jié)果基本一致；但與李佳穎等[13]報(bào)道的23℃最適黃綠綠僵菌SM076產(chǎn)孢的結(jié)果相差較大，推測(cè)黃綠綠僵菌產(chǎn)孢與菌落生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的適宜溫度有所不同。此外，杜光祖等[14]還發(fā)現(xiàn)黃綠綠僵菌在30℃下對(duì)灰飛虱3齡若蟲亦有較強(qiáng)致病力；岳梅等[12]則報(bào)道綠僵菌LA菌株在30℃、35℃孢子萌發(fā)速率最快，結(jié)果與本文有所不同，究其原因可能有：1)綠僵菌菌株不同，不同菌株對(duì)溫度的反應(yīng)可能存在一定的差異；2)宿主昆蟲不同，也可能造成溫度反應(yīng)的差異。

圖4 共生菌Arsenophonus (左)和溫度(右)對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌校正發(fā)病率的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig. 4. Effects of Arsenophonus (left) and temperatures (right) on the corrected incidence rate of Metarhizium flavoviride-infected brown planthoppers(Mean ± SE).

表1 不同溫度下黃綠綠僵菌處理后褐飛虱的致死中時(shí)間LT50Table 1. Median lethal time (LT50) of the brown planthoppers after Metarhizium flavoviride infestation at different temperatures. d

本研究中，盡管褐飛虱含菌狀況與溫度對(duì)黃綠綠僵菌發(fā)病率無(wú)顯著的交互作用，但溫度可能影響Arsenophonus對(duì)褐飛虱綠僵菌發(fā)病率的抑制作用，表現(xiàn)在兩方面：1)不同溫度條件下含Arsenophonus與不含Arsenophonus試蟲的發(fā)病率僅在25℃、27℃、29℃時(shí)有顯著差異，而21℃、23℃、31℃時(shí)各觀察時(shí)間均無(wú)顯著差異；2)不同溫度下含Arsenophonus與不含Arsenophonus試蟲的致死中時(shí)間(LT50)僅27℃、29℃時(shí)以含Arsenophonus的試蟲相對(duì)較長(zhǎng)，與Arsenophonus抑制褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病的結(jié)果不一致，其他溫度下含Arsenophonus的試蟲則相同甚至較短，與Arsenophonus抑制褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病的結(jié)果一致。推測(cè)Arsenophonus對(duì)黃綠綠僵菌侵染褐飛虱的抑制作用可能局限在一定的溫度范圍之內(nèi)。因Arsenophonus抑制黃綠綠僵菌侵染褐飛虱的機(jī)制還不清楚，這種溫度影響機(jī)制亦需進(jìn)一步研究。

本文Arsenophonus與水稻品種、Arsenophonus與溫度兩個(gè)雙因素實(shí)驗(yàn)的方差分析中，處理后7 d、9 d時(shí)Arsenophonus對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的影響并不一致，即前者影響顯著(圖2，左)。而后者不顯著(圖4，左)。這與前者體現(xiàn)不同水稻品種的綜合影響而后者體現(xiàn)不同溫度的綜合影響有關(guān)。如前所述，不同溫度下Arsenophonus對(duì)褐飛虱黃綠綠僵菌發(fā)病率的抑制作用有所不同，而水稻品種則無(wú)明顯影響，在處理后7 d、9 d含Arsenophonus與不含Arsenophonus試蟲發(fā)病率的差值較處理后5 d時(shí)有所收窄的前提下，可能導(dǎo)致Arsenophonus與溫度雙因素實(shí)驗(yàn)中Arsenophonus的影響達(dá)不到顯著水平。

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Influence of Symbiotic Bacteria Arsenophonus,Rice Variety and Temperature on the Incidence Rate of Nilaparvata lugens to Metarhizium flavoviride

ZHU Huanhuan,CHEN Yang,WAN Pinjun,WANG Weixia,LAI Fengxiang,FU Qiang*
(State Key Laboratory of Rice Biology,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China; *Corresponding author,E-mail: fuqiang@caas.cn)

【Objective】 To reveal the significant factors affecting the incidence rate of the brown planthopper (BPH) to Metarhizium flavoviride,laboratory bioassays were carried out to study the influence of symbiotic bacteria Arsenophonus,rice variety and temperature on the incidence rate of BPHs to M. flavoviride.【Method】 Through two completely randomized block trial: 1) symbiotic bacteria Arsenophonus (infected and uninfected) versus rice varieties (TN1,IR56 and Mudgo),2) and Arsenophonus (infected and uninfected) versus temperatures (21°C,23°C,25°C,27°C,29°C and 31°C),BPHs with symptoms of M. flavoviride infection were observed after exposure to the spore suspensions of M.flavoviride for different periods.【Result】 For all tested rice varieties,the incidence rates of M. flavoviride-treated BPHs infected with Arsenophonus (BPH++) were lower than that of BPHs uninfected (BPH--). Out of tested temperatures,only under 25°C,27°C,29°C,BPH++ has lower incidence rates than BPH-- at 3 d and 5 d after spraying. However,there was no significant difference among others. The results of two-way ANOVA analysis between Arsenophonus and rice varieties also indicated that the incidence rate of BPH++ was lower than that of BPH--. Furthermore,two-way ANOVA results between Arsenophonus and temperatures indicated the incidence rate of BPH++ was lower than that of BPH-- at 3 d and 5 d after spraying. The effect of temperature was significant on the virulence of M. flavoviride to BPHs. BPHs had higher corrected incidence rates and shorter LT50under 23°C－29°C than that under 21°C or 31°C. Out of these BPHs,the highest corrected incidence rates and shortest LT50were found at 27°C. It suggested 23°C－29°C was suitable temperature for infection of M. flavoviride,among which 27°C was the best. This suggested that low or high temperatures would negatively affect the virulence of M. flavoviride to BPH. The temperature also affected the LT50of BPHs. The LT50of BPH++ was longer than that of BPH-- under 27°C or 29°C. However,the LT50of BPH++ was equal or even shorter than that of BPH-- under other temperatures.【Conclusion】 Arsenophonus decreased the virulence of M.flavoviride to BPH,which was influenced by temperature. The temperature also affects the incidence rate of BPHs to Metarhizium flavoviride significantly. However,the effects of rice varieties and interactions of Arsenophonus and rice varieties and Arsenophonus and temperatures were not significant on the incidence rate.

Nilaparvata lugens; Metarhizium flavoviride; Arsenophonus; temperature; rice variety

10.16819/j.1001-7216.2017.7012

2017-02-06； 修改稿收到日期：2017-05-04。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401738)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2014RG005)；農(nóng)業(yè)現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(CARS-1-18)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程水稻病蟲草害防控技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。

S435.112+.3; S476.1; S511.02

A

1001-7216(2017)06-0643-09