蓮子胚培養(yǎng)再生植株及原生質(zhì)體分離的研究

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(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室， 廣東 廣州 510275)

蓮子胚培養(yǎng)再生植株及原生質(zhì)體分離的研究

蔡穎欣，湯宇環(huán)，邵曉宇，黃霞

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室， 廣東 廣州 510275)

以蓮子胚為外植體建立江溪紅蓮離體培養(yǎng)再生體系，并以所得再生植株的展開葉片為材料，摸索原生質(zhì)體分離的條件，為荷花體細胞雜交育種提供實驗基礎(chǔ)。結(jié)果表明，較理想的芽增殖培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；成苗階段采用固液雙層培養(yǎng)基最適宜。而最佳的葉片原生質(zhì)體分離酶液組合為2%纖維素酶+1%離析酶+0.1%果膠酶。

荷花； 芽增殖； 植株再生； 原生質(zhì)體

荷花(Nelumbonucifera)為睡蓮科多年水生草本花卉，是一種重要的經(jīng)濟作物。其葉片和花具有相當(dāng)高的觀賞價值；地下莖蓮藕和種子蓮子是我國常見的蔬菜；據(jù)《本草綱目》記載，荷花全株均可入藥[1-3]。傳統(tǒng)的荷花繁殖方法主要采用分藕繁殖，需要進行大面積的缸栽或者池栽，且繁殖系數(shù)較低，大大限制了荷花種植業(yè)的發(fā)展[4-6]。為了解決這一問題，研究者們嘗試通過離體培養(yǎng)來進行荷花的快速繁殖。已有的報道多以地下莖上的芽為外植體進行離體培養(yǎng)獲得再生植株[6-11]。該體系中外植體消毒困難，而且取材時間(季節(jié))顯著影響芽誘導(dǎo)頻率[6,11]。孔德政等[5]采用荷花胚為外植體，通過胚萌發(fā)直接得到完整植株，但并未觀察到芽增殖現(xiàn)象。以江溪紅蓮的胚為材料進行組織培養(yǎng)，首次研究不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對芽增殖的影響以及不同培養(yǎng)方式對再生植株生長狀況的影響，以建立高效、穩(wěn)定的荷花離體培養(yǎng)植株再生體系，為種苗工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。同時，利用所得到的無菌苗，以其展開的幼葉為材料進行原生質(zhì)體分離條件的摸索，為荷花原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細胞雜交育種提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為江溪紅蓮(NelumbonuciferaGaertn. cv. Jiangxi Honglian)的成熟蓮子，由廣東省三水荷花世界提供。

1.2 方 法

1.2.1 種子消毒及胚的獲得

蓮子用自來水清洗干凈，使用園藝剪枝剪剝除蓮子的外殼(果皮)，用70%的酒精消毒1 min，無菌水沖洗2～3次。然后用0.1%的次氯酸鈉消毒8～10 min，無菌水沖洗5～6次。使用解剖刀將種子的子葉沿中縫剝開，取出胚(圖1 A)，并去掉胚上的薄膜。

1.2.2 胚萌發(fā)培養(yǎng)

將處理好的胚接種到胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，每瓶接種4個胚，于(25±1)℃，1 500～2 000 lx，每天16 h光照條件下培養(yǎng)。胚萌發(fā)培養(yǎng)基組成為：以MS[12]為基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA、20 g/L蔗糖和7 g/L 瓊脂，pH=5.7。

1.2.3 芽增殖培養(yǎng)

胚萌發(fā)后，將幼葉切除，取單個幼芽接種到添加不同濃度6-BA(0.5～1.5 mg/L)和NAA 0.05～0.1 mg/L(如表1所示)的芽增殖培養(yǎng)基MS+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂(pH=5.7)上，每瓶接種4個芽，20個芽作為1個處理組合，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，每天光照時間為16 h，光照強度1 500～2 000 lx。培養(yǎng)25 d后分別統(tǒng)計存活率和芽增殖系數(shù)。

存活率(%)=存活的外植體個數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；

芽增殖系數(shù)=獲得的叢生芽總個數(shù)/接種的幼芽個數(shù)。

1.2.4 成苗培養(yǎng)

將生長健壯的芽轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基中，分別采用固體培養(yǎng)及固液雙層培養(yǎng)2種方式，于(25±1)℃，1 500～2 000 lx，每天16 h光照培養(yǎng)。每瓶接種1個芽，10瓶為1個處理，每個處理重復(fù)3次。培養(yǎng)4周后統(tǒng)計實驗結(jié)果，比較2種培養(yǎng)方法植株的莖生長狀況、幼葉展開狀況等，探索最適合荷花植株生長的培養(yǎng)方式。

固體培養(yǎng)基組成為：MS+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+7 g/L瓊脂，pH=5.7。液體培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，pH=5.7。固體培養(yǎng)基于高壓滅菌前分裝至培養(yǎng)瓶；而液體培養(yǎng)基則高壓滅菌后用于固液雙層培養(yǎng)，即將芽接種到固體培養(yǎng)基上后直接加入液體培養(yǎng)基，浸沒培養(yǎng)材料。

1.2.5 葉片原生質(zhì)體的分離純化

通過以上步驟獲得江溪紅蓮的離體再生植株后，取展開4～7 d的幼葉作為分離原生質(zhì)體的材料。將葉片剪成1 mm×2 mm左右，按1∶5(材料∶酶解液，w/v)的比例加入酶解液，(25±1)℃，40～60 r/min，黑暗條件下進行酶解。酶解液組成為： CPW溶液[13]，添加0.5 mol/L甘露醇、5 mmol/L MES以及不同濃度的Cellulase R-10、Macerozyme R-10和Pectolase Y-23，pH=5.4。

酶解約6 h后，將去除了葉片殘渣的酶解混合液于1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀重懸于含0.5 mol/L甘露醇和5 mmol/L MES的CPW溶液(即原生質(zhì)體清洗液)中，分別使用孔徑為0.15，0.075，0.048 mm篩網(wǎng)過濾，濾液于1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀重懸于原生質(zhì)體清洗液中進行離心洗滌，重復(fù)洗滌3次。最后加入適量的原生質(zhì)體清洗液重懸純化后的原生質(zhì)體并用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體的產(chǎn)量。

1.3 統(tǒng)計分析

使用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，平均值以平均數(shù) ± 標(biāo)準誤表示，分別進行2個樣本平均數(shù)的t檢驗或采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法(Duncan's multiple ranger test)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA和NAA組合對芽增殖的影響

于胚萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d左右，江溪紅蓮的種子胚開始伸長萌發(fā)，并逐漸長出幼葉。將幼葉切除，取單個幼芽進行芽增殖培養(yǎng)，結(jié)果見表1、圖1 B和圖1 C所示。

由表1可看出，6-BA濃度增加可提高芽增殖系數(shù)，但其濃度達到1.5 mg/L 時，芽的存活率由100%降低到86.67%，而與含相同NAA的處理組合比較，芽增殖系數(shù)也有所下降。當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時，NAA濃度升高有利于芽增殖。綜合考慮，MS培養(yǎng)基中添加1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA對江溪紅蓮芽增殖的效果最好。

表1 6-BA和NAA對江溪紅蓮芽增殖的影響

處理6?BA(mg/L)NAA(mg/L)存活率(%)芽增殖系數(shù)10．50．05100．00±0．001．47±0．13d20．50．10100．00±0．002．18±0．08c31．00．10100．00±0．003．40±0．15a41．00．1086．67±2．892．54±0．12b

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(plt;0.05)。

2.2 培養(yǎng)方式對再生植株生長的影響

如圖1 D、E、F和表2所示，固體培養(yǎng)基上加入液體培養(yǎng)基后，有利于江溪紅蓮離體再生植株的生長。雖然2種培養(yǎng)方式對生根沒有明顯的影響，但使用固液雙層培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，幼葉和莖生長均顯著優(yōu)于只使用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；另外，固體培養(yǎng)基上的植株幼葉很難展開，而固液雙層培養(yǎng)基上的植株幼葉數(shù)量多且展開早，這為進行原生質(zhì)體分離提供了很好的葉片材料。

2.3 不同酶組合對葉片原生質(zhì)體分離的影響

在植物原生質(zhì)體分離中，最常用的酶是纖維素酶、離析酶和果膠酶，從表3可以看出，酶的組合極大的影響到原生質(zhì)體的產(chǎn)量。果膠酶對江溪紅蓮葉片原生質(zhì)體分離的影響最顯著，不加果膠酶時，原生質(zhì)體脫壁不完全，產(chǎn)量低；但隨著果膠酶濃度升高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也有所下降。實驗發(fā)現(xiàn)，纖維素酶、離析酶和果膠酶3種酶混合使用，且果膠酶濃度適中才能得到較多質(zhì)量好的原生質(zhì)體。本次試驗中，使用含2%纖維素酶、1%離析酶和0.1%果膠酶的酶混合液進行分離時，所得原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，達到3.6×105g。

表2 培養(yǎng)方式對江溪紅蓮再生植株生長狀態(tài)的影響

培養(yǎng)方式葉片總數(shù)(展開的葉片數(shù)量)再生植株的莖長(cm)再生植株的整體長勢固體培養(yǎng)2．3±0．4b(0．87±0．12B)15．63±0．45B+固液2層培養(yǎng)3．5±0．3a(1．97±0．12A)20．77±0．60A+++

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(plt;0.05)，大寫字母表示差異極顯著(plt;0.01)；“+”越多表示植株的整體長勢越旺盛。

注：A為外植體制備(箭頭所指為蓮子胚)；B為添加1 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA時芽增殖的狀況；C為添加1.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時芽增殖的狀況；D為于固體培養(yǎng)基上生長2周的再生植株；E為于固液雙層培養(yǎng)基上生長2周的再生植株；F為于固液雙層培養(yǎng)基上生長3～4周的再生植株；G為葉片原生質(zhì)體分離結(jié)果(酶解配方：2%纖維素酶，1%離析酶，0.1%果膠酶)。圖1 江溪紅蓮的胚培養(yǎng)及原生質(zhì)體分離

表3 不同酶組合對江溪紅蓮葉片原生質(zhì)體分離的影響

處理纖維素酶(%，w/v)離析酶(%，w/v)果膠酶(%，w/v)原生質(zhì)體產(chǎn)量(105g)12．01．00．02．8±0．1c22．01．00．13．6±0．1a32．01．00．23．3±0．1b42．00．00．53．2±0．1b

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示差異不顯著(pgt;0.05)。

3 討 論

荷花外植體初代培養(yǎng)最主要的問題之一就是污染，已有的報道都使用氯化汞進行消毒，對于荷花子藕頂芽即使消毒20 min污染率仍然很高，成活率僅為47.4%[6]。孔德政等[5]發(fā)現(xiàn)，蓮子胚用氯化汞消毒10 min可達到較好的效果，但外植體的成活率也只能達到65%左右，而且由于使用濃硫酸浸泡蓮子破除外殼，外植體可能同時受到硫酸和氯化汞的傷害，致使荷花胚的萌發(fā)率較低，最高只達到42%左右。本試驗采用園藝剪枝剪剝除蓮子的外殼，然后用次氯酸鈉消毒10 min左右即可達到很好的效果，荷花胚的萌發(fā)率可達到100%。

有研究表明，6-BA在荷花芽誘導(dǎo)和增殖過程中起重要作用[9,11,14]，本試驗也發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加6-BA濃度能提高荷花芽的增殖系數(shù)，但濃度過高則對芽增殖有抑制作用甚至影響其存活率。

固體培養(yǎng)對荷花試管苗生長具有環(huán)境脅迫效應(yīng)，能夠抑制莖、葉的生長以及葉片的展開[6]。本試驗所用的固液雙層培養(yǎng)基環(huán)境與荷花的自然生長環(huán)境比較接近，因此試管苗生長更加旺盛，不僅莖伸長快、葉片數(shù)目較多，而且葉片也較易展開。這一培養(yǎng)系統(tǒng)為使用無菌苗的展開葉片分離原生質(zhì)體提供了很好的實驗材料。

利用原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合技術(shù)培育新品種是植物生物技術(shù)育種的有效途徑之一[15]，但尚未見荷花原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的報道，僅Treesaksri等[13]以盆栽苗的幼芽為材料分離原生質(zhì)體，產(chǎn)量只達到3.3×104g。本試驗以無菌試管苗的展開幼芽為材料，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達3.6×105g。該實驗體系取材重復(fù)性好，且材料新鮮，適宜用于荷花原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合的相關(guān)研究。而在分離原生質(zhì)體時，酶的選擇和酶濃度的確定也很關(guān)鍵，實驗表明，纖維素酶和離析酶是荷花原生質(zhì)體分離的必要酶，而加入果膠酶能夠使原生質(zhì)體脫壁效果更好，因此3種酶的搭配使用能獲得比較好的分離效果。

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(本欄目責(zé)任編輯：周忠燕)

Researches on Plant Regeneration from Embryos and Protoplast Isolationof Lotus

(Nelumbonucifera)CAIYingxin,TANGYuhuan,SHAOXiaoyu,HUANGXia

2016-10-26

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(121 gpy 41)。

蔡穎欣(1989—)，女，廣東廣州人；碩士，研究方向：經(jīng)濟作物生物技術(shù)育種；E-mail:qbennyq@qq.com。

黃 霞(1974—)，女，廣東廉江人；副教授，博士，主要從事植物生理與分子生物學(xué)等研究工作；E-mail:huangxia@mail.sysu.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.125

S 645.1

A

1001-4705(2017)03-0125-04