五臺(tái)山野生迎紅杜鵑組織培養(yǎng)技術(shù)研究

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(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 山西 太谷 030800；2.山西省臨汾市曲沃縣人力資源和社會(huì)保障局企業(yè)養(yǎng)老保險(xiǎn)管理服務(wù)中心， 山西 臨汾 043400)

·種子生產(chǎn)·

五臺(tái)山野生迎紅杜鵑組織培養(yǎng)技術(shù)研究

王育選1，任建宏1，王鵬麗1，王曉璐1，趙娟1，王瑞瑞2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 山西 太谷 030800；2.山西省臨汾市曲沃縣人力資源和社會(huì)保障局企業(yè)養(yǎng)老保險(xiǎn)管理服務(wù)中心， 山西 臨汾 043400)

以五臺(tái)山野生迎紅杜鵑的種子為試驗(yàn)材料，比較了不同培養(yǎng)基配方、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度對(duì)迎紅杜鵑組織培養(yǎng)的影響，建立了迎紅杜鵑組織培養(yǎng)再生體系。結(jié)果表明：最佳消毒方式為70%的酒精浸泡30 s+8.0%次氯酸鈉浸泡處理8 min+無(wú)菌水沖洗；基本培養(yǎng)基為Anderson+0.1 mg/L NAA；增殖培養(yǎng)基為Anderson+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA；生根培養(yǎng)基為Anderson+1.0 mg/L NAA；煉苗移栽基質(zhì)以腐殖土∶珍珠巖=2∶1混合效果最好。

迎紅杜鵑； 組織培養(yǎng)； 五臺(tái)山

迎紅杜鵑(Rhododendronmucronulatum)為杜鵑科杜鵑屬的植物，是我國(guó)華北地區(qū)僅有的2種野生杜鵑之一，又名迎山紅、藍(lán)荊子、尖葉杜鵑。迎紅杜鵑一種落葉灌木，花先葉開(kāi)放，花紫紅色，自然花期早，且花期較長(zhǎng)，耐寒性強(qiáng),病蟲(chóng)害少，耐修剪，可在華北、東北地區(qū)廣泛栽培，具有很高的觀賞價(jià)值；而且它還具有藥用價(jià)值，對(duì)于慢性氣管炎、腸炎等有一定療效[1-2]。迎紅杜鵑分布于我國(guó)華北山區(qū)、東北大部，在山西省五臺(tái)山也有分布，但十分稀少，已被列為二級(jí)保護(hù)植物[3]。

杜鵑可以通過(guò)播種、扦插、壓條和組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖[4-6]。迎紅杜鵑種子較小，播種繁殖較難；扦插繁殖受材料限制繁殖系數(shù)較低；而組織培養(yǎng)是高效的無(wú)性繁殖技術(shù), 也是種質(zhì)創(chuàng)新和良種培育技術(shù)。已有學(xué)者對(duì)迎紅杜鵑的嫩芽、嫩枝進(jìn)行研究并建立了組織培養(yǎng)體系[7-9]。

本試驗(yàn)以五臺(tái)山野生迎紅杜鵑種子為材料，對(duì)迎紅杜鵑種子外殖體消毒、誘導(dǎo)分化、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立迎紅杜鵑的快繁技術(shù)體系，為進(jìn)一步開(kāi)展五臺(tái)山野生迎紅杜鵑的種質(zhì)資源保存、新品種選育和繁育推廣工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)材料為迎紅杜鵑的種子，采自山西省五臺(tái)山。無(wú)菌培養(yǎng)條件為：溫度(25±20)℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 800～2 500 lx。

1.2 外殖體消毒

將迎紅杜鵑的種子從蒴果中取出后包于濾紙中，以70%的酒精浸泡30 s后無(wú)菌水沖洗1次，再以0.1%升汞(HgCl2) 浸泡5～10 min或8.0%次氯酸鈉(NaClO)浸泡5～10 min，最后用無(wú)菌水沖洗5次，每次2～3 min。消毒后種子接種于同一基本培養(yǎng)基上。每處理接種30粒飽滿種子，重復(fù)3次。接種后30 d觀察并記錄不同消毒處理的污染率、褐化率和死亡率。種子植入后30 d觀察并記錄存活材料數(shù)。

污染率(%)=接種污染數(shù)/接種總數(shù)×100%；

成活率(%)=未污染發(fā)芽數(shù)/接種總數(shù)×100%；

褐化率(%)=未污染褐化數(shù)/接種總數(shù)×100%。

1.3 基本培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基使用Anderson、Read和改良MS 3種培養(yǎng)基和不同激素濃度的9個(gè)處理(見(jiàn)表2)，培養(yǎng)基中另加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂粉，pH值為5.2～5.6。每處理接種30粒飽滿種子，重復(fù)3次。種子植入后50 d觀察并記錄芽誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況。

1.4 增殖培養(yǎng)基

將種子萌發(fā)獲得的組培苗接種于3種細(xì)胞分裂素

表2 不同基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化試驗(yàn)結(jié)果

處理培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)率(%)生長(zhǎng)情況1Anderson+0．1mg/LNAA56．7生長(zhǎng)勢(shì)好，葉色綠葉片較大、2Anderson+0．5mg/LNAA43．3生長(zhǎng)勢(shì)較好，葉色淺葉片窄3Anderson+1．0mg/LNAA30．0生長(zhǎng)勢(shì)較好，葉色淺葉片窄4Read+1mg/LZT+0．1mg/LNAA23．3生長(zhǎng)勢(shì)弱，葉色淺葉片窄5Read+3mg/LZT+0．5mg/LNAA43．3生長(zhǎng)勢(shì)弱，葉色淺6Read+5mg/LZT+1．0mg/LNAA50．0生長(zhǎng)勢(shì)較好，葉色綠葉片較大7改良MS+1mg/LZT+0．1mg/LNAA26．7生長(zhǎng)勢(shì)弱，葉色淺葉片窄8改良MS+3mg/LZT+0．5mg/LNAA40．0生長(zhǎng)勢(shì)較好，葉色綠9改良MS+5mg/LZT+1．0mg/LNAA36．7生長(zhǎng)勢(shì)若，葉色淺葉片窄

表3 不同組合增殖培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

處理培養(yǎng)基芽平均增殖倍數(shù)生長(zhǎng)情況1Anderson+1．0mg/LZT+0．1mg/LNAA6．4增殖率高，生長(zhǎng)較快，生長(zhǎng)勢(shì)好2Anderson+1．0mg/L2?iP+0．1mg/LNAA2．3增殖率較高，苗生長(zhǎng)正常3Anderson+1．0mg/L6?BA+0．1mg/LNAA1．5增殖率低，苗生長(zhǎng)慢4Anderson+1．0mg/LZT+0．1mg/LIBA2．4增殖率較高，苗生長(zhǎng)慢5Anderson+1．0mg/L2?iP+0．1mg/LIBA1．6增殖率低，苗生長(zhǎng)弱6Anderson+1．0mg/L6?BA+0．1mg/LIBA1．2增殖率低，苗生長(zhǎng)弱

(ZT、2-iP、6-BA)和2種生長(zhǎng)素(NAA、IBA)組合的6種培增殖養(yǎng)基(見(jiàn)表3)。每處理接種無(wú)菌苗30棵，重復(fù)3次。30 d后觀察叢生芽增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)情況。

1.5 生根培養(yǎng)基

當(dāng)組培苗苗高為3 cm以上時(shí)，將其從基部切下，接種到IBA和NAA不同濃度的生根培養(yǎng)基(表4)中進(jìn)行生根，每處理組培苗30棵，重復(fù)3次。60 d后觀察生長(zhǎng)情況。

1.6 煉苗移栽

將生根培養(yǎng)40 d的組培苗從無(wú)菌培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到普通試驗(yàn)室，將瓶口松動(dòng)完全揭開(kāi)煉苗10 d。移栽時(shí)，將苗從培養(yǎng)瓶中取出，用自來(lái)水洗掉根部的培養(yǎng)基，將根浸泡在0.2%的多菌靈溶液中3 min，然后栽到由腐殖土和珍珠巖配置的4種不同基質(zhì)中(表5) ，每個(gè)處理30株生根組培苗，30 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)小苗的成活率和生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式的消毒效果比較

迎紅杜鵑種子植入培養(yǎng)基后12～15 d開(kāi)始萌發(fā)，到20 d以后萌發(fā)數(shù)逐漸減少，30 d統(tǒng)計(jì)種子的污染率、褐化率和萌發(fā)成活率。迎紅杜鵑種子采用不同消毒方式和時(shí)間的消毒效果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，無(wú)論是升汞還是次氯酸鈉，消毒時(shí)間越長(zhǎng)，污染率和成活率越低，但外殖體的褐化率越高。在相同處理時(shí)間條件下，升汞處理的外殖體污染率低于次氯酸鈉，但升汞處理的褐化率較高。從成活率看，升汞處理8 min的成活率為58.9%，略高于次氯酸鈉處理8 min的成活率56.7%。綜合而言，迎紅杜鵑種子消毒最佳方式為70%的酒精浸泡30 s+次氯酸鈉浸泡處理8 min+無(wú)菌水沖洗。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)分化的影響

不同培養(yǎng)基的種子誘導(dǎo)分化芽成活率和生長(zhǎng)情況結(jié)果見(jiàn)表2。3種培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化效果中以Anderson培養(yǎng)基效果最好，其次為Read培養(yǎng)基，改良MS培養(yǎng)基的效果較差。其中，Anderson+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化效果最好，成活率達(dá)56.7%，且組培苗生長(zhǎng)勢(shì)好，葉色綠且葉片較大。同一種類(lèi)培養(yǎng)基不同激素濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)效果也存在差異，如Anderson+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基的成活率為56.7%，而Anderson+1.0 mg/L NAA的成活率僅為30.0%，且生長(zhǎng)勢(shì)弱，葉色淺葉片窄。由此可見(jiàn)，迎紅杜鵑種子的最佳基本培養(yǎng)基為Anderson+0.1 mg/L NAA。

表1 不同消毒方式消毒效果的比較

處理消毒劑種類(lèi)處理時(shí)間(min)污染率(%)褐化率(%)成活率(%)1HgCl2548．96．738．92HgCl2824．411．158．93HgCl2106．727．8504NaClO558．95．631．15NaClO828．98．956．76NaClO1011．120．052．2

2.3 不同組合對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

由表3可知，6種不同激素組合的培養(yǎng)基對(duì)組培苗的增殖倍數(shù)和生長(zhǎng)情況產(chǎn)生較大影響。以Anderson+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA的增殖效果最好，平均增殖倍數(shù)達(dá)6.4倍，且生長(zhǎng)較快，長(zhǎng)勢(shì)好。不同的細(xì)胞分裂素增殖效果存在差異，ZT的增殖效果最佳，其次為2-ip，6-BA效果最差。不同的生長(zhǎng)素對(duì)增殖培養(yǎng)的增殖倍數(shù)也有影響，NAA的效果明顯高于IBA。

2.4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

組培苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基30 d左右開(kāi)始長(zhǎng)出白色的根尖，之后逐漸伸長(zhǎng)，60 d形成根系。本試驗(yàn)中，NAA的生根率和生根條數(shù)明顯優(yōu)于IBA。隨著NAA的濃度升高，組培苗的生根率越高。而隨著IBA濃度的變化，生根率先升高又下降，以0.5 mg/L濃度時(shí)生根效果最好。以Anderson+1.0 mg/L NAA生根培養(yǎng)基的生根效果最佳，生根率為93.3%，平均生根4.4條。

表4 不同生根培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果

處理生根培養(yǎng)基種類(lèi)生根率(%)平均生根條數(shù)1Anderson+0．1mg/LIBA26．72．22Anderson+0．5mg/LIBA73．33．33Anderson+1．0mg/LIBA50．03．14Anderson+0．1mg/LNAA30．02．65Anderson+0．5mg/LNAA76．73．26Anderson+1．0mg/LNAA93．34．4

2.5 不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽成活的影響

由表5可知，3號(hào)基質(zhì)(體積比腐殖土∶珍珠巖=2∶1)的移栽成活率86.7%，長(zhǎng)勢(shì)較好，效果最好；其次為2號(hào)基質(zhì)，移栽成活率73.3%；4號(hào)珍珠巖基質(zhì)移栽效果最差，成活率僅為26.7%，且生長(zhǎng)勢(shì)較弱。

表5 不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽成活結(jié)果

處理基質(zhì)移栽苗數(shù)(個(gè))成活率(%)1腐殖土3066．72腐殖土∶珍珠巖=1∶13073．33腐殖土∶珍珠巖=2∶13086．74珍珠巖3026．7

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)工作中，無(wú)菌外殖體的獲得非常重要。由于迎紅杜鵑的種子較小，操作較為困難和滅菌不徹底造成污染，成為最終影響消毒效果的重要因素。本試驗(yàn)消毒過(guò)程中將種子包于濾紙中進(jìn)行消毒處理，從而降低了操作難度，提高了工作效率。目前，杜鵑組織培養(yǎng)過(guò)程中通常采用升汞浸泡消毒，如周蘭等[9]采用升汞消毒2～5 min處理迎紅杜鵑莖段；李媛等[7]采用0.25 g/L多菌靈浸泡45 min+75%酒精消毒30 s+0.1%升汞消毒6 min處理嫩枝；吳雅文等[10]采用0.1%升汞3 min+無(wú)菌水清洗1 min+0.1%升汞3 min處理迷人杜鵑種子。本試驗(yàn)中升汞消毒處理8 min的成活率略高于次氯酸鈉浸泡，但考慮到升汞屬劇毒管制類(lèi)藥品，藥品的購(gòu)買(mǎi)和管理程序都較為復(fù)雜，因此可用次氯酸鈉替代升汞。本試驗(yàn)采用70%的酒精浸泡30 s+8.0%次氯酸鈉浸泡處理8 min+無(wú)菌水沖洗的消毒方式既可以達(dá)到良好的消毒效果，又可以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者的傷害和環(huán)境的污染。

目前，杜鵑類(lèi)植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基有Anderson、Read、MS、WPS等[5-6]。根據(jù)杜鵑種類(lèi)、外殖體組織部位、生長(zhǎng)狀態(tài)等的營(yíng)養(yǎng)需求不同選用培養(yǎng)基也不同。周蘭對(duì)迎紅杜鵑嫩枝使用改良MS培養(yǎng)基取得了較好的效果[9]，而李媛則認(rèn)為，選用Read培養(yǎng)基對(duì)嫩枝培養(yǎng)達(dá)到較好的誘導(dǎo)成活率[7]。本試驗(yàn)中，Anderson培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于Read和改良MS培養(yǎng)基。選用Anderson+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基的成活率為56.7%，取得了較好的誘導(dǎo)效果。因此，選擇適宜的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。

適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能誘導(dǎo)植物的細(xì)胞分裂、分化、生長(zhǎng)和發(fā)育。細(xì)胞分裂素ZT、2-iP和6-BA等誘導(dǎo)植物細(xì)胞發(fā)生增殖，在增殖培養(yǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。在杜鵑的增殖培養(yǎng)中，有人認(rèn)為細(xì)胞分裂素2-iP的效果好，也有人認(rèn)為ZT更好，6-BA也有應(yīng)用[6]。本研究?jī)H對(duì)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的最佳組合進(jìn)行了探討，而已有研究表明，降低細(xì)胞分裂素濃度既可以提高增殖倍數(shù)又可保持較好的生長(zhǎng)勢(shì)，因此可以對(duì)此進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化。杜鵑的生根培養(yǎng)也需要使用適當(dāng)種類(lèi)和濃度的生長(zhǎng)素[5-6]。本研究中迎紅杜鵑的生根培養(yǎng)中使用NAA 1.0 mg/L效果較好。

生根組培苗的移栽成活率高低直接決定了組培體系的繁殖效率。而基質(zhì)對(duì)組培苗移栽成活率具有重要影響。不同基質(zhì)的保水性、肥力和透氣性不同，從而影響組培苗的移栽成活率和生長(zhǎng)狀況[10]。本試驗(yàn)中采用腐殖土與珍珠巖體積比2∶1的混合基質(zhì)表現(xiàn)出較優(yōu)的移栽成活效果。腐殖土屬微酸性土壤，可提供迎紅杜鵑生長(zhǎng)所需的酸性環(huán)境和肥力，珍珠巖則能提高土壤疏水性和透氣性，有利于根生長(zhǎng)。

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Research on Tissue Culture ofRhododendronmucronulatumfrom Wutai Mountain

WANGYuxuan1,RENJianhong1,WANGPengli1,WANGXiaolu1,ZHAOJuan1,WANGRuirui2

2016-10-25

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130311014-1)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2012 YJ 13)。

王育選(1968—)，男，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物組織培養(yǎng)。

趙 娟，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師；E-mail:sxndzhaojuan@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.122

S 685.21

A

1001-4705(2017)03-0122-04