利拉魯肽對(duì)急性心肌梗死大鼠血管新生和心肌保護(hù)的影響及機(jī)制研究

盧慧芳，方義杰，李玥，黃涌泉，羅禮云，林岫芳

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

利拉魯肽對(duì)急性心肌梗死大鼠血管新生和心肌保護(hù)的影響及機(jī)制研究

盧慧芳，方義杰，李玥，黃涌泉，羅禮云，林岫芳

目的：觀(guān)察利拉魯肽對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌血管新生的影響及其心肌保護(hù)作用。

方法：冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠急性心肌梗死模型，成功建模的大鼠隨機(jī)分為三組（每組6只）：對(duì)照組、利拉魯肽低劑量組（LS組）和利拉魯肽高劑量組（HS組），另外取6只大鼠僅穿線(xiàn)，不結(jié)扎，作為假手術(shù)組。LS組和HS組建模后分別腹腔皮下注射利拉魯肽70 μg/（kg·d）和140 μg/（kg·d），假手術(shù)組和對(duì)照組均注射相應(yīng)生理鹽水，每天1次，共2周。4周后，超聲心動(dòng)圖評(píng)估大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能，HE染色觀(guān)察心肌組織形態(tài)學(xué)變化，Masson染色計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度（MVD）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白表達(dá)，蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)VEGF蛋白含量。

結(jié)果：4周后，對(duì)照組較假手術(shù)組左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）均明顯減低，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）及CVF明顯增加（P均＜0.01），而MVD及VEGF蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組相比，LS組和HS組LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.01），LVEDd、LVESd降低（P＜0.05），CVF明顯下降（P＜0.01），MVD及VEGF蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；HS組較LS組LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.01），LVEDd、LVESd和CVF下降（P＜0.05），MVD及VEGF蛋白水平增加（P＜0.01或P＜0.05）。

結(jié)論：利拉魯肽可促進(jìn)急性心肌梗死大鼠血管新生，可能與增加VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)，并可減少膠原沉積，從而改善左心室收縮功能，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，且與劑量有一定關(guān)系。

心肌梗死；血管新生；利拉魯肽

心血管疾病（cardiac vascular disease, CVD）是威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一，中國(guó)心血管病報(bào)告2015顯示，每5例死亡者中就有2例死于心血管病，并且數(shù)量在逐年增加[1]。而糖尿病亦是世界重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，糖尿病患者CVD的死亡率增加了2 倍多[2]，超過(guò)一半的冠心病患者合并糖尿病[3，4]。因此，大多數(shù)冠心病患者需要接受降糖藥等多種藥物綜合治療，而傳統(tǒng)降糖藥物在合并CVD時(shí)應(yīng)用受限，因此既能控制血糖又有心血管益處的降糖藥物備受青睞。目前，胰高糖素樣多肽-l（glucagon-like peptide-1, GLP-1）受體激動(dòng)劑廣泛的藥理學(xué)作用頗受關(guān)注，GLP-1及其類(lèi)似物在降血糖的同時(shí)，對(duì)心肌、血管、腎臟等有一定的保護(hù)作用[5，6]。利拉魯肽是常用的GLP-1受體激動(dòng)劑，在糖尿病合并心血管疾病中的應(yīng)用是目前的研究熱點(diǎn)，具有獨(dú)立于降血糖之外的心血管益處[7]，但其對(duì)心肌梗死后血管新生的影響卻鮮有報(bào)道。本研究將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

SPF級(jí)雄性SD(Sprague—Dawley)大鼠，體重220～250 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。戊巴比妥鈉購(gòu)自上海西唐科技有限公司。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，CD31抗體購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型的建立及分組干預(yù)

參照文獻(xiàn)[8]，所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前禁食、禁飲12 h，稱(chēng)重后用l%戊巴比妥鈉(30～45 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，經(jīng)口氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(呼吸機(jī)參數(shù)：呼吸比2：1，潮氣量30 ml/kg，呼吸頻率65～80次/min)，無(wú)菌操作下于左胸前區(qū)第三、四肋間行胸廓切開(kāi)術(shù)，暴露心臟，撕開(kāi)心包，于左心耳下緣2～3 mm處用6-O縫合線(xiàn)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，進(jìn)針深度約2 mm，做兩次外科手術(shù)結(jié)扎打結(jié)。結(jié)扎后肉眼可見(jiàn)結(jié)扎局部下方和左心室前壁呈灰白至紫紺，室壁運(yùn)動(dòng)減弱，且心電圖Ⅱ?qū)?lián)R波增高伴明顯切跡（ST段抬高）并持續(xù)15 min以上即為心肌梗死模型結(jié)扎成功標(biāo)志。抽吸胸腔后負(fù)壓關(guān)胸，逐層縫合胸腔，逐漸撤停呼吸機(jī)，待大鼠呼吸穩(wěn)定，清醒后拔出氣管插管，放入籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)4周（室內(nèi)溫度24℃～26℃）。

造模成功的18只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組（每組6只）：對(duì)照組、利拉魯肽低劑量組（LS組）和利拉魯肽高劑量組（HS組），另取6只作假手術(shù)組僅穿線(xiàn)，不結(jié)扎，余操作同建模過(guò)程。LS組和HS組分別腹腔皮下注射利拉魯肽70 μg/（kg·d）和140 μg/（kg·d），假手術(shù)組和對(duì)照組均注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)2周。

1.3 超聲心動(dòng)圖評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)及功能

建模前及建模后4周，大鼠在戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖（飛利浦IE33，12 MHz探頭）檢查，以胸骨旁短軸切面，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）、左心室短軸縮短率（LVFS）和左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。心肌收縮力參數(shù)根據(jù)同一水平短軸切面獲取，每個(gè)切面記錄兩個(gè)圖像，每個(gè)參數(shù)參量記錄連續(xù)3個(gè)心臟搏動(dòng)。

1.4 急性心肌梗死大鼠模型心臟標(biāo)本采集

4周后，所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，迅速剪取心臟，4℃生理鹽水反復(fù)沖洗殘余血液，濾紙吸干，除去右心室、心房和大血管。在左心室長(zhǎng)軸中點(diǎn)處垂直于長(zhǎng)軸將左心室一分為二，心尖側(cè)的一半心肌組織經(jīng)4%甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制備厚度5 μm的組織切片。蘇木精-伊紅染色（HE染色）光鏡下觀(guān)察心肌組織形態(tài)學(xué)變化，Masson染色觀(guān)察膠原沉積情況和免疫組織化學(xué)染色觀(guān)察血管新生的影響；另一半心肌組織置于液氮中保存，用于蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)。

1.5 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）測(cè)定

Masson膠原染色，膠原纖維染呈藍(lán)色，肌肉呈紅色，200倍光鏡下在心肌梗死邊緣區(qū)隨機(jī)拍取5個(gè)視野。Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)，即CVF=心肌膠原面積/所測(cè)同視野組織總面積×100%。

1.6 免疫組織化學(xué)法測(cè)定心肌梗死邊緣區(qū)微血管密度（MVD）和VEGF蛋白表達(dá)水平

心肌組織切片常規(guī)脫蠟、水化及封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，按照羊超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)，按 1∶100 稀釋?zhuān)渭右豢梗–D31/VEGF），孵育過(guò)夜,依次滴加試劑 1(聚合物輔助劑)、試劑2(辣根酶標(biāo)記抗山羊IgG多聚體)，DAB 顯色，CD31陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈棕黃色顆粒，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。顯微鏡下觀(guān)察左心室心肌梗死邊緣區(qū)CD31陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況，400倍視野下計(jì)算單位面積內(nèi)CD31陽(yáng)性微血管數(shù)目，在心肌梗死邊緣區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野，取平均值，即MVD。CD31 陽(yáng)性微血管計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)蝹€(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、微小血管均予計(jì)數(shù)，帶有較厚肌層區(qū)域的血管均不計(jì)數(shù)。VEGF蛋白的表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性反應(yīng)。采用彩色病理軟件進(jìn)行圖像定量分析，每張切片在400倍光鏡下隨機(jī)選擇心梗邊緣區(qū)5個(gè)視野進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算出平均光密度（MOD）值，MOD值越高，蛋白表達(dá)量越多。

1.7 Western blot法檢測(cè)心肌梗死邊緣區(qū)VEGF蛋白的含量

提取心臟組織標(biāo)本總蛋白做Western blot，采用10%聚丙烯酰胺凝膠分離目的蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入一抗 VEGF抗體(濃度1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜。洗膜后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行雜交(濃度1：3000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜，電化學(xué)發(fā)光（ECL）法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，暗室曝光成像，用Image J分析目標(biāo)條帶的MOD值。以GAPDH（使用濃度1∶3000）作為內(nèi)參照，比較不同處理后蛋白表達(dá)的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖對(duì)大鼠心功能的評(píng)估（表1）

在急性心肌梗死模型建立前，超聲心動(dòng)圖測(cè)得LVEDd、LVESd、LVEF及LVFS在各組大鼠之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。建模后4周后對(duì)照組大鼠心室前壁運(yùn)動(dòng)減弱或消失，心室收縮功能的指標(biāo)LVEF、LVFS較假手術(shù)組顯著降低，LVEDd及LVESd則顯著升高（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，LS組和HS組LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.01），而LVEDd及LVESd有所下降（P＜0.05），且HS組較LS組改善更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 建模 4周后各組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果（n=6,±s）

2.2 心肌組織病理改變

HE染色結(jié)果顯示（圖1），假手術(shù)組染色均勻，心肌排列整齊；對(duì)照組著色深淺不均勻，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列紊亂，間隙增寬，部分肌溶灶；LS組著色深淺欠均勻，較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列不規(guī)則，少數(shù)肌溶灶；而HS組著色深淺略不均勻，較少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維排列尚規(guī)則，極少肌溶灶。

2.3 心肌膠原改變

Masson染色顯示（圖1），假手術(shù)組心肌間質(zhì)少許藍(lán)色膠原沉積；對(duì)照組梗死區(qū)心肌結(jié)構(gòu)基本消失，代之大片染成藍(lán)色的膠原纖維，其間可見(jiàn)極少殘存心肌細(xì)胞；LS組梗死區(qū)膠原纖維較對(duì)照組減少；HS組梗死區(qū)減少更明顯，其間可見(jiàn)較多存活心肌。與假手術(shù)組比較，對(duì)照組梗死周邊區(qū)膠原容積分?jǐn)?shù)明顯增加（P＜0.01）；與對(duì)照組比較，LS組和 HS組 CVF 均明顯下降 [（（34.78±4.33）%vs（41.72±4.86）%；（29.96±3.60）% vs（41.72±4.86）%；P均＜0.01]，且HS組下降更明顯[（29.96±3.60）% vs （34.78±4.33）% ，P＜0.05]。

2.4 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)MVD的水平

在400倍光鏡下計(jì)數(shù)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31陽(yáng)性數(shù)目。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組、LS組、HS組大鼠心肌梗死周邊區(qū)CD31陽(yáng)性微血管明顯增多（P＜0.01）；與對(duì)照組和假手術(shù)組相比，LS組、HS組心肌組織MVD明顯增多（P＜0.01），且HS組較LS組更加明顯（P＜0.01，圖 2、表 2）。

2.5 各組大鼠心肌組織VEGF蛋白表達(dá)水平

免疫組化染色結(jié)果可見(jiàn)VEGF蛋白在心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿均有表達(dá)，各組大鼠梗死周邊區(qū)均可見(jiàn)VEGF蛋白表達(dá)，對(duì)照組VEGF蛋白表達(dá)雖高于假手術(shù)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而LS組和HS組VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組和對(duì)照組（P＜0.01），且HS組VEGF蛋白表達(dá)高于 LS組（P＜0.01，圖 2、表 2）。

圖1 各組大鼠心肌HE染色（×200）和Masson染色（×200）結(jié)果

圖2 各組大鼠心肌免疫組化染色：CD31結(jié)果（×400）和VEGF結(jié)果（×400）

表2 各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)MVD及VEGF蛋白比較（n=6,±s）

Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，假手術(shù)組和對(duì)照組心肌組織VEGF蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），與對(duì)照組相比，LS組和HS組VEGF蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.01），與LS組相比，HS組VEGF蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，圖 3）。

圖3 免疫蛋白印跡法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)量

3 討論

糖尿病伴冠心病的患者常表現(xiàn)為無(wú)痛性心肌梗死，病情嚴(yán)重，不易被察覺(jué)，預(yù)后更差。因此，GLP-1及其類(lèi)似物作為具有心血管益處的降糖藥受到廣泛關(guān)注。

研究表明，GLP-1可增強(qiáng)自體干細(xì)胞修復(fù)缺血損傷的能力，可促進(jìn)干細(xì)胞向心肌分化，減輕凋亡，促進(jìn)心肌干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)等來(lái)促進(jìn)心肌梗死后的恢復(fù)，在旁分泌的生長(zhǎng)因子中，VEGF不僅能夠促進(jìn)干細(xì)胞向心肌分化，還能促進(jìn)毛細(xì)血管網(wǎng)的形成，而且VEGF的濃度與GLP-1劑量呈正比[9]。本研究也證實(shí)，利拉魯肽可促進(jìn)大鼠心肌梗死后VEGF蛋白表達(dá)及毛細(xì)血管新生，且與劑量呈一定關(guān)系。利拉魯肽作為GLP-1受體激動(dòng)劑，可通過(guò)激活GLP-1R/PI3K/Akt等通路，改善缺氧復(fù)氧引起的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10]。也可降低p53和Caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)超氧化物歧化酶的表達(dá)，從而減輕心肌缺血再灌注損傷，減少心肌梗死面積[11]。糖尿病患者早期應(yīng)用GLP-1類(lèi)似物也可減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[12]，利拉魯肽心血管結(jié)局長(zhǎng)期評(píng)估試驗(yàn)（LEADER）系列研究顯示，其可顯著降低2型糖尿病患者的主要不良心血管事件發(fā)生率，大血管事件與微血管事件發(fā)生率以及死亡率均有降低[13,14]。但是，最新發(fā)表在JAMA上的臨床研究顯示，無(wú)論是否合并糖尿病，利拉魯肽不能降低心力衰竭患者的再住院率及死亡率[15]，可能與心室早已發(fā)生不可逆性重構(gòu)有關(guān)。而在心肌梗死患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）前即開(kāi)始予利拉魯肽治療，可提高患者PCI后的LVEF[16]。本研究在大鼠急性心肌梗死后即予利拉魯肽干預(yù)，也證明可改善心功能。

本研究還顯示，對(duì)照組MVD及VEGF蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組，可能與心肌梗死后的缺血、缺氧環(huán)境能刺激VEGF合成增多，促進(jìn)血管新生，重建心肌血流，但這種保護(hù)性應(yīng)答通常不足以恢復(fù)生理水平的心肌灌注，而給予利拉魯肽干預(yù)后MVD及VEGF蛋白表達(dá)明顯增加，表明利拉魯肽可能通過(guò)增加VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)心肌血管新生，保護(hù)心臟。而且由HE和Masson染色可見(jiàn)，利拉魯肽還可能通過(guò)減少炎癥反應(yīng)，減輕心肌纖維化，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，且呈劑量依賴(lài)性。

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2017-03-14）

（編輯：許菁）

Effects of Liraglutide on Angiogenesis and Myocardium Protection in Acute Myocardial Infarction Rats With its Mechanisms

LU Hui-fang, FANG Yi-jie, LI Yue, HUANG Yong-quan, LUO Li-yun, LIN Xiu-fang.

Department of Cardiology, the Fifth Aff i liated Hospital of Sun Yat-Sen University, Zhuhai (519000), Guangdong, China

LIN Xiu-fang, Email: linxiufang_126@126.com

Objective: To observe the effects of liraglutide on angiogenesis and myocardium protection in acute myocardial infarction (AMI) rats with its mechanisms.

Methods: Rat’s AMI model was established by left anterior descending of coronary ligation. AMI rats were randomly divided into 3 groups: Control group, the rats received subcutaneous injection of normal saline, Low dose (LS) group and High dose (HS) group, rats received subcutaneous injection of liraglutide 70μg/(kg?d) and 140μg/(kg?d) respectively; in addition, Sham operation group, rats received normal saline. n=6 in each group, all animals were treated for 2 weeks. 4 weeks later, cardiac structure and function were assessed by echocardiography, morphological changes of myocardium were observed by HE staining, collagen volume fraction (CVF) was calculated by Masson staining, myocardial microvessel density(MVD) and protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in marginal zone of infracted region were detected by immunohistochemistry, VEGF protein level was examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Sham operation group, Control group showed decreased LVEF, LVFS and increased LVEDd,LVESd, CVF, all P＜0.01; while MVD and VEGF protein level were similar between 2 groups, P＞0.05. Compared with Control group, LS group and HS group had obviously increased LVEF, LVFS, P＜0.01 and decreased LVEDd, LVESd, P＜0.05,obviously decreased CVF, P＜0.01; obviously elevated MVD and VEGF protein level, P＜0.01. Compared with LS group, HS group presented obviously increased LVEF, LVFS, P＜0.01 and decreased LVEDd, LVESd, CVF, P＜0.05; elevated MVD and VEGF protein level, P＜0.01 or P＜0.05.

Conclusion: Liraglutide could improve angiogenesis in AMI rats which might be related to increased VEGF expression and reduced collagen deposition; therefore improve left ventricular systolic function for cardiac protection. The effect had certain relationship to liraglutide dosage.

Myocardial infarction; Angiogenesis; Liraglutide

519000 廣東省珠海市，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 心血管內(nèi)科（盧慧芳、李玥、羅禮云、林岫芳），放射科（方義杰），超聲科（黃涌泉）

盧慧芳 碩士研究生 主要從事心血管疾病的臨床與基礎(chǔ)研究 Email: luhf99168@163.com 通訊作者：林岫芳 Email：linxiufang_126@126.com

R54

A

1000-3614（2017）11-1117-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.018

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1117.)