刺桐葉過氧化物酶催化氧化內(nèi)分泌干擾物雙酚A的研究

趙廣華,向運(yùn)蓉,洪 健,肖 強(qiáng)

(湖北民族學(xué)院 林學(xué)園藝學(xué)院,湖北 恩施 445000)

刺桐葉過氧化物酶催化氧化內(nèi)分泌干擾物雙酚A的研究

趙廣華,向運(yùn)蓉,洪 健,肖 強(qiáng)*

(湖北民族學(xué)院 林學(xué)園藝學(xué)院,湖北 恩施 445000)

雙酚A(BPA)是目前世界上使用最廣泛的工業(yè)化合物之一,該酚類化合物是內(nèi)分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs)的重要成員之一; BPA對水生生物和人體細(xì)胞具有雌激素作用和生物學(xué)毒性.EDCs具有生物富集、效用持久以及生理學(xué)響應(yīng)濃度極低等特性,使得其在水體中很難通過傳統(tǒng)水處理技術(shù)去除.基于酶催化高效、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)以及刺桐葉片中具有較高的過氧化物酶活性,為了開發(fā)其葉片經(jīng)濟(jì)價值,探討刺桐葉片過氧化物酶在清除水體中EDCs中應(yīng)用前景.考察了刺桐葉片過氧化物酶對水體中EDCs類物質(zhì)BPA的去除效果及反應(yīng)條件.結(jié)果表明,經(jīng)過3 h,該酶對BPA清除達(dá)99.7%,最佳清除能力的pH范圍為7～9,溫度為25～50 ℃,最適酶活性單位為15 U/mL,最佳H2O2/BPA摩爾濃度之比為5.

過氧化物酶;刺桐;雙酚A;內(nèi)分泌干擾物

刺桐(Erythrinavariegata)是多年生落葉喬木,其樹皮或根皮可入藥,在醫(yī)藥方面應(yīng)用較為廣泛[1];刺桐樹形美觀、花色艷麗,可作為園林觀賞植物.刺桐季相變化豐富,可以作為季節(jié)性指標(biāo).在刺桐整個生長期中,大量葉片凋落,未產(chǎn)生任何經(jīng)濟(jì)價值;目前關(guān)于刺桐葉片的研究,主要是關(guān)于其鮮葉汁用于鎮(zhèn)靜和止痛的研究[2].通過前期研究發(fā)現(xiàn),刺桐葉過氧化物酶具有較高活性、穩(wěn)定性較好等特點(diǎn).

過氧化物酶(Peroxidase,POD)是一種以過氧化氫為電子受體的酶[3-4].POD是通過催化底物發(fā)生氧化反應(yīng)改變結(jié)構(gòu),引起底物理化性質(zhì)發(fā)生變化的生物催化劑,它廣泛分布于生物體內(nèi)[4].POD的反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、高效、專一的特點(diǎn).其在植物細(xì)胞壁形成、生長激素失活、次生物質(zhì)代謝以及防衛(wèi)反應(yīng)應(yīng)答等多種生理過程中發(fā)揮重要作用.在現(xiàn)今已發(fā)表的論文中發(fā)現(xiàn),POD對氯酚、甲氧基苯酚、鹵代胺等物質(zhì)的清除能力較強(qiáng)[5].此外,POD催化活性在工業(yè)上也用于石化、造紙、紡織等行業(yè)廢水中酚類和芳香胺類污染物高效降解.國內(nèi)外許多學(xué)者開展了辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和大豆過氧化物酶(soybean peroxidase,SBP)用于酚類物質(zhì)清除的條件優(yōu)化、動力學(xué)特性和反應(yīng)機(jī)理研究[6-7].展現(xiàn)了POD在去除環(huán)境水體中微量酚類污染物中的良好前景.

雙酚A(Bisphenol A,BPA)是一種重要的化工原料,廣泛應(yīng)用于生活塑料制品、罐頭食品及食品金屬包裝物表面涂層等的制造過程.BPA的廣泛使用給環(huán)境和飲用水帶來了嚴(yán)重污染.2001年,有研究者發(fā)現(xiàn),德國飲用水BPA含量范圍為 300pg/L～2 ng/L;2004年,對我國北京某典型污水廠的調(diào)查顯示,城市污水中BPA含量最高可達(dá)825 μg/L[8].有研究表明[9],BPA屬低毒性化學(xué)物;也是屬于內(nèi)分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs)的一種,EDCs能產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾物效應(yīng),從而對動物和人類健康產(chǎn)生一些潛在的不利影響.有資料[10]顯示BPA 具有一定的胚胎毒性和致畸性,可明顯增加動物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌癥的發(fā)生,科學(xué)家以中國化工廠里暴露于BPA 環(huán)境中工作5年以上的男性工人作為研究對象,5年之內(nèi)沒有暴露于BPA環(huán)境中的工人作為對照,研究結(jié)果表明,暴露于BPA環(huán)境中的男性工人發(fā)生勃起功能障礙的風(fēng)險約為對照組的4倍,說明BPA對人體健康的危害比較大.

鑒于動物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果,BPA對人體毒性已受到廣泛關(guān)注.作為普遍使用的工業(yè)原料之一,BPA對環(huán)境水體污染已被諸多學(xué)者研究證實(shí);如何對水體中BPA進(jìn)行有效經(jīng)濟(jì)的清除就顯得極其重要和迫切.目前對環(huán)境中BPA的消除主要采用生物降解、光催化的化學(xué)降解、物理吸附以及生物酶降解等方法,其中,POD催化的降解方法具有高效、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注.其中以HRP為代表的POD酶類已被證實(shí)可以有效去除芳香類化合物,如烷基酚、苯酚和BPA[6].

優(yōu)化刺桐葉POD去除溶液中BPA的酶催化過程,也是為了降低使用POD處理廢水的運(yùn)營成本,探索新的具有較強(qiáng)清除能力的POD植物來源,優(yōu)化反應(yīng)條件,對于減少酶的要求具有重要價值.通過實(shí)驗(yàn)得出清除溶液中BPA的最佳H2O2/BPA摩爾濃度比值、pH、溫度等的反應(yīng)條件,為工業(yè)生產(chǎn)提供相應(yīng)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以湖北民族學(xué)院植物園內(nèi)種植的刺桐(Erythrinavariegata)成熟葉為原料.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺桐過氧化物粗酶液的提取 稱取新鮮刺桐葉片5 g,自來水洗凈后,用蒸餾水沖洗,再用吸水紙吸干表面水分,置于預(yù)冷的研缽中,分次加入8 mL含2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)和2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸緩沖液(50 mmol/L,pH 7.8)在冰浴上研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入離心管中,4 ℃、12 000 g條件下離心10 min,上清液即為粗酶提取液.

1.2.2 酶活性測定

1)反應(yīng)混合液配制:取50 mL PBS緩沖液于燒杯中,加入28 μL愈創(chuàng)木酚于恒溫式磁力攪拌器上加熱攪拌,直至愈創(chuàng)木酚完全溶解.待溶液冷卻后加入19 μL 30%的H2O2,攪拌混勻后保存于冰箱中備用.

2)酶活性測定:在分光光度計(jì)中,用時間掃描[11],以蒸餾水為對照調(diào)零后,取3 mL反應(yīng)液并加入10 μL酶液后測定OD 470值在180 s內(nèi)的變化,每間隔3 s記錄一次,共記錄60個數(shù)值,將測定結(jié)果導(dǎo)出,當(dāng)其相關(guān)性達(dá)到0.999時,分析其斜率(k)值.

1.2.3 酶活力計(jì)算 以每分鐘 OD值變化(升高)0.1為1個酶活性單位(U),按下式計(jì)算活性[12]:

POD活性=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0.1×t) (U/g)

ΔA470:為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化;W為樣品鮮質(zhì)量(g);t為反應(yīng)時間(min);Vt為提取酶液總體積(mL);Vs為測定時取用酶液體積(mL).

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳清除酶活性單位確定

在預(yù)試驗(yàn)中,取新鮮葉片清洗、研磨、多層紗布過濾、離心、測酶活,得粗酶液活性為312 U/mL.在隨后的BPA清除實(shí)驗(yàn)中,加酶600 U(即取粗酶液1.923 mL),在 pH=6,H2O2/BPA為2的條件下,將反應(yīng)混合物置25 ℃的恒溫水浴磁力攪拌器中進(jìn)行反應(yīng).分別在1、3、5、15、45、90、120和180 min取樣,用甲醇和硫酸鋁鉀終止反應(yīng),測定BPA含量.采用UPLC-TOF-MS測定[13],結(jié)果顯示在120 min時BPA被完全清除.

在實(shí)驗(yàn)過程中,嘗試使用不同活性的POD進(jìn)行實(shí)驗(yàn),注意采用單一變量法控制其他變量一致,在此情況下,確定最佳反應(yīng)酶活性單位為15 U/mL.

2.2 最佳清除pH確定

圖1 不同pH對BPA清除率的影響Fig.1 Effects of different pH value on the removal rate of BPA

設(shè)定pH為 6、7、8、9、10、11、12和13,控制溫度、酶活性、H2O2摩爾濃度相同,在此條件下,對清除速度,底物完全清除時間進(jìn)行比較.在實(shí)驗(yàn)中,最初采用50 mmol/L的磷酸緩沖液,并將溫度設(shè)定為25 ℃(在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上操作),酶活性單位用15 U/mL,H2O2/BPA為2,分別測出pH為6、7、8、9、10、11、12、13時的反應(yīng)情況,其中pH 6～8采用磷酸鹽緩沖體系,pH 9采用硼酸鹽緩沖液,得出結(jié)論為當(dāng)pH等于7、8、9時,酶反應(yīng)的活性均比較高,所以之后又用甘氨酸配置溶液,用NaOH滴定配置pH 10、pH 11、pH 12和pH 13的緩沖溶液,在之前的反應(yīng)條件下測得相應(yīng)pH值的酶反應(yīng)體系的清除效果.

圖2 不同溫度對BPA清除的影響Fig.2 Effects of different temperature on the removal rate of BPA

圖1為不同pH條件下,于1、3、5、15、45、90、120、180 min分別取樣測定反應(yīng)體系中剩余BPA含量結(jié)果.從圖1中可以看出在pH 7～9時,90 min時BPA被完全清除,清除速率較其它pH條件更快.

2.3最佳清除溫度確定

設(shè)定溫度為25、30、35、40、50、60 ℃,分別在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上操作,控制pH等于7、酶活性為15 U/mL、H2O2/BPA為2,反應(yīng)時間3 h,在此反應(yīng)體系中,對清除速度,底物完全清除時間進(jìn)行比較,從圖2可見,在25～50 ℃范圍內(nèi),BPA清除率均達(dá)到100%.在25、30、40 ℃的溫度條件下,分別反應(yīng)3 h和6 h后,測得剩余酶活如下(200 μL 待測液+2 800 μL愈創(chuàng)木酚反應(yīng)混合液).

表1 反應(yīng)3 h、6 h剩余酶活

表1表明,在溫度為25 ℃的條件下,酶活的穩(wěn)定性是最大的,而且其清除比率較高,在反應(yīng)90 min時就完全清除,所以,將對BPA的最佳清除溫度確定為25 ℃.

2.4 最佳清除H2O2/BPA比值確定

研究H2O2/BPA摩爾濃度之比因素時,設(shè)定比值分別為0.2、0.5、0.8、1.2、2、3、5倍,控制溫度、酶活性、pH相同,在此條件下,對清除速度,底物完全清除時間進(jìn)行比較.

圖3 不同H2O2/BPA比值對BPA的清除影響Fig.3 Effects of mole ratio of H2O2 to BPA on the removal rate of BPA

將溫度設(shè)定為25 ℃(在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上操作),酶活性單位用15 U/mL,pH為7,分別測出當(dāng)H2O2比值分別為0.2、0.5、0.8、1.2、2、3、5倍時的清除效果,如圖3所示,當(dāng)H2O2比值為5倍時,45 min時,BPA被完全清除,故得出較好的清除BPA的H2O2/BPA比值為5.

3 討論

經(jīng)過三個多月的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理,提取新鮮刺桐葉片中POD與BPA反應(yīng),探索最佳的反應(yīng)條件,得出最適刺桐葉POD活性單位為15 U/mL,最佳pH范圍為7～9,適宜溫度范圍為25～50 ℃,但在25 ℃酶活性最穩(wěn)定,所以確定的最適反應(yīng)溫度為25 ℃,此外,H2O2/BPA摩爾濃度之比最適為5.

對于內(nèi)分泌干擾物的相關(guān)清除實(shí)驗(yàn)中,國內(nèi)外已經(jīng)有許多學(xué)者探討了不同來源的POD清除酚類和胺類物質(zhì)的性質(zhì).在徐芝勇[14]對SBP的研究中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以愈創(chuàng)木酚為底物的條件下,最佳反應(yīng)的pH范圍在5.0～5.2;在馮義平等[5]關(guān)于POD催化去除水中酚類內(nèi)分泌干擾物的研究進(jìn)展一文中,發(fā)現(xiàn)HRP可以在pH為5.0、7.0、8.0的條件下迅速的清除BPA;這與本實(shí)驗(yàn)中刺桐過氧化物酶對BPA的清除最佳pH值相近,所以可以看出,本次實(shí)驗(yàn)結(jié)論與前面相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)論相近,在工業(yè)上具有實(shí)際生產(chǎn)的價值.

此外,在馮義平等的酚類物質(zhì)清除實(shí)驗(yàn)中,HRP對BPA的最佳清除溫度為20 ℃,催化的速度與HRP的劑量有極大關(guān)系;而本實(shí)驗(yàn)確定最適反應(yīng)溫度為25 ℃,與前面的研究結(jié)果相近.所以不難看出,在溫度適宜時,不同來源的POD對內(nèi)分泌干擾物BPA的清除效果明顯,有利于工業(yè)生產(chǎn),本實(shí)驗(yàn)中最佳反應(yīng)溫度為接近常溫的25 ℃,在運(yùn)用中可以于室溫條件下進(jìn)行,有利于降低運(yùn)行成本.

適宜含量的H2O2在實(shí)驗(yàn)中起到氧化底物的作用,有H2O2存在的情況下,POD能催化酚類物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生茶褐色物質(zhì),當(dāng)含量低于最適H2O2時,適當(dāng)?shù)脑黾親2O2,實(shí)驗(yàn)速度會明顯改善,當(dāng)高于最適H2O2時,會抑制反應(yīng)的進(jìn)行.之前的學(xué)者也探討了H2O2對反應(yīng)的影響.HRP與激素類物質(zhì)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中[6],最適的H2O2/BPA摩爾濃度之比為2,而本實(shí)驗(yàn)中最適的H2O2/BPA摩爾濃度之比為5.表明在不同的反應(yīng)中,對過氧化氫的需求有一定差異,所以在實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格的控制H2O2的劑量,以防把握不當(dāng),影響反應(yīng)進(jìn)行.

之前的學(xué)者在類似的實(shí)驗(yàn)中探討了HRP與H2O2對BPA的清除效果.馮義平等[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該反應(yīng)的最適pH值為6.0,反應(yīng)最佳溫度為30 ℃,最佳的H2O2/BPA值為2,經(jīng)過120 min的降解,0.5 U/mL的HRP對BPA的清除效果最好.Duarte-Va’zquez等[15]關(guān)于TP對酚類物質(zhì)的降解效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在溫度為25 ℃,pH為4～8,H2O2/BPA濃度之比為2的條件下,經(jīng)過3 h的反應(yīng),1.28 U/L的TP對0.5 mmol/L的酚類物質(zhì)清除率可達(dá)到85%以上.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相近,表明刺桐葉過氧化物酶也具有工業(yè)化運(yùn)用的良好基礎(chǔ).

由于BPA在現(xiàn)今社會,尤其是在工業(yè)生產(chǎn)上運(yùn)用相當(dāng)?shù)膹V泛,其毒性已被科學(xué)研究證實(shí)[9].與男性功能、小白鼠患哮喘相關(guān)聯(lián),在流行病學(xué)調(diào)查中顯示孕婦在妊娠早期受BPA影響可能會導(dǎo)致嬰兒哮喘.BPA還是一種內(nèi)分泌干擾物的重要成分,在多種水體中廣泛存在,在生物富集性、持久性方面對生物的影響較大,所以對BPA的清除比較迫切.

對酶的失活而言,酶失活是工業(yè)運(yùn)用中比較常見的困擾,是限制工業(yè)運(yùn)用的主要因素之一,同時也是不可避免的,所以,探索酶失活的原因及相應(yīng)處理措施是刻不容緩的.需要經(jīng)過仔細(xì)的研究和分析探索,對其失活進(jìn)行防治,將成本降到最低,將效果提到最佳.在本實(shí)驗(yàn)中,刺桐葉POD失活的原因之一是,酶與BPA反應(yīng)產(chǎn)生大分子的聚合物,聚合物的溶解性比較的低,所以會吸附到刺桐葉過氧化物酶的表面,影響酶與底物的接觸面積.使得底物與酶的接觸位點(diǎn)減少,使酶漸漸失活[16].在酶反應(yīng)的過程中,對失活的防止可以外加一些輔助物質(zhì),以此延長酶的反應(yīng)周期.比如一定量的凝膠、聚乙二醇(PEG)等物[17].此外,高親水性的明膠也可以有效的增長酶反應(yīng)的時間,達(dá)到提高效率的作用.

目前,對于刺桐葉POD的清除效果研究未見報道,而以刺桐作為實(shí)驗(yàn)材料簡便易行,容易獲得,清除效果也比較明顯,所以本研究對于解決時下含有機(jī)污染物廢水的處理和達(dá)標(biāo)排放具有顯著意義.

本研究對于今后選用有開發(fā)價值的材料及方法具有指導(dǎo)意義,對高效經(jīng)濟(jì)的酶的篩選具有明顯價值,目前,利用酶的氧化催化作用對酚類的處理是近年來受到廣泛關(guān)注的新方法,但本研究與現(xiàn)實(shí)應(yīng)用還有一定距離,下一步將致力于探索相關(guān)反應(yīng)的工作機(jī)理,探索該工藝在實(shí)際污水處理中的應(yīng)用,充分發(fā)掘刺桐葉POD的應(yīng)用價值.

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責(zé)任編輯：高山

RemovalofEndocrineDisruptorsBPAbyErythrinavariegataLeavesPeroxidase

ZHAO Guanghua,XIANG Yunrong,HONG Jian,XIAO Qiang*

(School of Forestry and Horticulture,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China)

Currently,BPA is one of the most widely used industrial compounds,and the phenolic compounds are one of the important members of endocrine disruptors(Endocrine Disrupting Chemicals,namely EDCs).A series of studies have shown that BPA has estrogen effect and biological toxicity to aquatic organisms and human cells.As EDCs have characteristics of bioaccumulation,utility lasting and extremely low physiological response and so on,the conventional technology of water treatment is very difficult to sweep away the EDCs.Based on the advantages of enzyme catalyzed in high efficiency,moderate reaction conditions and the higher peroxidase activity in the leaves,in order to develop the leaf economic value,this study investigated the application prospect of the peroxidase in the leaves ofErythrinavariegatain the removal of water.We surveyed the removal effect and reaction conditions of BPA byErythrinavariegataleaves peroxidase in the water.The results showed that the removal efficiency of BPA catalysed byErythrinavariegataleaves peroxidase was 99.7% after three hours,and the best pH range of removal ability was 7～9,the temperature of 25～50℃,the optimum substrate concentration was 15 U/mL,and the best ratio of the molar concentration of H2O2/BPA was 5.

Peroxidase;Erythrinavariegata;Bisphenol A;EDCs

2017-05-25.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260057;31460203).

趙廣華(1992-),男,碩士生,主要從事水土保持與荒漠化防治的研究;*

:肖強(qiáng)(1970-),男,博士,教授,主要從事植物生理生態(tài)的研究.

1008-8423(2017)04-0366-04

10.13501/j.cnki.42-1569/n.2017.12.002

Q554.6

A