斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因的克隆及其表達(dá)分析

楊其彬 李運(yùn)東 江世貴 黃建華 姜 松 邱麗華朱彩艷 周發(fā)林

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣州 510300; 2. 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510300)

斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因的克隆及其表達(dá)分析

楊其彬1,2李運(yùn)東1,2江世貴1,2黃建華1,2姜 松1,2邱麗華1,2朱彩艷1,2周發(fā)林1,2

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣州 510300; 2. 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510300)

為了研究斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能, 根據(jù)原實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon) cDNA文庫(kù)得到的EST序列, 利用RACE技術(shù)獲得了斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因(PmAmy)的cDNA全長(zhǎng)序列。該基因序列全長(zhǎng)2465 bp, 包括2175 bp的開放閱讀框, 編碼724個(gè)氨基酸, 分子總量為78.9 kD, 理論等電點(diǎn)為4.66。PmAmy包含一個(gè)α-淀粉酶家族保守的A結(jié)構(gòu)域(Thr34-Ser410)和一個(gè)C結(jié)構(gòu)域(Glu420-Ala496)。PmAmy氨基酸序列與其他物種的相似性為47%—99%, 利用PmAmy構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的親緣關(guān)系最近。基因表達(dá)結(jié)果顯示PmAmy在肝胰腺組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P＜0.05)。斑節(jié)對(duì)蝦PmAmy基因在卵巢發(fā)育的過程中均有表達(dá), 表達(dá)量有所變化, 雖然沒有發(fā)現(xiàn)顯著性的差異(P=0.09)。斑節(jié)對(duì)蝦PmAmy在整個(gè)生長(zhǎng)階段的檢測(cè)中都有表達(dá), 其中幼體發(fā)育過程中存在顯著性差異,糠蝦時(shí)期PmAmy表達(dá)量顯著高于無節(jié)幼體、溞狀幼體和仔蝦時(shí)期(P＜0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步說明了PmAmy可能與斑節(jié)對(duì)蝦的幼體發(fā)育相關(guān)。

斑節(jié)對(duì)蝦; α-淀粉酶; 基因克隆; 基因表達(dá); 幼體發(fā)育

α-淀粉酶(α-Amylase)是a-1,4-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶(α-1,4-glucan-glucanhydrolase)的簡(jiǎn)稱, 屬于糖基水解酶13家族(Glycosyl hydrolase family 13),即a-淀粉酶家族[1]。甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等過程所需的營(yíng)養(yǎng)素基本來源于消化酶對(duì)餌料或儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化及機(jī)體的重新合成。甲殼動(dòng)物肝胰腺中的多種酶類的作用也決定了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力, 大量研究表明生物的高生長(zhǎng)率、低死亡率和體重等都與消化能力有著緊密的聯(lián)系[2]。α-淀粉酶是甲殼動(dòng)物消化腺中一種重要的碳水化合物水解酶類, 它以隨機(jī)作用的方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的任意α-1,4葡萄糖苷鍵,生成麥芽糖、葡萄糖和低聚糖等化合物供予機(jī)體,與其他類型如β-淀粉酶家族、葡萄糖糖化酶、異淀粉酶等水解淀粉的酶類相比, α-淀粉酶類具有更快的作用[3], 其分泌機(jī)能的強(qiáng)弱直接影響生物對(duì)食物的消化能力, 從而影響生長(zhǎng)繁殖等其他生理過程[4]。

目前α-淀粉酶基因已從多種生物中克隆得到并進(jìn)行研究, 如黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)[5]、斑馬魚(Danio rerio)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[6]、長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)[7]、合浦珠母貝(Pinctada fucata)[8]等。對(duì)α-淀粉酶功能的研究也有很多報(bào)道, 如Vanwormhoudt等[9]測(cè)定了多種從甲殼動(dòng)物肝臟提取物的α-淀粉酶活性, 發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶活性在一些蝦蟹類(Penaeid, Brachyura, Anomura)中很高, 而在濱蟹屬(Carcinus)、龍蝦(Palinurus)等品種中非常低。在魚類上有研究發(fā)現(xiàn), 淀粉酶活性水平與腸道填充度和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)條件相關(guān), 魚類淀粉酶水平飽腹時(shí)較高, 幼魚比成魚高[10—12]。Huvet等[13]對(duì)太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)α-淀粉酶基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀、消化特性的相關(guān)性進(jìn)行了研究,α-淀粉酶基因?qū)δ迪牭臄z食及吸收效率有顯著影響, 進(jìn)而影響牡蠣的生長(zhǎng)。此外, Prudence等[14]的研究發(fā)現(xiàn), α-淀粉酶基因的多態(tài)性與牡蠣的生長(zhǎng)顯著相關(guān), 并認(rèn)為淀粉酶基因的分子標(biāo)記在育種中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。對(duì)蝦上的現(xiàn)有研究表明α-淀粉酶是對(duì)蝦的重要消化酶, α-淀粉酶基因?qū)ιL(zhǎng)發(fā)育過程具有重要影響, 被認(rèn)為是與對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀相關(guān)的重要候選基因之一[15,16]。

斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)是對(duì)蝦類中體形最大的一種對(duì)蝦, 具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的優(yōu)點(diǎn), 是當(dāng)前世界上三大蝦類養(yǎng)殖品種之一,也是中國(guó)和東南亞地區(qū)重要的傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)對(duì)蝦資源。因此本研究對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因cDNA序列克隆分析, 初步探究該基因?qū)Π吖?jié)對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育的影響和潛在生物學(xué)功能, 為下一步α-淀粉酶基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)篩選及其與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析、分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 斑節(jié)對(duì)蝦來源于南海水產(chǎn)研究所(深圳基地)斑節(jié)對(duì)蝦遺傳育種中心, 在水溫(25±2)℃、鹽度為30‰的循環(huán)水池中暫養(yǎng)3d后取樣, 用于cDNA克隆及組織表達(dá)等實(shí)驗(yàn)。選取雌性斑節(jié)對(duì)蝦3尾(體質(zhì)量20—50 g)取組織樣品, 包括腦、眼柄、鰓、心、肝胰腺、腸、胃、神經(jīng)、肌肉、卵巢等組織用于組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征[17,18]初步判斷卵巢發(fā)育期, 取斑節(jié)對(duì)蝦(體質(zhì)量20—200 g)發(fā)育為Ⅰ期至Ⅴ期的卵巢組織用于熒光定量實(shí)驗(yàn)。參照江世貴等[19]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦生命史的研究, 分別采集斑節(jié)對(duì)蝦的無節(jié)幼體、溞狀幼體、糠蝦和仔蝦時(shí)期的幼體, 和后期仔蝦、幼蝦、亞成蝦和成蝦生長(zhǎng)階段的肝胰腺組織, 用于各生長(zhǎng)階段的基因定量表達(dá)實(shí)驗(yàn)。以上樣品組織都采用RNAlater?Solution保存, 4℃過夜后–80℃保存。

實(shí)驗(yàn)試劑: RNAlater Tissue Collection購(gòu)自普博生物公司; RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)購(gòu)自QIAGEN公司; Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Promega公司; pMT18-T Vector、T4 DNA Ligase和DL5000 DNA Marker, 熒光定量試劑盒TaKaRa SYBR、PrimeScriptTM RTPCR Kit (Perfect Real Time)購(gòu)自TaKaRa公司; 感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌菌株由本實(shí)驗(yàn)制備。

1.2 試驗(yàn)方法

總RNA提取及cDNA的合成用于cDNA克隆的模板來源于卵巢、精巢、肝胰腺的混合樣品(總質(zhì)量30 mg), 提取斑節(jié)對(duì)蝦上述樣品組織的總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定其完整度, 經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定純度。以總RNA (2 μg)為模板采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒, 經(jīng)過42℃ 15min延伸和70℃15min逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后得到cDNA的第一條鏈。

斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因cDNA的克隆對(duì)已經(jīng)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中的EST序列進(jìn)行BLAST分析, 結(jié)果顯示有一條EST序列與凡納濱對(duì)蝦α-淀粉酶基因高度同源。利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物由華大基因生物公司合成。利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)、降落PCR技術(shù)和半巢式PCR (Semi-nest PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的基因的3′末端。在3′RACE中,降落PCR使用正向引物AMY-F1和接頭通用引物UPM (引物見表1), 所得PCR產(chǎn)物稀釋50倍后取2 μL用于巢式PCR, 反應(yīng)程序及條件參照實(shí)驗(yàn)室研究文獻(xiàn)設(shè)置[20]。反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 膠回收目的片段后與pMT18-T載體進(jìn)行連接, 然后在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化, 將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌均勻涂到培養(yǎng)基上, 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8—10h后挑取平板中的陽(yáng)性克隆, 經(jīng)過菌液PCR鑒定后送往華大公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物序列Tab. 1 Primers sequences used in this experiment

1.3 序列分析

測(cè)序結(jié)果采用Dnaman軟件分析拼接, 運(yùn)用EdiSeq程序預(yù)測(cè)開放閱讀框及氨基酸序列, 通過GOR4方法(http://www.expasy.org/)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析, 用SMART (Simple Modular Architecture Research Tool)(http://smart.emblheidelberg.de/)軟件分析蛋白的結(jié)構(gòu)域, 通過NCBI中BLAST對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦及其他物種的淀粉酶氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì),3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和查看采用phyre2軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)軟件、Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org)程序和FirstGlance in Jmol(http://bioinformatics.org/firstglance/)程序, 用Clustalx2.0.11和Bioedit軟件進(jìn)行多序列比對(duì), 采用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 軟件使用MEGA5.0。

1.4 斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因的表達(dá)分析

利用RNA提取試劑盒提取斑節(jié)對(duì)蝦各組織(包括心臟、肝胰腺、淋巴、性腺、肌肉、腦、鰓、腸、胃、眼柄和胸腺神經(jīng))的總RNA, 并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 以備熒光定量RT-PCR模板使用。運(yùn)用同樣的方法獲得卵巢發(fā)育Ⅰ—Ⅴ期的熒光定量RTPCR模板和8個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的熒光定量模板。每個(gè)時(shí)期設(shè)置3個(gè)平行, 實(shí)驗(yàn)中每個(gè)時(shí)期樣本使用的質(zhì)量約為30 mg。

根據(jù)斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物AMY (RT)-F和AMY (RT)-R, 參照已有研究報(bào)道[20]選用β-actin為內(nèi)參基因, 引物序列為βactin-F和βactin-R (表1)。依照TaKaRa SYBR Premix ExTaqTMKit (Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。以蒸餾水代替模板作為陰性對(duì)照,樣品和內(nèi)參均設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對(duì)ΔCt法(2–ΔΔCt法)分析PmCatL基因在斑節(jié)對(duì)蝦各組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件的單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行處理, 結(jié)果值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用Duncan檢驗(yàn)顯著性差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因序列分析

利用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增, 將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與EST序列拼接, 獲得斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因的cDNA序列, 命名為PmAmy, 其在NCBI的GenBank登錄號(hào)為KU308415。PmAmy基因全長(zhǎng)2465 bp, 包括73 bp的5′端非編碼區(qū)(Untranslated region, UTR),217 bp的3′端非編碼區(qū)和2175 bp的開放閱讀框(Open reading frame, ORF), 含有polyA加尾信號(hào)AATAAA。經(jīng)過對(duì)其編碼氨基酸序列預(yù)測(cè)分析,PmAmy編碼的氨基酸序列含有724個(gè)氨基酸, 其中含量最多的是甘氨酸(Gly)和纈氨酸(Val)分別占總氨基酸含量的11.3%和8.6%。分子總量為78.9 kD,理論等電點(diǎn)為4.66。結(jié)構(gòu)域分析表明,PmAmy的N端含有21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽;PmAmy還包含有一個(gè)α-淀粉酶家族保守的A結(jié)構(gòu)域(Thr34-Ser410)和一個(gè)C結(jié)構(gòu)域(Glu420-Ala496)。

2.2 斑節(jié)對(duì)蝦與其他動(dòng)物α-Amylase同源性分析

PmAmy與凡納濱對(duì)蝦的一致性最高為99%。與長(zhǎng)牡蠣、合浦珠母貝、人、牛的一致性分別為55%、48%、47%和48%。通過與其他動(dòng)物α-Amylase的比對(duì), 該基因編碼氨基酸中的半胱氨酸位點(diǎn)、活性催化位點(diǎn)、鈣結(jié)合位點(diǎn)和氯離子結(jié)合位點(diǎn)在物種間都非常保守。

通過鄰位相連法構(gòu)建的進(jìn)化樹如圖1所示, 斑節(jié)對(duì)蝦與凡納濱對(duì)蝦的親緣關(guān)系最近, 其次是羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii), 三者聚為一小支, 與哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這樣的進(jìn)化關(guān)系與一致性分析結(jié)果一致, 也符合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上各物種的分類地位。

2.3 斑節(jié)對(duì)蝦PmAmy基因表達(dá)特征分析

組織表達(dá)結(jié)果顯示,PmAmymRNA在所檢測(cè)組織中, 表達(dá)量存在顯著差異。肝胰腺組織中的表達(dá)量顯著高于其他各個(gè)組織(P＜0.05), 在淋巴、鰓、腸中也有一定的表達(dá), 表達(dá)量最低的是眼柄神經(jīng)和心臟組織(圖2)。

斑節(jié)對(duì)蝦PmAmy基因在卵巢發(fā)育的過程中均有表達(dá), 表達(dá)量有所變化, 但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示并沒有發(fā)現(xiàn)顯著性的差異(P=0.09)(圖3)。斑節(jié)對(duì)蝦PmAmy在整個(gè)生長(zhǎng)階段的檢測(cè)中都有表達(dá)。在幼體發(fā)育過程中存在顯著性差異, 糠蝦時(shí)期PmAmy表達(dá)量達(dá)到峰值, 顯著高于無節(jié)幼體、糠蝦和仔蝦三個(gè)生長(zhǎng)階段(P＜0.05)。隨后表達(dá)量下降, 此后一直到成蝦階段, 這期間各生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量也有變化,但在后期仔蝦、幼蝦、亞成蝦和成蝦生長(zhǎng)時(shí)期并沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異(圖4)。

3 討論

圖1 利用Clustal W程序和MEGA 5.0軟件構(gòu)建的PmAmy系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of the AMY amino acid sequence in different groups by program Clustal W and MEGA 5.0

圖2 節(jié)對(duì)蝦PmAmy基因在不同組織中的表達(dá)分布Fig. 2 Distribution of PmAmy gene expression in different tissues of P. monodon

α-淀粉酶在許多水生動(dòng)物中控制著碳水化合物的代謝, 并且對(duì)生長(zhǎng)有著重要的影響。以往較多的研究主要采用測(cè)定酶活力的分析方法, 但由于消化酶的活性會(huì)受到多種因子的影響, 從酶學(xué)水平測(cè)定消化酶分布或表達(dá)差異存在著方法上的局限性,然而從分子水平檢測(cè)α-淀粉酶基因的轉(zhuǎn)錄水平變化有著很強(qiáng)的特異性, 可以精確地了解α-淀粉酶的合成和分泌情況[8,22]。本研究結(jié)果表明斑節(jié)對(duì)蝦α-淀粉酶基因在被檢測(cè)的多種組織中廣泛分布, 且在肝胰腺中的表達(dá)量顯著高于其他部位。這一結(jié)果與鱖(Siniperca chuatsi)、青魚(Mylopharyngodonpiceus)的組織表達(dá)[23]有所不同, 但與合浦珠母貝[8]、草魚[22]具有相似性, 尤其與甲殼動(dòng)物中的克氏原螯蝦[24](Procambarus clarkii)的研究結(jié)果較為一致。本研究中PmAmy基因在肝胰腺中表達(dá)量較高的結(jié)果可能與肝胰腺是斑節(jié)對(duì)蝦淀粉酶中心合成場(chǎng)所有關(guān)[8,20], 而在其他多個(gè)組織中的表達(dá)同時(shí)也說明了肝胰腺并不是PmAmy基因在斑節(jié)對(duì)蝦體內(nèi)發(fā)揮作用的唯一場(chǎng)所。

圖3 斑節(jié)對(duì)蝦PmAmy基因在卵巢發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)特征Fig. 3 Relative expression level of PmAmy mRNA in different development stages of ovary

圖4 斑節(jié)對(duì)蝦PmAmy基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)Fig. 4 Expression level of PmAmy in different growth stage of P.monodon

在個(gè)體早期發(fā)育階段的功能作用, 一直是α-淀粉酶研究的重要方向之一, 國(guó)內(nèi)外有很多相關(guān)報(bào)道。阮國(guó)良[3]在草魚和鳡孵化后第二天即檢測(cè)到α-淀粉酶基因的表達(dá), 并在第7天表現(xiàn)出最大的α-淀粉酶mRNA表達(dá)量。其他多種魚類如日本鰻鱺、太平洋多指馬鲅(Polydactylus sexfilis)、湖鱘(Acipenser fulvescens)、河鱸(Perca fluviatilis)、赤鯛(Pagrus pagrus)等[25—28], 也都發(fā)現(xiàn)在仔魚的早期發(fā)育階段有較高的淀粉酶活性, 之后逐漸降低。這些研究表明, 很多魚類在發(fā)育早期缺乏完善的消化腺和穩(wěn)定消化系統(tǒng), 這時(shí)包括α-淀粉酶在內(nèi)的多種消化酶在餌料和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[23]。本研究在斑節(jié)對(duì)蝦的整個(gè)生長(zhǎng)階段均檢測(cè)到PmAmy基因的表達(dá), 在糠蝦時(shí)期PmAmy基因表達(dá)量達(dá)到峰值, 這可能與斑節(jié)對(duì)蝦幼體逐漸攝食大量的輪蟲和藻類作為餌料有一定的關(guān)系, 這一結(jié)果和其他甲殼動(dòng)物的研究類似但不完全一致。中國(guó)明對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦在幼體發(fā)育過程中, 淀粉酶活性在溞狀幼體Ⅲ期時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰值,以后逐漸減弱[29]。但是也有研究表明淀粉酶基因表達(dá)變化與個(gè)體自身發(fā)育有關(guān), 如在中華絨螯蟹的研究中, 發(fā)現(xiàn)整個(gè)胚胎發(fā)育過程中, 淀粉酶的變化趨勢(shì)不明顯, 但溞狀幼體期, 酶的活性顯著升高, 這可能與幼體孵化后開口攝食的自身調(diào)控機(jī)理有關(guān)系[30], 影響α-淀粉酶表達(dá)量變化的因素還有很多,如蛻皮、溫度、鹽度等環(huán)境因子等[31]。已有研究表明, α-淀粉酶基因在凡納濱對(duì)蝦[32,33]、克氏原螯蝦[24]等多種甲殼動(dòng)物的蛻皮誘導(dǎo)應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用, 此外還與多種蝦蟹類幼體發(fā)育過程中食性的變化密切相關(guān), 根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)[22,31], α-淀粉酶基因在斑節(jié)對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育過程中的表達(dá)變化特征可能與斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育階段的食性變化有關(guān), α-淀粉酶基因可能參與調(diào)控斑節(jié)對(duì)蝦的幼體發(fā)育過程[33]。

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CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF ALPHA AMYLASE CDNA OF PENAEUS MONODON

YANG Qi-Bin1,2, LI Yun-Dong1,2, JIANG Shi-Gui1,2, HUANG Jian-Hua1,2, JIANG Song1,2, QIU Li-Hua1,2,ZHU Cai-Yan1,2and ZHOU Fa-Lin1,2
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China;2. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation amp;Utilization, Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300, China)

In order to study the structure and biological function of the alpha-amylase gene inPenaeus monodon, the full-length cDNA sequence of α-Amylase fromPenaeus monodon(PmAmy) was obtained by high throughput transcriptome sequencing and RACE. ThePmAmycDNA included an open reading frame of 2175 bp encoding a polypeptide of 724 amino acids, and the predicted molecular mass and isoelectric point were 78.9 kD and 4.66, respectively. ThePmAmycontained a conservative A domain (Thr34-Ser410) and a C domain (Glu420-Ala496) of alpha amylase family. Homology analysis revealed that the PmAmy shared 47%—99% identity to other known amylase sequences, and the phylogenetic tree showed that the PmAmy was closely related toLitopenaeus vannamei. The expression levels ofPmAmyin hepatopancreas were significantly higher than those of the other tissues (P＜0.05). ThePmAmyexpression was found in five ovarian development stages. The expression level in yolky stage (stageⅣ) was the highest among the five stages, and was the lowest in ovogonium stage (stageⅠ). The expression levels ofPmAmyshowed no significantly difference in ovary development stages. Expression ofPmAmywas detected in all tested growth stages, and the expression level in mysis was significantly higher than that in nauplius, zoea and post larval (P＜0.05). These results suggested thatPmAmymight be associated with larval development inP. monodon.

Penaeus monodon; α-Amylase; Gene cloning; Gene expression; Larval development

Q781

A

1000-3207(2017)06-1186-07

2016-07-28;

2017-04-25

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-48); 廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B020202003); 廣東省海洋與漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A201501A06); 深圳市生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物產(chǎn)業(yè)推廣扶持計(jì)劃項(xiàng)目(NYSW201400331010053)資助[Supported by China Agriculture Research System (CARS-48); Guangdong Province Project of China (2014B020202003);Guangdong Oceanic and Fisheries Project of China (A201501A06); Shenzhen Biological Industry Development Project of China(NYSW201400331010053)]

楊其彬(1972—), 男, 廣東高州人; 本科; 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種與分子生物學(xué)研究。E-mail: yangqibin@163.com

周發(fā)林(1975—); E-mail: zhoufalin@aliyun.com

10.7541/2017.147

doi: 10.7541/2017.148