索拉菲尼通過活化p38MAPK抑制人口腔癌TCA8113細(xì)胞增殖

葛樹卿 賈桂枝 戴紅良 王玥 梁春光

索拉菲尼通過活化p38MAPK抑制人口腔癌TCA8113細(xì)胞增殖

葛樹卿 賈桂枝 戴紅良 王玥 梁春光

目的觀察索拉菲尼對(duì)人口腔癌TCA8113細(xì)胞增殖的影響并探討其作用機(jī)制。方法以濃度(2.5、5、10、20 μg/ml)索拉菲尼干預(yù)人口腔癌TCA8113細(xì)胞48 h后，以MTT法及集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)不同濃度拉菲尼對(duì)p38MAPK活化的影響；為檢測(cè)p38MAPK在索拉菲尼抗TCA8113細(xì)胞增殖中的作用，先以10 μmol/L SB203580(p38MAPK特異性抑制劑)預(yù)處理TCA8113細(xì)胞30 min，隨后加入不同濃度索拉菲尼繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果索拉菲尼能顯著抑制TCA8113細(xì)胞的增殖，其抗增殖活性具有濃度依賴性；索拉菲尼還可明顯增強(qiáng)p38MAPK的活化，而SB203580可顯著緩解索拉菲尼誘導(dǎo)的TCA8113細(xì)胞活力下降。結(jié)論索拉菲尼可抑制人口腔癌TCA8113細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)p38MAPK活化有關(guān)。

索拉菲尼； TCA8113； 增殖； p38MAPK

作為最常見的口腔惡性腫瘤，口腔鱗狀細(xì)胞癌占頭頸部腫瘤的80%以上[1],其發(fā)病率在過去的十年間增加了50%。患者預(yù)后較差，即使通過手術(shù)切除，口腔癌仍存在著較高的局部復(fù)發(fā)率，患者死亡率并無明顯下降，5 年生存率只有約50%[2-4]。因此，有必要開發(fā)有效的治療藥物以改善口腔癌患者的預(yù)后[5]。

索拉菲尼是一種供口服應(yīng)用的多靶點(diǎn)的生物靶向新藥，其作用靶點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞及腫瘤周圍血管組織上的受體酪氨酸激酶及其下游的絲/蘇氨酸蛋白激酶[6]。研究顯示索拉菲尼對(duì)C-Raf激酶、B-Raf激酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2以及血小板源性生長(zhǎng)因子β等均具有強(qiáng)大的抑制作用[7]。通過對(duì)上述蛋白激酶的抑制作用，索拉菲尼可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及血管化，發(fā)揮其抗腫瘤活性。研究顯示，索拉菲尼可顯著抑制肝癌[8]、胃癌[9]、滑膜肉瘤[10]、乳腺癌[11]等多種人類腫瘤的生長(zhǎng)。而目前對(duì)索拉菲尼是否可抑制口腔癌的生長(zhǎng)尚不清楚。為此，本研究擬探討索拉菲尼對(duì)人口腔癌TCA8113細(xì)胞增殖的抑制作用及其作用機(jī)制，以期為臨床上口腔癌應(yīng)用分子靶向藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人口腔癌TCA8113細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；索拉菲尼購自拜耳公司；胎牛血清購自Hyclone公司；胰蛋白酶及p38MAPK特異性抑制劑SB203580、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)購于美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國康寧公司；RIPA裂解液購自南京諾維贊生物科技有限公司；p38MAPK、phospho-p38MAPK一抗購自SAB (Signalway antibody)公司, HRP標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 TCA8113細(xì)胞培養(yǎng)

人口腔癌TCA8113細(xì)胞株以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，0.25% EDTA胰酶消化細(xì)胞，每3天傳代1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用MTT比色法檢測(cè)索拉菲尼對(duì)TCA8113細(xì)胞活力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96 孔板。待細(xì)胞貼壁后，以0.1% DMSO(對(duì)照組)及不同濃度的索拉菲尼(2.5、5、10、20 μg/ml)作用TCA8113細(xì)胞48 h。隨后加入MTT(終濃度: 5 mg/ml), 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去MTT, 加入150 μl DMSO在37 ℃作用10 min并充分振搖直到結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)

TCA8113細(xì)胞以1 000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，以0.1% DMSO(對(duì)照組)及不同濃度的索拉菲尼作用TCA8113細(xì)胞10 d。以PBS清洗后，以4%多聚甲醛于室溫固定20 min，再用PBS洗3 遍，用結(jié)晶紫染色，按下式計(jì)算集落形成率(colony-forming efficiency, CFE)：

CFE=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%

1.5 Western blot

細(xì)胞以預(yù)冷PBS洗3 遍，加入RIPA細(xì)胞裂解液 [臨用前加入0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF)]提取細(xì)胞總蛋白， BCA法測(cè)定蛋白濃度。取35 μg總蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用1%BSA封閉1 h，接著加待檢測(cè)蛋白的一抗4 ℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 索拉菲尼對(duì)TCA8113細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細(xì)胞48 h后， MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著索拉菲尼濃度的增加，TCA8113細(xì)胞活力逐漸降低(圖 1)。

圖 1 索拉菲尼對(duì)TCA8113細(xì)胞增殖的影響

Fig 1 The effects of sorafenib on the proliferation of TCA8113 cells

2.2 索拉菲尼對(duì)TCA8113細(xì)胞集落形成率的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細(xì)胞10 d后， 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果示隨著索拉菲尼濃度的增加，TCA8113細(xì)胞集落形成率逐漸降低，當(dāng)藥物濃度達(dá)到10 μg/ml以上時(shí)，幾乎沒有集落形成(圖 2)。

2.3 索拉菲尼對(duì)TCA8113細(xì)胞p38MAPK活化的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細(xì)胞48 h后，Western blot結(jié)果顯示，TCA8113細(xì)胞p38MAPK的表達(dá)未發(fā)生明顯變化，而不同濃度的索拉菲尼可明顯增強(qiáng)磷酸化p38MAPK(phospho-p38MAPK)的表達(dá)，提示索拉菲尼的抗口腔癌細(xì)胞增殖活性可能與其促進(jìn)p38MAPK的活化有關(guān)(圖 3)。

2.4 SB203580對(duì)不同濃度索拉菲尼誘導(dǎo)的TCA8113細(xì)胞活力降低的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度索拉菲尼處理TCA8113細(xì)胞48 h后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著索拉菲尼濃度的增加，TCA8113細(xì)胞活力逐漸降低；而SB203580預(yù)處理能明顯緩解由索拉菲尼誘導(dǎo)的癌細(xì)胞活力降低(圖 4)，進(jìn)一步表明索拉菲尼的抗口腔癌細(xì)胞增殖活性與其促進(jìn)p38MAPK的活化有關(guān)。

圖 2 索拉菲尼處理TCA8113細(xì)胞10 d后對(duì)集落形成率的影響

圖 3 索拉菲尼對(duì)TCA8113細(xì)胞p38MAPK活化的影響

圖 4 SB203580對(duì)不同濃度索拉菲尼誘導(dǎo)的TCA8113細(xì)胞活力降低的影響

Fig 4 The effects of SB203580 on sorafenib induced TCA8113 cell viability decrease

3 討 論

口腔癌是世界上六種最常見的惡性腫瘤之一[12]。近年來其發(fā)病率逐年增高，并具有年輕化發(fā)展的趨勢(shì)[13-14]。盡管口腔癌的診療手段不斷進(jìn)步，但目前對(duì)于其治療仍極為困難，患者預(yù)后較差。舌癌的惡性程度高，往往在早期即出現(xiàn)較大范圍的浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。而外科治療帶來的部分或全舌缺如嚴(yán)重地影響患者的生存質(zhì)量。因此，有必要開發(fā)新的抗口腔癌治療藥物及方式。

索拉菲尼的作用靶點(diǎn)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上游的受體酪氨酸激酶及其下游的絲/蘇氨酸蛋白激酶。索拉菲尼既可通過抑制Raf/MEK/ERK通路直接抑制腫瘤的生長(zhǎng)，又可通過抑制VEGFR、PDGFR及抑制腫瘤新生血管的形成而間接抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[15]。研究證實(shí)，索拉菲尼對(duì)多種人類腫瘤都顯示出有效的抑制活性[16]。目前對(duì)于索拉菲尼是否可抑制口腔癌細(xì)胞的增殖尚不清楚。本研究利用MTT及集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)索拉菲尼對(duì)口腔癌細(xì)胞同樣顯示出強(qiáng)大的抗增殖活性，為我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)索拉菲尼的藥理活性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶通路中的關(guān)鍵分子，大量研究證實(shí)p38MAPK的活化水平對(duì)于包括肺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡和腫瘤血管生成等均有重要的調(diào)控作用，促進(jìn)p38MAPK的活化對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用[17-19]。如牛蒡苷抗口腔癌TCA8113細(xì)胞的增殖活性即與其促進(jìn)p38MAPK的活化有關(guān)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼明顯促進(jìn)p38MAPK的活化，而p38MAPK特異性抑制劑SB203580可顯著緩解索拉非尼引起的癌細(xì)胞活力降低，充分說明索拉菲尼抑制TCA8113細(xì)胞的增殖的生物活性是通過誘導(dǎo)p38MAPK活化實(shí)現(xiàn)的。

本研究首次證實(shí)索拉菲尼對(duì)口腔癌細(xì)胞具有顯著的抗增殖活性，該生物活性與其活化p38MAPK有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)表明索拉菲尼有望成為新的抗口腔癌治療藥物。

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(收稿： 2016-10-26 修回： 2016-12-18)

SorafenibinhibitstheproliferationofhumanoralcancerTCA8113cellsthroughtheactivationofp38MAPK

GEShuqing1,JIAGuizhi2,DAIHongliang3,WangYue3,LiangChunguang3.

1. 121001Jinzhou,DepartmentofStomatologyoftheFirstAffiliatedHospital,JinzhouMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofPhysiology,JinzhouMedicalUniversity; 3.SchoolofNursing,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou

Objective: To investigate the effect of sorafenib on the proliferation of human oral cancer TCA8113 cells and to explore the underlying mechanisms.MethodsAfter treated with sorafenib at 2.5, 5, 10, 20 μg/ml respectively for 48 h, TCA8113 cell proliferation was examined by MTT and colony formation assay. Western blotting was employed to examine the p38MAPK expression in the cells. TCA8113 cells were pretreated with 10 μmol/L of SB203580 (a specific inhibitor of p38MAPK) for 30 min, and then by different concentrations of sorafenib for 48 h, cell proliferation was tested by MTT assay.ResultsSorafenib significantly inhibited the proliferation of TCA8113 cells in a concentration dependent fashion. Sorafenib also remarkably promoted the activation of p38MAPK of the cells. SB203580 significantly alleviated sorafenib induced TCA8113 cell viability decrease.ConclusionSorafenib can inhibit the proliferation of TCA8113 cells, which may be related to the activation of p38MAPK.

Sorafenib；TCA8113；Proliferation；p38MAPK

121001， 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科[葛樹卿(現(xiàn)在濰坊市人民醫(yī)院口腔頜面外科)]； 錦州醫(yī)科大學(xué)生理教研室(賈桂枝)； 錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院(戴紅良 王玥 梁春光)

戴紅良 E-mail：jy2006hldai@sohu.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.023