白術(shù)兩種主要土傳病害的分離、鑒定及殺菌劑的室內(nèi)活性篩選

張佳星, 徐穎菲, 徐艷芳, 戴德江, 劉亞慧, 張傳清*

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué), 臨安 311300; 2. 浙江省農(nóng)藥檢定管理所, 杭州 310020)

白術(shù)兩種主要土傳病害的分離、鑒定及殺菌劑的室內(nèi)活性篩選

張佳星1, 徐穎菲1, 徐艷芳1, 戴德江2, 劉亞慧1, 張傳清1*

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué), 臨安 311300; 2. 浙江省農(nóng)藥檢定管理所, 杭州 310020)

立枯病和白絹病是白術(shù)生產(chǎn)種植中的兩種主要土傳病害,在苗期和生長(zhǎng)期都有發(fā)生,危害嚴(yán)重。本研究從浙江省磐安縣采集具有典型病癥的白術(shù)植株,對(duì)病原進(jìn)行了分離、純化和致病性測(cè)定。綜合形態(tài)學(xué)特征及rDNA-ITS序列分析表明,白術(shù)上的病害是由立枯絲核菌RhizoctoniasolaniKühn引起的立枯病和由齊整小核菌SclerotiumrolfsiiSacc.引起的白絹病。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明,10種供試殺菌劑對(duì)立枯病菌的毒力從大到小為:噻呋酰胺>咯菌腈>戊唑醇>四氟醚唑>吡唑醚菌酯>丙硫菌唑>嘧菌酯>啶酰菌胺>苯醚甲環(huán)唑>咪鮮胺;對(duì)白絹病菌的室內(nèi)毒力從大到小為:吡唑醚菌酯>噻呋酰胺>嘧菌酯>戊唑醇>咯菌腈>苯醚甲環(huán)唑>丙硫菌唑>啶酰菌胺>四氟醚唑>咪鮮胺,其中噻呋酰胺對(duì)兩種病菌都具有很高的活性,EC50分別為0.06和0.03 mg/L,可用于兩種病害的防治。

白術(shù); 立枯病; 白絹病; 立枯絲核菌; 齊整小核菌

白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.,別名浙術(shù)、蒼術(shù)等,屬于菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物,是“參、術(shù)、苓、甘”四大名貴藥材之一,也是浙江省主產(chǎn)的道地藥材[1]。

近年來(lái),由于白術(shù)出口和國(guó)內(nèi)需求量越來(lái)越大,其種植面積不斷擴(kuò)大,輪作周期逐漸縮短,導(dǎo)致白術(shù)病蟲(chóng)害逐年加重[2]。立枯病(sheath blight)多于植株幼苗期危害其根莖部,導(dǎo)致根莖部產(chǎn)生暗褐色凹陷病斑。發(fā)病初期?？梢?jiàn)植株在陽(yáng)光下全株萎蔫,入夜后恢復(fù)正常。當(dāng)病斑環(huán)繞莖部一周后,莖部縊縮死亡。病原也可侵染近地面葉片,感病葉片上產(chǎn)生深褐色水漬狀大病斑,并快速腐爛死亡。在高溫高濕環(huán)境中,病部生長(zhǎng)出大量的褐色蛛絲狀菌絲,并產(chǎn)生大量土粒狀褐色菌核。白絹病(southern blight)[3-4]又名白霉病,可侵染100多科210多種植物。該病通常危害成株期植株根部和莖基部,莖部發(fā)病后,產(chǎn)生深褐色、不規(guī)則的水漬狀病斑,向上蔓延導(dǎo)致葉片變黃枯死,向下蔓延導(dǎo)致根部表皮褐變腐爛,最終全株萎蔫枯死,根莖僅剩下纖維組織,很容易從土中被拔出。如環(huán)境高溫潮濕[5],病情發(fā)展更加迅速,病斑處可長(zhǎng)出大量絹絲狀白色菌絲體,纏繞近地面葉片并向周?chē)寥缆?產(chǎn)生大量油菜籽狀的茶褐色菌核。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)白術(shù)病害的研究主要側(cè)重田間病害調(diào)查和藥劑防治方面,對(duì)病原的研究較少或是為較早期的研究。如,對(duì)白術(shù)鐵葉病病原的研究還停留在20世紀(jì)70年代[6];白術(shù)根腐病病原是由多種鐮刀菌屬真菌引起的,對(duì)其癥狀描述也大相徑庭[2,7-9];對(duì)白術(shù)病害命名未有統(tǒng)一的規(guī)范,常出現(xiàn)“一病多名,一名多病”現(xiàn)象,這給病害的防治造成了嚴(yán)重的阻礙。因此,本文對(duì)白術(shù)生產(chǎn)中的兩種重要土傳病害病原進(jìn)行分離、鑒定,并進(jìn)行多種殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定,目的在于為病害防治提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集及病原菌的分離

于浙江省金華市磐安縣采集具明顯病癥的白術(shù)樣本,用干凈的牛皮紙袋密封保存,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離。白術(shù)立枯病取病健交界處組織,用75%乙醇浸泡1 min,再用1.5%的次氯酸鈉溶液消毒1 min,75%乙醇漂洗1 min,最后用無(wú)菌水漂洗4次,用無(wú)菌濾紙將水分吸干后切成0.5 cm2小塊,置于PDA表面,在25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待有菌絲長(zhǎng)出后,挑取菌落邊緣瓊脂塊到新的平板上進(jìn)行純化培養(yǎng),并于4℃保存?zhèn)溆?。白術(shù)白絹病直接挑取病株表面油菜籽狀的菌核進(jìn)行滅菌,分離,純化,保存。

1.2 病原菌致病性測(cè)定

白術(shù)塊根經(jīng)表面滅菌后埋于濕潤(rùn)的無(wú)菌基質(zhì)中,置于溫室中培養(yǎng),定期澆水,待植株高度達(dá)到20 cm,進(jìn)行致病性試驗(yàn)。從分離獲得的病原真菌中選取兩株代表菌株進(jìn)行活化,接于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),同時(shí)在培養(yǎng)基上放置一根無(wú)菌牙簽。培養(yǎng)5 d后,將牙簽長(zhǎng)有菌絲的一端插至白術(shù)離地2 cm處的莖基部,以未做處理的無(wú)菌牙簽作為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)4次,放于人工氣候箱中(28℃,L∥D=12 h∥12 h,相對(duì)濕度85%),兩種病害進(jìn)行相同處理。定期觀察植株發(fā)病情況,并做好記錄,對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行再分離、純化、保存,與首次分離的病原菌進(jìn)行比對(duì)。

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)特征觀察

將兩種病原菌的純化菌株于25℃恒溫培養(yǎng)箱中的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察菌落形態(tài)特征。在顯微鏡下測(cè)量菌絲和菌核大小,并使用Giemsa染料對(duì)菌絲細(xì)胞進(jìn)行染色,觀察并記錄細(xì)胞核數(shù)量,總結(jié)兩種病原菌形態(tài)特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 病原菌的rDNA-ITS 序列擴(kuò)增及分析

取生長(zhǎng)在PDA培養(yǎng)基表面的病原菌菌絲,用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組DNA。用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用50 μL擴(kuò)增體系,包括酶2 U、引物0.8 μmol/L、病原菌DNA 1 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán);然后72℃延伸10 min。產(chǎn)物于4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收目標(biāo)DNA片段,送往生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 供試殺菌劑

使用的殺菌劑均為原藥,包括97.6%戊唑醇(tebuconazole)、96%噻呋酰胺(thifluzamide)、95%咯菌腈(fludioxonil)、95%咪鮮胺(prochloraz)、96%苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)、95%啶酰菌胺(boscalid)、96%嘧菌酯(azoxystrobin)、96%丙硫菌唑(prothioconazole)、99%四氟醚唑(tetraconazole)和97%吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)。

1.6 殺菌劑對(duì)兩種病原菌菌絲的室內(nèi)毒力測(cè)定

將上述殺菌劑母液與PDA按照一定的比例混合,其中嘧菌酯和吡唑嘧菌酯兩種殺菌劑需要加50 mg/L SHAM,終濃度設(shè)置見(jiàn)表1。將4℃保存的菌株活化后,再次轉(zhuǎn)接,至菌落長(zhǎng)至9 cm培養(yǎng)皿的三分之二后用5 mm直徑打孔器在同一圓周上打取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的菌餅,接于不同濃度梯度的PDA培養(yǎng)皿中心,以空白PDA培養(yǎng)皿作為對(duì)照,每處理3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿放于25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),待空白處理菌落直徑大于6 cm后使用十字交叉法測(cè)量,記錄數(shù)據(jù),計(jì)算抑制率。公式為:生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-0.5)×100。數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析,求得各藥劑的毒力回歸方程、EC50以及相關(guān)系數(shù)。

表1殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定濃度

Table1Concentrationoffungicidesfortoxicitymeasurement

病害Disease殺菌劑Fungicide濃度/mg·L-1Concentration立枯病Sheathblight噻呋酰胺thifluzamide0．01250．0250．050．10．2咯菌腈fludioxonil0．0250．050．10．20．4戊唑醇tebuconazole0．06250．1250．250．51吡唑醚菌酯pyraclostrobin0．156250．31250．6251．252．5四氟醚唑tetraconazole0．156250．31250．6251．252．5嘧菌酯azoxystrobin0．250．5124啶酰菌胺boscalid0．250．5124苯醚甲環(huán)唑difenoconazole0．6251．252．5510丙硫菌唑prothioconazole0．0781250．31251．25520咪鮮胺prochloraz0．31251．2552040白絹病Southernblight吡唑醚菌酯pyraclostrobin0．006250．01250．0250．050．1噻呋酰胺thifluzamide0．01250．0250．050．10．2咯菌腈fludioxonil0．0250．050．10．20．4嘧菌酯azoxystrobin0．031250．06250．1250．250．5戊唑醇tebuconazole0．06250．1250．250．51苯醚甲環(huán)唑difenoconazole0．0781250．156250．31250．6251．25啶酰菌胺boscalid0．1250．250．512丙硫菌唑prothioconazole0．156250．31250．6251．252．5四氟醚唑tetraconazole0．156250．31250．6251．252．5咪鮮胺prochloraz2．55102040

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測(cè)定

從磐安采集的植株病樣中分離得到兩種病害病原真菌,以BZLK1、BZLK2和BZBJ1、BZBJ2作為兩種病害的代表菌株,進(jìn)行致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示:健康白術(shù)在接種BZLK1和BZLK2 5 d后,莖基部出現(xiàn)水漬狀暗褐色病斑,病斑環(huán)莖蔓延。20 d后植株整體表現(xiàn)萎蔫,頂部葉片下垂干枯,近地面葉片出現(xiàn)大面積黑褐色病斑,莖基部縊縮,表皮都為黑褐色病斑,黏附有土粒狀深褐色菌核。

白術(shù)在接BZBJ1和BZBJ2 5 d后,莖基部傷口開(kāi)始發(fā)病,隨著病情發(fā)展,莖基部出現(xiàn)水漬狀、暗褐色、不規(guī)則病斑,近地面葉片黃化萎蔫。20 d后,莖基部和近地面葉片被白色絹絲狀菌絲纏繞,植株可從基質(zhì)中輕易拔起,葉片、莖部和土層中可見(jiàn)大量油菜籽狀茶褐色菌核。插有無(wú)菌牙簽的對(duì)照未有病變癥狀。將病變組織再次進(jìn)行分離、純化,得到與BZLK1、BZLK2和BZBJ1、BZBJ2相同的病原真菌。

2.2 病原菌的菌落和形態(tài)學(xué)特征

立枯病病原菌BZLK1菌絲在PDA上以匍匐狀向四周生長(zhǎng),有環(huán)狀輪紋,生長(zhǎng)快,3 d左右可長(zhǎng)滿(mǎn)9 cm培養(yǎng)基,6 d后菌絲由淡黃色向褐色轉(zhuǎn)變,9 d后轉(zhuǎn)變?yōu)樯詈稚?產(chǎn)生菌核(圖1a～b)。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌絲分支角度較大,且有縊縮,菌絲直徑(5.77～ 6.99)μm,用Giemsa染料對(duì)菌絲細(xì)胞染色后發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)有多個(gè)細(xì)胞核(圖1c)。病原菌 BZLK2具有相似的形態(tài)特征。

白絹病病原菌BZBJ1 菌絲為白色,向四周以輻射狀生長(zhǎng),氣生菌絲較多,生長(zhǎng)快,3 d左右可長(zhǎng)滿(mǎn)9 cm PDA培養(yǎng)皿,菌絲直徑為(6.40～7.36)μm。5 d后菌絲纏繞,在菌落表面出現(xiàn)大量乳白色細(xì)小菌核,9 d后菌核顏色變?yōu)椴韬稚?表面光滑,不與菌絲相連,呈近球形或橢球形(圖1d～f),大小為(1.45～1.76)mm×(1.29～1.61)mm。病原菌 BZBJ2具有相似的形態(tài)特征。

圖1 病原菌BZLK1和BZBJ1在PDA上的菌落形態(tài)Fig.1 Morphological characters of pathogens BZLK1 and BZBJ1 on PDA plate

2.3 病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增及分析

以白術(shù)立枯病和白絹病兩種病害的基因組DNA作為模板,以ITS序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別得到700 bp和650 bp長(zhǎng)度的DNA片段。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較,結(jié)果顯示與立枯絲核菌R.solani和齊整小核菌S.rolfsii的相似率最高,選取相關(guān)菌株的ITS序列,使用MEGA 6.06軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。

圖2 基于兩種病原菌及相關(guān)真菌ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic trees between two pathogens and other fungi based on ITS nucleotide sequences

2.4 殺菌劑的室內(nèi)毒力

10種殺菌劑對(duì)立枯絲核菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明：咪鮮胺對(duì)絲核菌的毒力最低，噻呋酰胺和咯菌腈的毒力最高，其毒力為咪鮮胺的222倍；戊唑醇、四氟醚唑、吡唑醚菌酯和丙硫菌唑的毒力為咪鮮胺的13～40倍；其他3種殺菌劑嘧菌酯、啶酰菌胺、苯醚甲環(huán)唑相對(duì)于咪鮮胺的相對(duì)毒力倍數(shù)均小于等于10(表2)。

10種殺菌劑對(duì)齊整小核菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明：咪鮮胺的毒力最低，吡唑醚菌酯、噻呋酰胺和嘧菌酯毒力較高，其毒力分別為咪鮮胺的582、388和106倍(表3)。戊唑醇、咯菌腈、苯醚甲環(huán)唑、丙硫菌唑、啶酰菌胺和四氟醚唑的毒力為咪鮮胺的24～89倍。

表210種殺菌劑對(duì)立枯絲核菌的室內(nèi)毒力

Table2Toxicityof10fungicidesagainstRhizoctoniasolani

殺菌劑FungicideEC50/mg·L-1毒力回歸方程Toxicityequation相關(guān)系數(shù)(r)Correlationcoefficient相對(duì)毒力Relativetoxicity噻呋酰胺thifluzamide0．06y=0．9865x+0．44540．9988222咯菌腈fludioxonil0．06y=5．3676x+0．20290．9991222戊唑醇tebuconazole0．33y=0．4611x+0．34800．999140四氟醚唑tetraconazole0．65y=0．1865x+0．37870．995220吡唑醚菌酯pyraclostrobin0．90y=0．2623x+0．26360．994315丙硫菌唑prothioconazole1．02y=0．0756x+0．42300．990813嘧菌酯azoxystrobin1．38y=0．2522x+0．15270．979610啶酰菌胺boscalid1．41y=0．0371x+0．44770．99659苯醚甲環(huán)唑difenoconazole2．69y=0．0220x+0．44090．99485咪鮮胺prochloraz13．29y=0．0184x+0．25550．98741

表310種殺菌劑對(duì)齊整小核菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

Table3Toxicitytestof10fungicidesagainstSclerotiumrolfsii

殺菌劑FungicideEC50/mg·L-1毒力回歸方程Toxicityequation相關(guān)系數(shù)(r)Correlationcoefficient相對(duì)毒力Relativetoxicity吡唑醚菌酯pyraclostrobin0．02y=1．1596x+0．48170．9568582噻呋酰胺thifluzamide0．03y=4．5255x+0．38300．9961388嘧菌酯azoxystrobin0．11y=2．1208x+0．26920．9981106戊唑醇tebuconazole0．13y=0．5998x+0．42320．998989咯菌腈fludioxonil0．13y=3．4289x+0．04140．996689苯醚甲環(huán)唑difenoconazole0．26y=0．2924x+0．42450．982645丙硫菌唑prothioconazole0．46y=0．0663x+0．46950．998425啶酰菌胺boscalid0．47y=0．3684x+0．32610．991525四氟醚唑tetraconazole0．48y=0．1816x+0．41370．999924咪鮮胺prochloraz11．63y=0．0329x+0．11740．98751

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)從磐安縣采集的具有白術(shù)立枯病和白絹病典型病癥的植株進(jìn)行病原菌的分離、純化和致病性研究,并利用病菌形態(tài)學(xué)特征觀察、rDNA-ITS序列分析明確了磐安縣白術(shù)的兩種土傳病害是由立枯絲核菌R.solani引起的立枯病和由齊整小核菌S.rolfsii引起的白絹病。兩種病害都為典型的土傳病害,高溫高濕環(huán)境更易發(fā)生,可造成大面積植株干枯萎蔫和死亡[5,10]。

潘蘭蘭等[5]及黃力剛[11]報(bào)道白術(shù)立枯病病原菌為立枯絲核菌R.solani,但未做分離、鑒定和致病性試驗(yàn)。沈立榮等[13]將湖南產(chǎn)區(qū)白術(shù)紋枯病病原鑒定為齊整小核菌S.rolfsii,病原與本文一致,但病狀與本文研究的白術(shù)立枯病不同,湖南產(chǎn)區(qū)的白術(shù)紋枯病發(fā)病較晚,常于開(kāi)花結(jié)實(shí)期發(fā)病,常見(jiàn)云紋狀病斑,病斑后期為灰白色,表皮易脫落只留下葉脈,這可能與不同產(chǎn)地氣候條件和白術(shù)品種的差異有關(guān)。李小霞等[3]和胡瓊波[14]分別研究了貴州、湖南兩地白術(shù)白絹病,并將其病原鑒定為齊整小核菌S.rolfsii,其病害病癥相似,與本研究結(jié)果一致。

隨著白術(shù)市場(chǎng)的擴(kuò)大,野生資源的枯竭,大面積密植的人工栽培模式被廣泛推廣。從野生到人工栽培環(huán)境的變化,溫濕度提高,空氣不流通,連年種植,導(dǎo)致立枯病和白絹病嚴(yán)重發(fā)生。張璨[15]報(bào)道噻呋酰胺對(duì)立枯病病菌的室內(nèi)毒力較高,高于苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺,與本文一致。Grichar[16-17]等的試驗(yàn)表明戊唑醇對(duì)白絹病菌防治效果顯著,與本文的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明吡唑醚菌酯與噻呋酰胺對(duì)白絹病的毒力優(yōu)于戊唑醇,可進(jìn)行田間試驗(yàn)。此外,噻呋酰胺和吡唑醚菌酯對(duì)立枯絲核菌及齊整小核菌的室內(nèi)毒力都較高,可用于同時(shí)防治兩種病害,減少藥劑的噴灑次數(shù)和用量。對(duì)噻呋酰胺和吡唑嘧菌酯的田間防治效果將進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 楊明麗)

Isolationandidentificationoftwomainsoil-bornepathogensonAtractylodesmacrocephalaandscreeningoffungicidesinvitro

Zhang Jiaxing1, Xu Yingfei1, Xu Yanfang1, Dai Dejiang2, Liu Yahui1, Zhang Chuanqing1

(1.ZhejiangAgricultureandForestryUniversity,Lin’an311300,China; 2.InstitutefortheControlofAgrochemicalsinZhejiangProvince,Hangzhou310020,China)

The sheath blight and southern blight are two major soil-borne diseases in the cultivation ofAtractylodesmacrocephala, which occur severely during seedling and growing periods. In this study, we collectedAtractylodesplants with typical symptoms from Pan’an County, Zhejiang Province, and determined the pathogens through isolation, purification and pathogenicity tests. Morphology characteristics and rDNA-ITS sequence analysis indicated that the pathogens wereRhizoctoniasolanifor sheath blight disease andSclerotiumrolfsiifor southern blight disease, respectively. Indoor toxicity tests demonstrated that the bioactivity againstR.solaniwere: thifluzamide > fludioxonil > tebuconazole > tetraconazole > pyraclostrobin > prothioconazole > azoxystrobin > boscalid > difenoconazole > prochloraz, and the bioactivity againstS.rolfsiiwere: pyraclostrobin > thifluzamide > azoxystrobin > tebuconazole > fludioxonil > difenoconazole > prothioconazole > boscalid > tetraconazole > prochloraz. Among them, thifluzamide was most effective to both pathogens, with EC50values of 0.06 and 0.03 mg/L, respectively.

Atractylodesmacrocephala; sheath blight; southern blight;Rhizoctoniasolani;Sclerotiumrolfsii

2017-03-22

2017-04-21

浙江省“三農(nóng)六方”項(xiàng)目;浙江公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃(2016C32002)

* 通信作者 E-mail: cqzhang@zafu.edu.cn

S 482.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.031