豚鼠個體及品系間多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選

衛(wèi) 振，洪勝輝，劉迪文

(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，杭州 310058)

豚鼠個體及品系間多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選

衛(wèi) 振，洪勝輝，劉迪文*

(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，杭州 310058)

目的篩選豚鼠多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，為鑒定豚鼠遺傳結(jié)構(gòu)及基因定位提供基礎(chǔ)信息。方法從國外網(wǎng)站篩查得豚鼠基因組DNA資料，選擇AC、GT為核心的微衛(wèi)星序列，根據(jù)其旁側(cè)序列用軟件設(shè)計(jì)400對引物。經(jīng)過二輪PCR及電泳等實(shí)驗(yàn)，以電泳條帶作為遺傳標(biāo)記，通過豚鼠微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的評價(jià)篩選出多態(tài)性引物。結(jié)果第一步用5個品系豚鼠的10份DNA樣本進(jìn)行PCR，從400對引物中篩選出約110對具有多態(tài)性的豚鼠引物，其產(chǎn)物電泳條帶數(shù)為1～3條。第二步用5個品系豚鼠的60份DNA樣本進(jìn)行PCR，從上述110對引物中篩選出51對電泳條帶分辨率高的多態(tài)性引物，其中10余對引物在品系間呈標(biāo)記一致或多數(shù)一致的差異。結(jié)論篩選出的51對引物在個體及品系間呈多態(tài)性，未見其他報(bào)道，可用于常規(guī)檢測研究，部分可能用于豚鼠性狀基因定位。

豚鼠；微衛(wèi)星標(biāo)記；多態(tài)性；遺傳結(jié)構(gòu)

微衛(wèi)星是基因組內(nèi)含子的一種特殊DNA結(jié)構(gòu)，由2～6個核苷酸序列片段首尾重復(fù)連接而成，動物品系或個體間因該片段重復(fù)次數(shù)不同，常致使微衛(wèi)星總序列長度引起差異，表現(xiàn)出同一位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性，因此微衛(wèi)星成為研究實(shí)驗(yàn)動物遺傳結(jié)構(gòu)有用的工具。Burgos-Paz等[1]利用6對引物研究了哥倫比亞豚鼠的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)。動物品系間呈一致性差異的微衛(wèi)星標(biāo)記是研究基因遺傳規(guī)律、定位新基因，進(jìn)而揭示動物優(yōu)勢性狀分子機(jī)理的分子標(biāo)記，例如卲義祥等[2]利用39對小鼠品系間一致差異的微衛(wèi)星標(biāo)記，將導(dǎo)致角膜基質(zhì)變性小鼠的突變基因定位至13號染色體。

豚鼠是藥理學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、眼耳科疾病等研究領(lǐng)域應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動物，目前我國多數(shù)地區(qū)使用的是上世紀(jì)30年代從國外引進(jìn)的英國種花色豚鼠，各地遺傳差異較大，實(shí)驗(yàn)效果較差。近10年又引進(jìn)DHP品系白色豚鼠，但應(yīng)用數(shù)量少，缺乏有關(guān)生物學(xué)及特點(diǎn)資料。經(jīng)過多年努力，本中心利用上述兩種豚鼠于2000年培育出Zmu-1: DHP遠(yuǎn)交系白色豚鼠[3]，同時(shí)還分離出Zmu-2: DHP遠(yuǎn)交系黑色豚鼠。研究發(fā)現(xiàn)，Zmu-1: DHP品系豚鼠具有多項(xiàng)優(yōu)越性狀[4-6]。

眾所周知，遠(yuǎn)交系基因呈高度雜合，性狀基因定位難度較大，而近交系則基因純合，個體遺傳一致，成為定位新基因理想的材料。于是，本中心于2002至2015年將Zmu-1: DHP遠(yuǎn)交系豚鼠培育成Zmu-1: DHP近交系白色豚鼠(22代)[7]。2009至2015年又將Zmu-2: DHP遠(yuǎn)交系培育成Zmu-2: DHP部分近交系黑色豚鼠(9代)。

截止目前本中心已有5個品系的豚鼠，要鑒定這些種系的遺傳結(jié)構(gòu)，研究其遺傳特性的分子機(jī)理，定位優(yōu)越性狀的基因，必須設(shè)計(jì)一種實(shí)驗(yàn)思路，而借助微衛(wèi)星作為分子標(biāo)記輔助進(jìn)行上述研究不失為一種方便可靠的方法。因微衛(wèi)星位點(diǎn)廣泛分布于動物基因組，人們對其數(shù)量掌握得越多，就越能發(fā)揮其作用。本文擬從豚鼠基因組中克隆微衛(wèi)星位點(diǎn)，并篩選出多態(tài)性的位點(diǎn)及品系間呈一致差異的位點(diǎn)，為豚鼠育種、分子遺傳結(jié)構(gòu)鑒定及優(yōu)越性狀基因定位等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

英國種遠(yuǎn)交系花色豚鼠15只；Zmu-1: DHP遠(yuǎn)交系白色豚鼠20只；Zmu-2: DHP遠(yuǎn)交系黑色豚鼠15只；Zmu-1: DHP近交系白色豚鼠6只(其中1亞系1只，2亞系5只)；Zmu-2: DHP近交系黑色豚鼠4只。所有豚鼠性別不限，成年，體重300～450 g,普通級 [SCXK (浙) 2012-0052]，[SYXK(浙)2012-0178]。

1.2主要儀器

PCR儀(ABI公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠圖像儀(Bio-Rad公司)；離心機(jī)(Eppendorf公司)；等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豚鼠基因組DNA提取

豚鼠行心臟采血每只1 mL，肝素抗凝，按照說明書介紹用Takara試劑盒提取豚鼠基因組DNA，最后溶解在TE緩沖液中。

1.3.2 微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)

從加州大學(xué)圣克魯茲學(xué)院Genome Browser Home(http://genome.ucsc.edu/)網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫內(nèi)隨機(jī)查找核心為AC、GT重復(fù)序列的豚鼠微衛(wèi)星DNA序列，用Promer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，委托Invitrogen公司合成引物。

1.3.3 小樣本多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)引物篩選

隨機(jī)從上述5個豚鼠品系中，共選取10份樣本，通過PCR進(jìn)行初次擴(kuò)增，用凝膠電泳篩選出多態(tài)性較高、條帶少及清晰度高的位點(diǎn)引物。豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳及電泳條帶鑒定等方法見參考文獻(xiàn)[8]。

1.3.4 多樣本個體及品系間多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)引物篩選

從1.3.3篩選出的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中，挑選差異程度高、條帶距離較遠(yuǎn)的引物，對上述5個豚鼠品系的60份樣本進(jìn)行PCR，篩選出多態(tài)性高，品系內(nèi)基本一致、品系間呈差異的引物。

2 結(jié)果

2.1豚鼠多態(tài)性位點(diǎn)初步篩選

通過網(wǎng)站搜索，共設(shè)計(jì)400個豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，用小樣本篩選出約110對多態(tài)性引物，部分引物PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖1。

從圖中可見，被選豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增條帶清晰，多態(tài)性差異較大，條帶間區(qū)分顯著，條帶數(shù)量1～3條，其DNA序列長度在100～250 bp之間。

2.2多樣本豚鼠多態(tài)性位點(diǎn)的篩選

從110對引物擴(kuò)增的分子標(biāo)記中，挑選出51對擴(kuò)增質(zhì)量較好的多態(tài)性微衛(wèi)星引物(見表1)進(jìn)行PCR，其中15對引物(標(biāo)注*)擴(kuò)增2個近交系及3個遠(yuǎn)交系，36對引物擴(kuò)增3個遠(yuǎn)交系豚鼠DNA。部分引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見圖2。

從圖中可見，同一近交系豚鼠內(nèi)個體之間條帶一致性較高，不同近交系之間的條帶存在較大差異，而遠(yuǎn)交系個體及品系間條帶均呈現(xiàn)高度多態(tài)性，符合遺傳規(guī)律，說明本文中多態(tài)性位點(diǎn)的篩選方法及選擇出的位點(diǎn)是可靠的，這些引物擴(kuò)增的位點(diǎn)作為分子標(biāo)記，能用于豚鼠遺傳基因純度的檢測。

2.3品系間一致性差異位點(diǎn)的篩選

從51個位點(diǎn)中，挑選出豚鼠品系內(nèi)基因標(biāo)記基本一致，品系之間呈差異的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的基因型列于表2。

注：A：引物L(fēng)1 PCR產(chǎn)物；B：引物L(fēng)107 PCR產(chǎn)物；C：引物L(fēng)70 PCR產(chǎn)物；D：引物D122 PCR產(chǎn)物。M：Marker；泳道1～2：英國種；泳道3～4：Zmu-2: DHP遠(yuǎn)交系；泳道5～6：Zmu-1: DHP遠(yuǎn)交系；泳道7～8：Zmu-2: DHP近交系；泳道9～10：Zmu-1: DHP近交系。圖1 10個豚鼠DNA樣本PCR產(chǎn)物電泳圖Note. A: PCR products of primer L1; B: PCR products of primer L107; C: PCR products of primer L70; D: PCR products of primer D122. M: Marker; Lane 1-2: English species; Lane 3-4: Zmu-2: DHP outbred strain; Lane 5-6: Zmu-1: DHP outbred strain; Lane 7-8: Zmu-2: DHP inbred strain; Lane 9-10: Zmu-1: DHP inbred strain.Fig.1 PCR products of 10 DNA samples of guinea pigs

序號No.引物名稱Primernames引物序列Primersequences退火溫度Annealingtemperature序號No.引物名稱Primernames引物序列Primersequences退火溫度Annealingtemperature1L32aagggatgtgtgctactgtaggatctcgaaggatgttggagct6027L166ttccacttgggaatcaagcatacttgccaagcagactccct582L45*gctgaaacttagctctcagactgagagagatgttggtttgcttacc5828L360agctacgctgagtgatgttcaaccacacaggagcatgg583L53*tggcaaagttgcttcaatggaccttgcatagaatactctgggca6029L388tgagaaggcagctgaacttatccatgctactaccaagagc574L56*gtctgtggtaatcaggacaccgaatgggtcctggagcatgtctc5930D18ctgccaaggttccacagtgggtgtctactgcaacggaa625L57*gcactttctaacccgaatgagggctgtcatggagaaaggtcttgg5931D31tcgggatactgcaaactcattaaaggggcttctcaagtc626L70*tgtctaaacgtaggaaactgcacgatatggctcactgccaaggtc6032D41aaggggagaagcctgagtatggagttcagtgtctccac587L74*tcaaggtcagcctgaaccatacacagatgttctgagtccga5833D50caatgctgcagtttgggtttgtgtggatcttggccctc628L85*cagctttgaacaagggaggtagtgtgaagtttcttgcgatgg5834D55atgatggcgcatgcctgtagccattctggaacatggtgc629L148*tctttgcttccagcaggtgccctgatgaagcacttagg6035D105gacagacatgcctagattcagcacctccagtgacttggga5810D149*ctagtgccccttgtatctgggtcaactgaacctcagcac6036D107tgggcctttgtccttcatcccaaacagtccccacattgtg6211D77*ctgctcttgcctgaagtgctttgtgaccgtggcacaagg6237D113agctaaccagggcactttgctgatcagaccctaaggccca62

(續(xù)表)

注：*表示用于擴(kuò)增2個近交系及3個遠(yuǎn)交系的15對引物。

Note.*indicates the 15 pairs of primers used for PCR of the two inbred strains and three outbred strains.

注：A：引物L(fēng)45 PCR產(chǎn)物；B：引物L(fēng)70 PCR產(chǎn)物；C：引物L(fēng)74 PCR產(chǎn)物；D：引物D86 PCR產(chǎn)物。M：Marker；泳道1～20：Zmu-1: DHP遠(yuǎn)交系；泳道21：Zmu-1: DHP近交1系；泳道22～26：Zmu-1: DHP近交2系；泳道27～30：Zmu-2: DHP近交系；泳道31～45：英國種；泳道46～60：Zmu-2: DHP遠(yuǎn)交系。圖2 60個豚鼠DNA樣本PCR產(chǎn)物電泳圖Note. A: PCR products of primer L45; B: PCR products of primer L70; C: PCR products of primer L74; D: PCR products of primer D86. M: Marker; Lane 1-20: Zmu-1: DHP outbred strain; Lane 21: Zmu-1: DHP inbred strain, substrain 1; Lane 22-26: Zmu-1: DHP inbred strain, substrain 2; Lane 27-30: Zmu-2: DHP inbred strain; Lane 31-45: English species; Lane 46-60: Zmu-2: DHP outbred strain.Fig.2 PCR products of 60 DNA samples of guinea pigs

序號No.引物名稱Primernames基因型GenotypesZmu-1:DHP遠(yuǎn)交系Zmu-1:DHPoutbredstrainZmu-1:DHP近交系1系Zmu-1:DHPinbredstrain,substrain1Zmu-1:DHP近交系2系Zmu-1:DHPinbredstrain,substrain2Zmu-2:DHP遠(yuǎn)交系Zmu-2:DHPoutbredstrainZmu-2:DHP近交系Zmu-2:DHPinbredstrain英國種Englishspecies1L451/20a.16/20b.3/20ab1/1a3/5a.2/5ab13/15b.2/15ab4/4b2/15a.5/15b.8/15ab2L561/20a.16/20b.3/20ab1/1a5/5a13/15b.2/15ab4/4b5/15a.3/15b.7/15ab3L7011/20a.9/20b1/1a5/5a15/15b4/4b3/15a.12/15b4L7410/20a.1/20b.9/20ab1/1b5/5ab10/15b.5/15ab4/4b9/15b.6/15ab5L8517/20a.3/20b1/1b5/5a5/15a.10/15b3/4a.1/4b10/15a.5/15b6D11714/20a.6/20b1/1b5/5a15/15a3/4a.1/4b13/15a.2/15b7L1481/20a.10/20b.9/20ab1/1a5/5b5/15a.3/15b.7/15ab2/4b.2/4ab7/15a.5/15b.3/15ab8D10713/20b.7/20ab15/15ab2/15a.12/15ab9D11318/20b.2/20ab15/15a15/15a10D1225/20a.15/20b11/15a.4/15b12/15a.3/15b11D14017/20a.3/20b4/15a.11/15b6/15a.9/15b12L261/20a.12/20b.7/20ab1/15a.6/15b.9/15c10/15b.5/15c

從表中可見，遠(yuǎn)交系品系間差異較為一致的位點(diǎn)有L70、L74、D113、D122、D140、D107、L26；近交系品系間差異一致的位點(diǎn)有L45、L56、L70等；近交系支系間的差異位點(diǎn)有L85、D117、L148等。近交系同一基因座上兩個等位基因標(biāo)記與豚鼠毛色存在顯著關(guān)系，表2中的分子標(biāo)記或許對品系鑒定及新特征基因定位有一定意義。

3 討論

微衛(wèi)星DNA是動植物遺傳鑒定及基因定位等很有價(jià)值的分子標(biāo)記，目前已開發(fā)出大約兩萬個大小鼠微衛(wèi)星標(biāo)記，對利用大小鼠研究做出非常大的貢獻(xiàn)，但豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動物其開發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量少至甚少，然而豚鼠卻有許多大小鼠不具備的遺傳特性可以被人類利用[8]。其次微衛(wèi)星標(biāo)記眾多，用微衛(wèi)星檢定豚鼠品系遺傳質(zhì)量快速可靠，微衛(wèi)星標(biāo)記還可以輔助育種工作，因此開發(fā)大量豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記具現(xiàn)實(shí)意義。筆者曾從網(wǎng)站上隨機(jī)搜索并設(shè)計(jì)178對豚鼠微衛(wèi)星引物，篩選出25個多態(tài)性位點(diǎn)及28個潛在多態(tài)性位點(diǎn)，占29.8%[8]。隨著該網(wǎng)站豚鼠基因組數(shù)據(jù)不斷擴(kuò)充，本文又從該網(wǎng)站搜索到400個位點(diǎn)，剔除不能設(shè)計(jì)引物、擴(kuò)增效果不佳及非多態(tài)性的位點(diǎn)，篩選到約110個多態(tài)性位點(diǎn)，占27.55%。經(jīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步篩選出51個擴(kuò)增質(zhì)量較高的多態(tài)性位點(diǎn)，從中隨機(jī)挑選15對引物檢測了近交系及遠(yuǎn)交系豚鼠的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示遠(yuǎn)交系位點(diǎn)條帶多態(tài)性高，個別雜無規(guī)律；近交系條帶數(shù)少，位置集中，亮度高，且品系間呈一致性差異，檢測結(jié)果比較理想[7]。由此說明本文開發(fā)的位點(diǎn)是有效可靠的，適合于豚鼠日常遺傳質(zhì)量檢測。同時(shí)證明多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)開發(fā)難度較大，特別是篩選遠(yuǎn)交系間呈一致差異的位點(diǎn)難度則更大。

動物微衛(wèi)星位點(diǎn)引物的獲取至少有3種方法，一是直接從網(wǎng)上下載同種動物的基因組微衛(wèi)星資料，設(shè)計(jì)引物；二是從該動物基因組中克隆微衛(wèi)星序列，設(shè)計(jì)引物；三是用鄰近動物已有的引物。第一種方法簡單易行，篩選效率高，但需要已公布的物種基因組；第二種方法費(fèi)用較大，有假陽性克隆出現(xiàn)；第三種方法常出現(xiàn)偶然性，篩選效率較低。因此在已有基因組資料的情況下，第一種是值得推薦的方法。本文從加州大學(xué)圣克魯茲學(xué)院網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫，搜索到豚鼠基因組隨機(jī)片段序列的資料，在這些序列中找出微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)，然后用軟件設(shè)計(jì)豚鼠微衛(wèi)星引物，結(jié)果用51對多態(tài)性微衛(wèi)星引物，篩選到12個品系間基本呈一致差異的位點(diǎn)，筆者認(rèn)為本辦法篩選效果比較好，很少出現(xiàn)引物PCR擴(kuò)增不出條帶的情況。

多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記用于動物遺傳質(zhì)量檢測及群體遺傳基因分析的原理眾所周知。微衛(wèi)星基因座上兩個等位基因作為遺傳標(biāo)記，如果在兩個品系間呈一致性差異，那么該基因座就可以定位性狀基因。其原理是通過不同品系動物雜交和回交，如能發(fā)現(xiàn)某微衛(wèi)星位點(diǎn)上一個等位基因與某品系的一種性狀連鎖，而另一等位基因與另一品系的相對性狀連鎖，通過連鎖分析該微衛(wèi)星與性狀的連鎖性，計(jì)算出該連鎖率LOD值，那么只要LOD大于一定值，并確定該微衛(wèi)星位點(diǎn)位于第幾條染色體，就能將該性狀基因定位到相應(yīng)染色體上。本文發(fā)現(xiàn)，L70、D113、D122、D140等微衛(wèi)星位點(diǎn)的2個等位基因分別與2個遠(yuǎn)交系的不同毛色相對應(yīng)，L74、L56、L70等位點(diǎn)的等位基因與2個近交系的不同毛色相對應(yīng)，通過兩個品系的測交試驗(yàn)及連鎖分析，有可能找到與毛色連鎖的微衛(wèi)星位點(diǎn)，如毛色性狀又與某個性狀連鎖，則最后能將該性狀基因定位至特定染色體。因此，篩選品系間呈一致性差異的微衛(wèi)星是前提因素，在基因定位中有重要的作用。

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Screeningofmicrosatellitelociwithpolymorphismamongindividualsandstrainsofguineapigs

WEI Zhen， HONG Sheng-hui， LIU Di-wen*

(Laboratory Animal Center, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

ObjectiveTo screen the polymorphism microsatellite markers of guinea pigs, and provide basic information for identification of genetic structure and gene mapping in guinea pigs.MethodsThe genomic DNA of guinea pigs was found out on foreign websites, and microsatellite sequences characterized by AC/GT were selected. A total of 400 pairs of primers were designed using software according to their flanking sequences. After two rounds of PCR and electrophoresis, with the electrophoresis bands serving as genetic markers, the polymorphic primers were screened by the evaluation of microsatellite structure of guinea pigs.ResultsAt the first step, 10 DNA samples from 5 strains of guinea pigs were taken for PCR, and 110 pairs of polymorphic microsatellite markers with 1-3 electrophoretic bands were screened from the designed 400 pairs of primers. At the second step, 60 DNA samples from 5 strains of guinea pigs were assayed by PCR and 51 pairs of polymorphic primers with high resolution electrophoresis bands were screened from the above 110 pairs of primers. Among these screened 51 primers, more than 10 pairs of primers showed accordant or mostly accordant differences among strains.ConclusionsThe 51 pairs of primers are polymorphic among individuals and strains, and have not been found in other reports so far.They can be used for conventional genetic detection and related studies, and some of them can be used for gene mapping of the traits in guinea pigs.

Guinea pigs; Microsatellite markers; Polymorphism; Genetic structure

浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究(實(shí)驗(yàn)動物)計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2017C37144)；衛(wèi)生部科學(xué)研究基金(編號：98-2-323)。

衛(wèi)振(1982 -)，男，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物模型資源開發(fā)。E-mail: mudi001@126.com

劉迪文(1958 -)，男，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物育種與遺傳學(xué)。E-mail: liudiwen2004@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0032-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.007

2017-03-17