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    滇重樓預(yù)處理對(duì)膿毒癥大鼠的腸道功能保護(hù)及小腸HMGB1表達(dá)的影響

    2017-11-28 14:19:15熊偉陳思如修光輝凌斌孫潔劉萍
    云南中醫(yī)中藥雜志 2017年11期
    關(guān)鍵詞:膿毒癥

    熊偉+陳思如+修光輝+凌斌+孫潔+劉萍

    摘要:目的構(gòu)建脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)膿毒癥(sepsis)大鼠早期腸損傷模型,給予不同濃度滇重樓(Rhizoma Paridis of yunnan)灌胃預(yù)處理,探討滇重樓對(duì)膿毒癥大鼠的腸道功能保護(hù)及小腸高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)表達(dá)的影響。方法清潔級(jí)成年SD大鼠雌性80只,隨機(jī)分為5組,16只/組,對(duì)照組、模型組、低劑量組(20mg/kg.po)、中等劑量組(40mg/kg.po)、高劑量組(80mg/kg.po)。給予滇重樓預(yù)處理后,構(gòu)建膿毒癥大鼠模型(LPS 1mg/kg.iv),于24h取材,檢測(cè)血中白細(xì)胞數(shù)(WBC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、肌酐(Cre)、乳酸(Lac)的含量,行小腸病理檢查并組織學(xué)評(píng)分,采用ELISA法檢測(cè)血漿中二胺氧化酶(DAO)和D乳酸(D-Lac)的含量,分別采用WesternBlot和Q-PCR檢測(cè)小腸中HMGB1的蛋白及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果模型組大鼠與對(duì)照組比較全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高,WBC含量下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組與對(duì)照組比較大鼠存活率下降,病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);不同濃度滇重樓預(yù)處理均能改善膿毒癥大鼠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、存活率及病理組織學(xué)評(píng)分,但治療組與模型組比較ALT及高劑量組Cre差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組血漿中DAO和D-Lac含量高于對(duì)照組,而滇重樓治療組低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組大鼠小腸HMGB1的蛋白及mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組,而滇重樓治療組低于模型組(P<0.05)。結(jié)論滇重樓預(yù)處理可能通過抑制HMGB1表達(dá)參與抗炎反應(yīng),從而改善小腸黏膜屏障通透性,發(fā)揮腸道保護(hù)功能,同時(shí)提高膿毒癥大鼠的生存率,優(yōu)化預(yù)后。

    關(guān)鍵詞:膿毒癥;滇重樓;腸道功能保護(hù);高遷移率族蛋白B1

    中圖分類號(hào):R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1007-2349(2017)11-0071-04膿毒癥(sepsis)是重癥醫(yī)學(xué)科危重患者常見死因之一,患病率約為人口3‰,病死率高達(dá)20.3%~29.9%[1],是機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[2],也是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染、外科手術(shù)等常見并發(fā)癥。目前,膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,而腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能障礙是其主要機(jī)制之一,也是膿毒癥發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié),可誘發(fā)失控性全身炎癥反應(yīng)綜合征(systematic inflammatory response syndrome,SIRS)致多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),常表現(xiàn)為腸道功能紊亂發(fā)生最早及恢復(fù)最遲。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)是一種高度保守的非組DNA結(jié)合蛋白,可誘導(dǎo)RAGE、TLR2/4、NF-κB等炎癥因子釋放導(dǎo)致多器官靶細(xì)胞損傷,作為一種晚期炎癥因子在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-5]。

    據(jù)報(bào)道,滇重樓多種成分具有抗炎作用,臨床可用于器官保護(hù)、抗病原微生物、抗蛇蟲毒及治療免疫系統(tǒng)和婦產(chǎn)科疾病[6]。筆者前期研究,利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)15mg/kg腹腔注構(gòu)建大鼠腸黏膜功能障礙模型,滇重樓連續(xù)灌胃提示其腸黏膜抗炎保護(hù)作用。但結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),膿毒癥炎癥因子瀑布樣級(jí)聯(lián)釋放常使疾病迅速向MODS難逆轉(zhuǎn)性轉(zhuǎn)變,如何在SIRS早期通過抑制炎癥因子釋放成為干預(yù)疾病轉(zhuǎn)歸的重點(diǎn)。本課題擬通過LPS 1mg/kg股靜脈注射構(gòu)建膿毒癥大鼠早期腸損傷模型,探討滇重樓預(yù)處理對(duì)膿毒癥大鼠的腸道功能保護(hù)及小腸HMGB1表達(dá)的影響。

    1材料與方法

    1.1材料清潔級(jí)健康成年SD大鼠雌性80只,體重(200±10)g,由解放軍昆明總醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SYXK(滇)2016-2017)。滇重樓由昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科提供。脂多糖購于美國(guó)Sigma公司;血漿二胺氧化酶(DAO)和D乳酸(D-Lac)ELISA試劑盒購于武漢華美公司;HMGB1一抗、二抗購于abmart公司;Trizol Reagent 試劑盒購于Lifetech公司;RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購于Fermentas公司。

    1.2方法

    1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)采用成組設(shè)計(jì),清潔級(jí)健康SD大鼠雌性80只,隨機(jī)分為5組,對(duì)照組、模型組、低劑量組、中等劑量組、高劑量組,每組16只。將滇重樓顆粒用生理鹽水制成混懸液灌胃預(yù)處理,劑量按照成人劑量的5倍、10倍、20倍,分別對(duì)應(yīng)低劑量組(20 mg/kg)、中等劑量組(40 mg/kg)、高劑量組(80 mg/kg),對(duì)照組及模型組給予相同劑量生理鹽水。除對(duì)照組經(jīng)股靜脈予以相同劑量生理鹽水外,其余組經(jīng)股靜脈予以LPS 1 mg/kg.iv。灌胃前禁食禁飲2 h,灌胃后正常飲食,密切觀察大鼠排便進(jìn)食、呼吸心跳、精神狀態(tài)等變化,于24 h取材分別進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.2實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)腹腔注射水合氯醛0.4 g/kg麻醉大鼠,迅速開腹經(jīng)腹主動(dòng)脈采集動(dòng)脈血,分別檢測(cè)各組動(dòng)物白細(xì)胞數(shù)(WBC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、肌酐(Cre)、乳酸(Lac)觀察模型成立及臟器功能變化情況。

    1.2.3存活率及病理組織學(xué)評(píng)分觀察24 h內(nèi)膿毒癥大鼠存活率。分別取各組大鼠小腸用10%多聚甲醛固定24 h,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、常規(guī)切片和蘇木素-伊紅染色后,封片鏡檢,并對(duì)小腸切片病理組織學(xué)評(píng)分[7]:0級(jí),黏膜無明顯炎癥;I級(jí),黏膜有明顯水腫,黏膜下及肌層內(nèi)輕度白細(xì)胞浸潤(rùn);II級(jí),黏膜明顯水腫,黏膜下及肌層內(nèi)白細(xì)胞浸潤(rùn)增多;III級(jí),黏膜部分缺失,腺體部分不完整,白細(xì)胞聚集;IV級(jí),黏膜廣泛破壞,腺體多數(shù)不完整,潰瘍形成,肉芽組織形成,組織結(jié)構(gòu)明顯破壞。endprint

    1.2.4ELISA法檢測(cè)DAO和D-Lac水平分別取各組大鼠全血離心制成血漿,按每孔100ul分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本,37℃溫育,依次加生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液、底物溶液、終止溶液,終止反應(yīng)后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔OD值,分別對(duì)照DAO和D-Lac標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.2.5WesternBlot法檢測(cè)小腸HMGB1水平分別取小腸標(biāo)本制成檢測(cè)標(biāo)本,在樣品中等體積2×上樣緩沖液,按每孔100 ug蛋白上樣液。配10% SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)印,恒流轉(zhuǎn)膜,5% 脫脂牛奶封閉,室溫,搖床上搖2 h,加β-actin一抗,1:1000,4℃,過夜;TBST漂洗,加入HRP標(biāo)記通用型二抗(goat來源),孵育1 h,TBST漂洗,成像。掃描條帶,并用Image J進(jìn)行分析。

    1.2.6Q-PCR檢測(cè)小腸mRNA水平采用Trizol法分別提取小腸組織的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,Q-PCR儀擴(kuò)增(按說明書操作)。大鼠HMGB1上游引物5-TTCTTCTTGTTCTGTTCTGAG-3,下游引物5-CTTCGCAACATCACCAAT-3,PCR產(chǎn)物大小219 bp;內(nèi)參照β-actin上游引物5-CGAGAAGATGACCCAGAT-3,下游引物5-GATAGCACAGCCTGGATA-3。軟件自行得出△Ct、△△Ct、2-△△Ct值,由溶解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。全部數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P>0.05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組的組間及組內(nèi)均采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。率的比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料χ2檢驗(yàn),P<0.05提示兩個(gè)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05提示兩個(gè)率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果模型組大鼠與對(duì)照組比較全血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高,WBC含量下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);滇重樓治療組(低、中、高)與模型組比較全血中CK-MB、Lac含量下降,WBC含量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但治療組與模型組比較ALT及高劑量組Cre差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    2.2膿毒癥大鼠存活率及病理組織學(xué)評(píng)分結(jié)果模型組與對(duì)照組比較大鼠存活率下降,病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且模型組大鼠死亡率高達(dá)62.5%;滇重樓治療組(低、中、高)與模型組比較大鼠存活率升高,病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2,圖1。

    2.3滇重樓對(duì)膿毒癥大鼠腸道功能保護(hù)作用模型組與對(duì)照組比較血漿中DAO和D-Lac含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);滇重樓治療組(低、中、高)與模型組比較血漿中DAO和D-Lac含量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3,圖2。

    2.4滇重樓對(duì)膿毒癥大鼠小腸HMGB1的表達(dá)影響模型組與對(duì)照組比較小腸中HMGB1蛋白和mRNA含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);滇重樓治療組(低、中、高)與模型組比較小腸中HMGB1蛋白和mRNA含量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中中等劑量組下降最明顯。見表4,圖3~4。

    3討論

    滇重樓為云南道地藥材,資源豐富,品質(zhì)優(yōu)良,具有極高的藥用價(jià)值,其起效方式表現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化作用以及對(duì)炎癥細(xì)胞和因子、下丘腦-垂體-腎上腺軸、細(xì)胞凋亡、凝血/纖溶系統(tǒng)的影響[6],呈現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的起效方式,對(duì)于致病機(jī)制復(fù)雜的膿毒癥可以起到多方位作用。周滿紅等[7]利用重樓總皂苷(RPTS)干預(yù)膿毒癥大鼠肺損傷可使血中早期炎癥因子TNF-α和IL-1顯著降低。黃彥峰等[8]報(bào)道證實(shí)重樓水提液可調(diào)節(jié)小腸運(yùn)動(dòng)從而治療腸道功能紊亂,其機(jī)理可能與M膽堿能受體、腎上腺素能系統(tǒng)有關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),滇重樓連續(xù)灌胃可明顯改善膿毒癥大鼠腹瀉、精神萎靡、運(yùn)動(dòng)遲緩等癥狀,但是,膿毒癥炎癥因子瀑布樣級(jí)聯(lián)釋放常使疾病迅速向MODS難逆轉(zhuǎn)性轉(zhuǎn)變,如何在SIRS早期通過抑制炎癥因子釋放成為干預(yù)疾病轉(zhuǎn)歸的重點(diǎn)。

    Tropskaya NS和Zhang Y等[9-11]研究發(fā)現(xiàn)滇重樓等中藥可改善重癥患者APACHE-Ⅱ評(píng)分、腸鳴音評(píng)分和SIRS評(píng)分,緩解腹脹、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低,減少與膿毒癥相關(guān)的胃腸功能障礙,其機(jī)制可能與營(yíng)養(yǎng)支持、抗炎反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸蠕動(dòng)、抗膽堿能通路等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中,模型組與對(duì)照組相比大鼠血中ALT、CK-MB、Cre、Lac含量升高,WBC含量下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示模型組大鼠全身多個(gè)系統(tǒng)(肝、心、腎、循環(huán)及免疫等)均表現(xiàn)出功能障礙,且死亡率>60%,符合膿毒癥模型指標(biāo)。但治療組ALT和Cre與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),可能與滇重樓的肝腎毒性有關(guān)。經(jīng)滇重樓預(yù)處理的治療組與模型組比較,血漿中DAO和D-Lac降低,小腸病理組織學(xué)評(píng)分>Ⅲ級(jí)百分比下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明滇重樓可改善腸黏膜通透性,早期預(yù)防腸內(nèi)細(xì)菌移位及內(nèi)毒素入血,阻斷膿毒癥進(jìn)展,從而起到腸道保護(hù)作用。

    HMGB1通過壞死細(xì)胞破壞被動(dòng)釋放或主動(dòng)活化炎癥細(xì)胞,而介導(dǎo)早期和晚期炎癥反應(yīng)及適應(yīng)性免疫應(yīng)答,其含量與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12-14]。在本實(shí)驗(yàn)中,模型組小腸中HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組,而滇重樓治療組低于模型組(P<0.05),其中中等劑量組下降最明顯,說明滇重樓對(duì)晚期炎癥因子HMGB1的分泌有抑制作用。綜上所述,滇重樓預(yù)處理可能通過抑制HMGB1表達(dá)參與抗炎反應(yīng),從而改善小腸黏膜屏障通透性,發(fā)揮腸道保護(hù)功能,同時(shí)提高膿毒癥大鼠的生存率,優(yōu)化預(yù)后。endprint

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