CaMK II介導20-HETE誘導的乳鼠心肌細胞凋亡及肥大作用研究

賀 滟，賈蟬憶，韓 勇，郭立榮，陳遠壽

(1.遵義醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗室，貴州 遵義 563099)

基礎醫(yī)學研究

CaMK II介導20-HETE誘導的乳鼠心肌細胞凋亡及肥大作用研究

賀 滟1，賈蟬憶1，韓 勇1，郭立榮2，陳遠壽1

(1.遵義醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院生理學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院形態(tài)學實驗室，貴州 遵義 563099)

目的探究CaMK II在20-HETE誘導的乳鼠心肌細胞凋亡和肥大中的作用。方法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，隨機分為正常對照組(Con組)，20-HETE組，20-HETE+KN-93組以及KN-93組；采用CCK-8法檢測細胞活性、TUNEL法檢測凋亡、HE染色后檢測心肌細胞表面積、BAC法檢測細胞內(nèi)蛋白濃度；RT-qPCR檢測心肌肥大特征性基因心鈉肽(ANP)的表達；Western Blot檢測CaMK II及其磷酸化蛋白表達。結果與對照組相比，20-HETE組心肌細胞活性顯著下降，細胞凋亡率顯著升高(Plt;0.05)；同時，20-HETE明顯促進心肌細胞表面積增加、蛋白濃度升高以及肥大基因ANP的表達上調(diào)(Plt;0.05)；使用CaMK II抑制劑KN-93共孵育后，阻斷了20-HETE誘導的細胞凋亡和肥大的作用(Plt;0.05)；20-HETE促進心肌細胞CaMK II蛋白以及磷酸化CaMK II蛋白表達(Plt;0.05)，具有激活CaMK II作用。結論20-HETE激活CaMK II信號通路誘導心肌細胞肥大和凋亡。

20-羥二十烷四烯酸；CaMK II；細胞肥大；細胞凋亡

20-羥二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid ,20-HETE)是近年來發(fā)現(xiàn)的由細胞色素P-450(Cytochrome P450,CYP450)催化花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)生成的代謝產(chǎn)物，它的生成與很多血管性疾病的發(fā)生發(fā)展相關，如高血壓、腦血管疾病、腎臟疾病、冠心病、妊娠毒血癥等[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)20-HETE具有誘導心肌細胞凋亡作用[2]，但其中機制尚待進一步闡明。此外，有大量證據(jù)表明20-HETE參與了心衰相關的非適應性心肌肥大進程中，如在異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥大模型中，CYP4A和4F基因的表達增高、20-HETE的生成增加，抑制20-HETE生成可減小異丙腎上腺素誘導的心肌肥大[3]，但目前20-HETE促進心肌肥大的機制尚不清楚。

CaMK II是廣泛存在的一類由Ca2+/CaM激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶[4]，可活化多種下游底物，包括離子通道、鈣調(diào)節(jié)蛋白以及相關轉錄因子。在心臟中，CaMK II的激活一方面通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣動員引起鈣超載導致線粒體損傷以及活化多種凋亡信號通路誘導細胞凋亡，另一方面CaMKII可活化肥大相關轉錄因子，促進心肌細胞肥大[5-6]。而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)20-HETE亦可通過誘發(fā)心肌細胞鈣超載、過氧化損傷等機制導致細胞凋亡及心肌缺血再灌注損傷[7-8]。然而20-HETE對于心臟的作用是否與激活CaMK II相關，CaMK II信號通路是否參與了20-HETE誘導的細胞凋亡和肥大進程中，目前尚無報道。因此，本研究主要觀察20-HETE對于培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞凋亡及肥大的影響，并探究這其中CaMK II信號通路發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 20-HETE、KN-93及II型膠原酶(Sigma公司，美國)，胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)，青鏈霉素(哈藥集團制藥總廠，中國)、胎牛血清(江蘇恩莫阿賽生物，中國)，DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)，CCK-8細胞活性檢測試劑盒(同仁公司，日本)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司，中國)，逆轉錄試劑盒及熒光SYBR Green I(TaKaRa公司，日本)，RNA引物合成(大連寶生物公司，中國)，BCA蛋白定量試劑盒及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(上海碧云天公司，中國)，兔抗CaMKIIδ及兔抗磷酸化CaMKIIδ(p-CaMKIIδ-Thr287)抗體(Abcam公司，美國)，β-actin及HRP標記二抗(Proteintech公司，美國)，熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國)，PCR儀(BIO-RAD公司，美國)、酶標儀(Thermo公司，美國)、垂直電泳系統(tǒng)(BIO-RAD公司，美國)，CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 實驗采用1～3日齡SD大鼠，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。乳鼠開胸取出心臟，在冷DMEM/F12液中清洗后剪成1～3 mm3小塊并移入三角燒杯中，加入胰酶及膠原酶，置于37 ℃恒溫攪拌器中重復消化5次，每次7 min。細胞懸液置于含有15%胎牛血清的DMEM/F12中終止消化，1 000 g離心10 min，棄上清，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12混勻懸浮，利用差速貼壁分離法將細胞置于培養(yǎng)箱中孵育90 min，將分離的心肌細胞以2～5×105個/mL的密度接種于6孔或96孔細胞培養(yǎng)板中。加入1%青、鏈霉素及0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿嘧啶(抑制成纖維細胞生長)，于5%CO2細胞培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組 細胞無血清培養(yǎng)12 h后，分為對照組，培養(yǎng)液不做任何藥物處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h；溶媒組(Vehicle組)，培養(yǎng)液中加入相同濃度20-HETE的溶解物(乙醇)培養(yǎng)24 h；不同濃度20-HETE組(1 nmol/L、3 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，CCK-8法檢測心肌細胞活性；其他實驗將培養(yǎng)的細胞隨機分為4組：對照組，培養(yǎng)液不做任何藥物處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h；20-HETE組，培養(yǎng)液中加入100 nmol/L的20-HETE后繼續(xù)培養(yǎng)24 h；20-HETE+KN-93組，培養(yǎng)液中加入KN-93(3 μmol/L)孵育30 min后加入100 nmol/L 20-HETE培養(yǎng)24 h；KN-93組(3 μmol/L)，培養(yǎng)液中加入KN-93后培養(yǎng)24 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活性 乳鼠心肌細胞于96孔板中更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，分別加入1 nmol/L、3 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L不同濃度20-HETE，繼續(xù)培養(yǎng)24 h檢測細胞活性，分別加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，酶標儀450 nm波長檢測吸光度，每組設置6個復孔，重復3次，取平均值。

1.2.4 TUNEL法檢測心肌細胞凋 亡各組心肌細胞處理24 h后，4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS溶液沖洗3次，0.1% Triton X-100溶液處理10 min，PBS沖洗后加入50 μL TUNEL反應混合液，37 ℃避光孵育60 min，PBS溶液沖洗后加入DAPI(1 μg/mL)染色5 min標記所有細胞核，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長范圍為450～500 nm，發(fā)射波長范圍為515～565 nm，TUNEL陽性細胞為綠色熒光，計算每100個細胞中核陽性熒光占百分比。

1.2.5 HE染色法檢測心肌細胞表面積 將乳鼠心肌細胞接種于6孔板中，使用不同藥物處理后進行HE染色，采用Image-pro plus 6.0軟件分析系統(tǒng)測量心肌細胞的表面積。隨機選擇5個視野，每視野隨機測定10個心肌細胞，每組重復3次。

1.2.6 BAC法檢測心肌細胞內(nèi)總蛋白濃度 將乳鼠心肌細胞接種于6孔板中，按照實驗分組的細胞處理方式作用24 h后，收集細胞，PBS洗滌3次，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，12 000 g，4 ℃離心30 min，收集上清，依照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書，將標準品和樣品分別加到96孔板的標準品孔和樣品孔中，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min，用酶標儀測定595 nm波長的吸光度，根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度

1.2.7 RT-qPCR檢測心肌細胞心鈉肽(ANP)基因的表達 用Trizol提取心肌細胞中的總RNA，測定RNA純度，紫外分光光度計波長260 nm和280 nm檢測吸光度(A)，A260nm/A280nm值為1.8～2.0。將其逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。引物序列：β-actin 150 bp，上游：5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3 ＇，下游：5 ＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3＇；ANP 195 bp，上游：5-TGACAGGATTGGAGCCCAGAG-3 ＇，下游：5＇- TCGATCGTGATAGATGAAGACAGGA- 3 ＇。反應條件為，預變性94 ℃、30 s；變性94 ℃、5 s；退火60 ℃、30 s；共40個循環(huán)，結果分析采用2-ΔΔCt方法。

1.2.8 Western blot 檢測心肌細胞CaMK II及磷酸化CaMK II的表達 乳鼠心肌細胞使用不同藥物處理后，加入細胞裂解液，離心后取上清液BCA法檢測蛋白濃度。每上樣孔取60μg總蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜后封閉1 h，分別加入一抗(兔抗CaMKIIδ以及兔抗p-CaMKIIδ-Thr287，稀釋比例：1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜。加入二抗(抗鼠或抗兔，稀釋比例：1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL法顯影，暗室曝光，軟件分析蛋白條帶光度值，β-actin作為內(nèi)參(稀釋比例：1∶1 000)，以靶蛋白/β-actin的比值反應蛋白表達水平。

2 結果

2.1 不同濃度的20-HETE對心肌細胞存活率的影響 結果如圖1所示，不同濃度的20-HETE(1、3、10、50、100 nmol/L)處理的心肌細胞培養(yǎng)24 h后，均可降低心肌細胞的存活率，表明20-HETE具有細胞損傷作用，且呈濃度依賴性降低心肌細胞活性。與對照組相比，100 nmol/L的20-HETE處理后心肌細胞活性顯著下降至(58.3±4.22)%(Plt;0.05，見圖1)。

*：與Con組相比，Plt;0.05。 圖1 不同濃度處理條件下20-HETE對心肌細胞活性的影響

2.2 KN-93阻斷20-HETE誘導的乳鼠心肌細胞凋亡 結果如圖2所示，與對照組相比，20-HETE組TUNEL染色陽性細胞由2.0±1.05顯著增加至49.8±2.3(Plt;0.05)，提示20-HETE具有誘導乳鼠心肌細胞凋亡作用。而當培養(yǎng)液中加入KN-93(3 μmol/L)共同孵育24 h后，TUNEL染色陽性細胞數(shù)量顯著下降至23.1±4.12(Plt;0.05)，單獨KN-93組細胞凋亡與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05，見圖2)。

A：TUNEL染色后心肌細胞熒光圖片(400×)；B：TUNEL染色陽性細胞統(tǒng)計圖。*：與Con組相比，Plt;0.05；#：與20-HETE組相比，Plt;0.05。圖2 KN-93對20-HETE誘導的心肌細胞凋亡影響

2.3 20-HETE對心肌細胞表面積、總蛋白濃度的影響及KN-93的作用 為觀察20-HETE對心肌細胞肥大的作用，細胞經(jīng)20-HETE處理后，HE染色、IPP6圖像分析軟件測量心肌細胞表面積，BAC法檢測心肌細胞內(nèi)總蛋白濃度，結果見表1。20-HETE處理后的心肌細胞表面積由(501.2±20.5)μm2顯著增加至(956.7±85.5)μm2(Plt;0.05)，而與KN-93共同孵育后，與20-HETE組相比細胞表面積降至(687.5±102.0)μm2(Plt;0.05)，單獨KN-93組與對照組相比無顯著差異(Pgt;0.05，見表1)，通過對各組細胞總蛋白濃度檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比20-HETE組細胞總蛋白濃度顯著增加至(2.46±0.05)mg/mL(Plt;0.05)，而KN-93組細胞總蛋白濃度下降至(1.83±0.05)mg/mL(Plt;0.05)，而與對照組相比無顯著差異(Pgt;0.05，見表1)。

表1 20-HETE對心肌細胞表面積、總蛋白濃度的影響及KN-93的作用

組別心肌細胞表面積(μm2)心肌細胞總蛋白濃度(mg/mL)Control501.2±20.51.61±0.0320-HETE956.7±85.5*2.46±0.05*20-HETE+KN-93687.5±102.0#1.83±0.05#KN-93563.8±38.31.71±0.03

*：與Con組相比，Plt;0.05；#：與20-HETE組相比，Plt;0.05。

2.4 20-HETE及KN-93對肥大特征性基因ANP表達的影響 心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)表達增高是心肌肥大的特征性變化指標，因此本研究通過RT-qPCR檢測了ANP的mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)20-HETE處理后心肌細胞ANP基因表達與對照組相比增加了53.9%(Plt;0.05)，與20-HETE組相比，使用KN-93共孵育后顯著降低了ANP基因的表達(Plt;0.05)。如上結果表明20-HETE可有效促進心肌細胞相關肥大基因的表達，而KN-93可部分阻斷20-HETE的作用(見圖3)。

2.5 20-HETE對CaMK II蛋白及磷酸化CaMKII蛋白水平表達的作用 CaMKIIδ亞型特異性表達于心肌組織，CaMKIIδ表達升高、活性增強(磷酸化水平增加)被認為與細胞凋亡、肥大甚至心衰密切相關。因此本研究檢測了20-HETE對CaMKIIδ蛋白和磷酸化水平的影響。結果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比， 20-HETE處理后的心肌細胞中CaMKIIδ和磷酸化的CaMKIIδ蛋白表達與對照組相比明顯增加(Plt;0.05)，KN-93共孵育后阻斷了這種效應(Plt;0.05)。如上結果表明20-HETE具有促進CaMKIIδ表達升高、活性增強的作用(見圖4)。

*：與Con組相比，Plt;0.05；#：與20-HETE組相比，Plt;0.05。圖3 20-HETE及KN-93對ANP基因表達的影響

*：與Con組相比，Plt;0.05；#：與20-HETE組相比，Plt;0.05。圖4 20-HETE對CaMKIIδ蛋白表達及磷酸化水平的作用

3 討論

研究表明體內(nèi)多種活性物質(zhì)如內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管緊張素II(AngII)、去甲腎上腺素(NE)、異丙腎上腺素(ISO)等在促進心肌肥大及細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，從而參與相關心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，另外一種內(nèi)源性活性物質(zhì)20-HETE具有誘導心肌細胞凋亡作用以及參與多種因素誘發(fā)的心肌肥大進程中。2004年Granville等[10]首先發(fā)現(xiàn)在心肌組織中表達CYP4A和4F酶，抑制20-HETE合成可改善再灌注后的心臟功能恢復[11]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在離體大鼠心臟灌流模型中，20-HETE可通過增加活性氧簇(ROS)生成、誘發(fā)心肌細胞凋亡加重再灌注后心肌損傷[8]。此外，在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，20-HETE參與了血管緊張素II誘導的心肌細胞凋亡[2,12]。與如上研究一致，本研究中發(fā)現(xiàn)20-HETE可呈濃度依賴性降低心肌細胞活性，TUNEL檢測結果表明，20-HETE具有顯著促進細胞凋亡作用。

目前有大量證據(jù)表明20-HETE參與了心衰相關的非適應性心肌肥大進程中。如在異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥大模型中，CYP4A和4F基因的表達增高、抑制20-HETE生成可顯著降低心肌肥大程度[13]。在苯并芘(benzo(a)pyrene)誘導心肌肥大進程中，促進包括CYP4F4在內(nèi)的多種CYP ω-羥化酶的表達以及20-HETE的生成[14]。此外20-HETE也參與了AngII誘導的心肌肥大進程中[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)20-HETE處理后，心肌細胞表面積明顯增加、蛋白合成顯著增強，同時心肌肥大標志性基因ANP表達增高，表明20-HETE具有直接促進心肌細胞肥大的效應，但其中機制尚待進一步研究。

CaMK II是廣泛存在的一類由Ca2+/CaM激活的絲/蘇氨酸蛋白激酶[4]，包括4種不同亞型(CaMKIIα、CaMKIIβ、CaMKIIγ和CaMKIIδ)，其中在心臟中主要表達CaMKIIδ。CaMKⅡ的表達增高和活性增強在心肌肥大和心肌細胞凋亡的發(fā)生中起著非常重要的作用[5-6]。如在壓力超負荷、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)誘導的心肌肥大中，CaMKII的活性和表達增加[16]。另外，CaMK II的激活也參與了缺血再灌注損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等多種因素誘導的細胞凋亡進程中[17-18]。在心臟中CaMKII的激活依賴于Ca2+/CaM，CaMKII與Ca2+/CaM結合后構象改變暴露出活性中心，同時調(diào)節(jié)域中的自身磷酸化位點Thr287磷酸化，這是CaMKII發(fā)揮功能的重要特征[19]。

近年研究發(fā)現(xiàn)β-腎上腺素能受體(β-AR)激動劑(如異丙腎上腺素)以及G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)激動劑(如AngII、NE、ET-1)等活性物質(zhì)，可通過升高細胞內(nèi)Ca2+濃度或者增加ROS含量、導致CaMK II氧化激活等途徑活化CaMK II[20-21]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，20-HETE可促進心肌細胞CaMKIIδ蛋白過表達，同時提高CaMKIIδ的Thr287位點磷酸化水平，表明20-HETE具有明顯激活CaMK II的作用。雖然20-HETE激活CaMKII的具體機制尚待探明，但我們前期研究表明，20-HETE具有激活心肌細胞L-型鈣離子通道、增加細胞內(nèi)Ca2+濃度以及誘發(fā)細胞內(nèi)ROS生成等生物作用[7-8]，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高是激活CaMKII的必要條件，而細胞內(nèi)ROS水平增高則可對CaMKII調(diào)節(jié)結構域氧化修飾，阻止與催化結構域的重新結合從而保持激酶活性[4]。因此，20-HETE對心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度及ROS生成的影響是其激活CaMKII的重要的潛在機制。

在心臟中，CaMKII的激活進一步引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，導致線粒體內(nèi)鈣超載誘發(fā)凋亡，CaMKII還可通過激活c-jun氨基末端激酶(JNK)及核因子-κB(NF-κB)等信號轉導通路誘導心肌細胞凋亡[5]。另一方面，CaMKII激活后介導II類組蛋白脫酰酶(HDAC)的活化解除其對心肌細胞強化因子(MEF22)的抑制，通過轉錄因子MEF22激活誘導心肌肥大[6]。CaMKII還可通過ERK信號通路以及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)介導的活化T細胞核因子(NFAT)通路誘導ANP等肥大基因表達[22-23]。在本研究中，應用CaMK II特異性抑制劑KN-93抑制其作用，有效阻斷了20-HETE誘導的細胞凋亡及肥大效應，降低細胞凋亡率、細胞表面積、蛋白合成以及肥大基因ANP的表達，證實CaMKII介導了20-HETE所誘導的心肌細胞凋亡與肥大作用。

綜上所述，本研究在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，20-HETE具有上調(diào)CaMKIIδ表達和提高其磷酸化水平的作用，并通過激活CaMKII誘導了心肌細胞凋亡和肥大，這可能是20-HETE加重心肌缺血再灌注損傷的重要機制，為臨床治療相關的缺血性心肌病以及心衰的藥物治療靶點提供了新思路。

[1] Hoopes S L,Garcia V,Edin M L,et al.Vascular actions of 20-HETE [J].Prostaglandins amp; Other Lipid Mediators,2015,120：9-16.

[2] Bao Y,Wang X,Li W,et al.20-Hydroxyeicosatetraenoic acid induces apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes through mitochondrial-dependent pathways [J].J Cardiovasc Pharmacol,2011,57(3):294-301.

[3] Tse M M,Aboutabl M E,Althurwi H N,et al.Cytochrome P450 epoxygenase metabolite,14,15-EET,protects against isoproterenol-induced cellular hypertrophy in H9c2 rat cell line [J].Vascular Pharmacology,2013,58(5-6):363-373.

[4] Erickson J R,He B J,Grumbach I M,et al.CaMKII in the cardiovascular system:sensing redox states [J].Physiol Rev,2011,91(3):889-915.

[5] Feng N,Anderson M E.CaMKII is a nodal signal for multiple programmed cell death pathways in heart [J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2017,103：102:109.

[6] Anderson M E,Brown J H,Bers D M.CaMKII in myocardial hypertrophy and heart failure [J].J Mol Cell Cardiol,2011,51(4):468-473.

[7] Zeng Q,Han Y,Bao Y,et al.20-HETE increases NADPH oxidase-derived ROS production and stimulates the L-type Ca2+channel via a PKC-dependent mechanism in cardiomyocytes [J].American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology,2010,299(4):1109-1117.

[8] Han Y,Zhao H,Tang H,et al.20-Hydroxyeicosatetraenoic acid mediates isolated heart ischemia/reperfusion injury by increasing NADPH oxidase-derived reactive oxygen species production [J].Circ J,2013,77(7):1807-1816.

[9] Tham Y K,Bernardo B C,Ooi J Y,et al.Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure:signaling pathways and novel therapeutic targets [J].Archives of Toxicology,2015,89(9):1401-1438.

[10]Granville D J,Tashakkor B,Takeuchi C,et al.Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(5):1321-1326.

[11]Nithipatikom K,Endsley M P,Moore J M,et al.Effects of selective inhibition of cytochrome P-450 omega-hydroxylases and ischemic preconditioning in myocardial protection [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(2):H500.

[12]Zhao H,Qi G,Han Y,et al.20-Hydroxyeicosatetraenoic Acid Is a Key Mediator of Angiotensin II-induced Apoptosis in Cardiac Myocytes [J].J Cardiovasc Pharmacol,2015,66(1):86-95.

[13]Althurwi H N,Maayah Z H,Elshenawy O H,et al.Early changes in cytochrome P450s and their associated arachidonic acid metabolites play a crucial role in the initiation of cardiac hypertrophy induced by isoproterenol [J].Drug Metabolism and Disposition:the Biological Fate of Chemicals,2015,43(8):1254-1266.

[14]Aboutabl M E,Zordoky B N,Hammock B D,et al.Inhibition of soluble epoxide hydrolase confers cardioprotection and prevents cardiac cytochrome P450 induction by benzo(a)pyrene [J].Journal of Cardiovascular Pharmacology,2011,57(3):273-281.

[15]Elkhatali S,El-sherbeni A A,Elshenawy O H,et al.19-Hydroxyeicosatetraenoic acid and isoniazid protect against angiotensin II-induced cardiac hypertrophy [J].Toxicology and Applied Pharmacology,2015,289(3):550-559.

[16]Backs J,Backs T,Neef S,et al.The delta isoform of CaM kinase II is required for pathological cardiac hypertrophy and remodeling after pressure overload [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(7):2342-2347.

[17]Roe N D,Ren J.Oxidative activation of Ca2+/calmodulin-activated kinase II mediates ER stress-induced cardiac dysfunction and apoptosis [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2013,304(6):H828-839.

[18]Di carlo M N,Said M,Ling H,et al.CaMKII-dependent phosphorylation of cardiac ryanodine receptors regulates cell death in cardiac ischemia/reperfusion injury [J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2014,74(3)：274-283.

[19]Erickson J R.Mechanisms of CaMKII Activation in the Heart [J].Frontiers in Pharmacology,2014,5(5)：59.

[20]Anderson M E.Oxidant stress promotes disease by activating CaMKII [J].Journal of Molecular And Cellular Cardiology,2015,89(Pt B):160-167.

[21]Zhang T,Zhang Y,Cui M,et al.CaMKII is a RIP3 substrate mediating ischemia- and oxidative stress-induced myocardial necroptosis [J].Nature Medicine,2016,22(2):175-182.

[22]Cipolletta E,Rusciano M R,Maione A S,et al.Targeting the CaMKII/ERK Interaction in the Heart Prevents Cardiac Hypertrophy [J].Plos One,2015,10(6):e0130477.

[23]Kreusser M M,Lehmann L H,Keranov S,et al.Cardiac CaM Kinase II genes delta and gamma contribute to adverse remodeling but redundantly inhibit calcineurin-induced myocardial hypertrophy [J].Circulation,2014,130(15):1262-1273.

[收稿2017-07-24;修回2017-08-25]

(編輯：譚秀榮)

基礎醫(yī)學研究

StudyontheroleofCaMKII-mediated20-HETE-inducedhypertrophyandapoptosisinneonatalratcardiomyocytes

HeYan1,JiaChanyi1,HanYong1,GuoLirong2,ChenYuanshou1

(1.Department of Physiology,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Morphological Laboratory,School of Basic Medical Sciences,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo investigate the role of CaMKII on 20-HETE-induced cardiomyocyte apoptosis and hypertrophy in neonatal rats.MethodsPrimary cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into normal control group (Con group),20-HETE group,20-HETE+KN-93 group and KN-93 group.CCK-8 method was used to detect the cell activity and TUNEL assay was performed to analyze the cell apoptosis.The surface area of cardiomyocytes was measured after HE staining and total intracellular protein levels were detected by commercial BCA protein kit.RT-qPCR was used to measure the expression of hypertrophic biomarkers ANP.Western blot assay was performed to measure the expression of CaMKII and phospho-CaMKII.ResultsCompared with Con group,the cell viability was obviously decreased and the apoptotic rate was significantly increased in 20-HETE group (Plt;0.05).Meanwhile,the cell surface area and total protein levels were significantly increased and the mRNA expression of hypertrophic markers ANF was up-regulated by 20-HETE treatment (Plt;0.05),whereas co-treatment with KN-93 (3 μmol/L) significantly attenuated the effects of 20-HETE-induced apoptosis and hypertrophy (Plt;0.05).Finally,treatment with 20-HETE significantly increased the protein expression of CaMKII and phospho-CaMKII in cardiomyocytes (Plt;0.05),indicating 20-HETE activated the CaMKII signaling pathway.Conclusion20-HETE activates the CaMKII signaling pathway,which is involved in 20-HETE-induced apoptosis and hypertrophy in neonatal rat cardiomyocytes.

20-HETE; CaMKII; hypertrophy; apoptosis

國家自然科學基金資助項目(NO：81460040)；貴州省科學技術基金資助項目(NO：黔科合LH字[2014]7544)；遵義醫(yī)學院博士啟動基金項目(NO：F-659)。

陳遠壽，男，教授，碩士生導師，研究方向：神經(jīng)生理學，E-mail:hotfog@126.com；韓勇，男，副教授，研究方向：心臟生理學，E-mail:hany@zmc.edu.cn。

R542.2

A

1000-2715(2017)05-0475-07