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    均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖熱水浸提工藝

    2017-11-28 05:36:20單冰冰張建永黃厚今
    關(guān)鍵詞:水料鐵皮石斛

    單冰冰,陳 寬,李 婷,張建永,黃厚今

    (1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥物分析教研室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

    均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖熱水浸提工藝

    單冰冰1,陳 寬1,李 婷1,張建永1,黃厚今2

    (1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥物分析教研室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

    目的采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖熱水浸提工藝參數(shù),為其多糖資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。方法首先在建立多糖含量測(cè)定方法并進(jìn)行驗(yàn)證的基礎(chǔ)上,以黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),以提取時(shí)間和提取溫度和水料比為因素,按照均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果建立黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖的含量測(cè)定方法,同時(shí)優(yōu)化的鐵皮石斛熱水浸提最佳條件:提取時(shí)間78.5 min,提取溫度90℃,水料比為70∶1(mL/g),提取2次。樣品多糖提取率實(shí)測(cè)平均值41.31%與預(yù)測(cè)值42.32%相差較小,重復(fù)性好。結(jié)論本研究?jī)?yōu)化的提取工藝,穩(wěn)定可行,可用于黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖的熱水浸提。

    鐵皮石斛;多糖;提取工藝優(yōu)化;均勻設(shè)計(jì)

    鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)的干燥莖[1],具有益胃生津、滋陰清熱等功效,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫力調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、促消化等藥理作用[2 ],眾多文獻(xiàn)報(bào)道其主要有效成分為多糖[3],因此多糖的提取是充分利用鐵皮石斛的重要環(huán)節(jié)之一[4]。目前鐵皮石斛多糖的提取工藝主要有熱水浸提法、加熱回流法、超聲提取法、微波提取法、酶提法[5]等,各個(gè)方法的提取率相差較大且結(jié)論不一,原因可能是不同地區(qū)的鐵皮石斛多糖成分不同,多糖中的單糖比例存在差異,推測(cè)與其種質(zhì)遺傳差異相關(guān)[6-7]。貴州地處云貴高原多山地,雖與浙江都在北緯30度附近,但黔產(chǎn)鐵皮石斛多為引種栽培,主要在黔西南州和黔南州,其他也有散在基地種植。不同的種植環(huán)境導(dǎo)致黔產(chǎn)鐵皮石斛質(zhì)量可能與其他產(chǎn)地鐵皮石斛存在一定差異,研究發(fā)現(xiàn)浙江鐵皮石斛多糖含量最高(47.90%),其次為廣東與廣西(42.84%、42.32%)[8],目前貴州產(chǎn)鐵皮多糖石斛含量相對(duì)較低,有報(bào)道貴州獨(dú)山的鐵皮石斛多糖含量為18.20%[9]。推測(cè)可能與栽培方式不同有關(guān),盆栽模式、大棚栽培、巖石栽培、野生貼樹(shù)栽培的鐵皮石斛多糖含量差異在10%左右[10]。另外黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖含量較低可能與其提取方法及工藝尚未優(yōu)化有關(guān),采用藥典及其他產(chǎn)區(qū)的方法可能致提取不完全。

    因此有必要對(duì)黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖提取工藝進(jìn)行考察,提高鐵皮石斛利用率,為藥材深加工提高必要保障。

    均勻設(shè)計(jì)是方開(kāi)泰將數(shù)論和多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合創(chuàng)造的一種適用于多因素多水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、均勻分散、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)處理和方便、迅速、準(zhǔn)確的特點(diǎn),可使實(shí)驗(yàn)點(diǎn)具有更好的代表性[11]。其常規(guī)分析多先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)再進(jìn)行設(shè)計(jì)法優(yōu)化需花費(fèi)較多時(shí)間,前后測(cè)量之間存在時(shí)間間隔,易帶來(lái)較大外來(lái)影響,對(duì)實(shí)驗(yàn)造成誤差。本研究結(jié)合文獻(xiàn)[12-14]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將均勻設(shè)計(jì)直接運(yùn)用于黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖提取效果影響因素中,優(yōu)選黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖熱水浸提工藝條件,以期為黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器 HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);FW135型中藥材粉碎機(jī)(天津泰斯特公司);冷凍離心機(jī)(上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司);Spectra Max Plus 384全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司)。

    1.2 材料 實(shí)驗(yàn)用鐵皮石斛由貴州省福泰來(lái)科技有限公司提供,經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院聶緒強(qiáng)博士鑒定為鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)的干條;無(wú)水乙醇(批號(hào):20160201,重慶川東化工有限公司);苯酚(批號(hào):P100762,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);37%濃硫酸(批號(hào):20130314,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);葡萄糖對(duì)照品(批號(hào):0833-9501中國(guó)藥品生物制品檢定所);雙蒸水。

    2 方法

    2.1 多糖的含量測(cè)定

    2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 參照2015版《中國(guó)藥典》一部中鐵皮石斛含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品,精密稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品約14 mg,加水溶液稀釋成每1毫升含140 μg的溶液。

    2.1.2 供試品溶液的制備 鐵皮石斛粉碎成粉末過(guò)60目篩,精密稱取其約0.3 g,按提取時(shí)間78.5 min、提取溫度90℃、水料比70∶1(mL/g)、熱水浸提2次,合并提取液,定容置100 mL量瓶中,4 ℃、2550×g下離心10 min去渣,上清液加5倍體積80%乙醇4℃沉淀1 h,4 ℃、2550×g下離心15 min,沉淀用4倍體積80%乙醇洗滌兩次,離心得鐵皮石斛粗多糖沉淀,沉淀以雙蒸水溶解至10 mL量瓶中,得供試品溶液。

    2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,分別置5 mL具塞試管中,各加水補(bǔ)至0.5 mL,精密加入5%苯酚溶液0.5 mL,混勻,硫酸溶液2.5 mL,混勻,置沸水浴中加熱20 min,取出,置冰水浴中冷卻5 min取出,以相應(yīng)試劑為空白。使用酶標(biāo)儀在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

    2.1.4 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液0.5 mL,置10 mL具塞試管中,按“2.1.3”線性關(guān)系考察的建立項(xiàng)下的方法,自“精密加入5%苯酚溶液2.5 mL”起,依法測(cè)定吸光值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中的粗多糖濃度,計(jì)算提取率,公式如下:提取率%= (C×V1×V2)/ (m×1000)×100%;C:粗多糖濃度mg/mL;V1:提取后定容的體積mL;V2:粗多糖定容的體積mL;m:鐵皮石斛質(zhì)量g。

    2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液6份,每份0.5 mL,按照“2.1.3”項(xiàng)下的方法處理并測(cè)定吸光值。

    2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按照“2.1.3” 項(xiàng)下的方法處理并測(cè)定吸光值。

    2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,在室溫下放置,分別于5、10、30、60、90、120、180、240 min后按“2.1.3”項(xiàng)下的方法處理并測(cè)定吸光值。

    2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 按照“2.1.2” 項(xiàng)下方法,取0.15 g的已知含量的鐵皮石斛,平行制備6份供試品溶液,分別加入一定量的葡萄糖對(duì)照品溶液(濃度:140 μg/mL),按“2.1.3”項(xiàng)下的方法測(cè)定吸光值,計(jì)算回收率及其RSD值。

    2.2 熱水浸提鐵皮石斛多糖的工藝流程 鐵皮石斛粉碎成粉末過(guò)60目篩,精密稱取其約0.3 g,采用熱水浸提法,提取液處理方法同“2.1.2”。

    2.3 熱水浸提工藝優(yōu)選 本研究主要對(duì)熱水浸提工藝部分采用均勻設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平:采用3因素6水平,考察提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、水料比(C),水平見(jiàn)表1。以多糖收率為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選鐵皮石斛熱水浸提多糖的最佳條件,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)處理3次取平均值。

    表1因素水平表

    水平A/提取時(shí)間/minB/提取溫度/℃C/水料比/倍1304020245503036060404757050590806061059070

    3 結(jié)果

    3.1 多糖的含量測(cè)定

    3.1.1 線性關(guān)系考察 以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(X),吸光值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y= 0.1437X- 0.0147,R2= 0.999,表明葡萄糖濃度在28 ~ 140 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    3.1.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)各測(cè)定結(jié)果計(jì)算,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.08%、3.79%、3.07%,表明本方法精密度良好,重復(fù)性良好,同時(shí)表明供試品溶液在240 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    3.1.3 加樣回收率試驗(yàn) 將“2.1.8”項(xiàng)下加樣回收率供試品溶液進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2多糖加樣回收率試驗(yàn)

    供試品含量(mg)加入量(mg)測(cè)得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.09990.10000.198898.940.09990.10000.198298.310.09990.10000.196596.5798.632.550.10000.10000.196296.220.09980.10000.2030103.240.09880.10000.198398.53

    3.2 熱水浸提鐵皮石斛多糖的工藝

    3.2.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排與試驗(yàn)結(jié)果

    序號(hào)因素ABC提取率(%)190607039.86275502035.24345405038.014105804033.72560906038.87630703032.01

    3.2.2 均勻設(shè)計(jì)回歸分析 以各因素為自變量,以鐵皮石斛多糖提取率為因變量,用DPSV7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行二項(xiàng)式逐步回歸分析,得到回歸方程為:Y=0.521687164-0.003715476190B-0.0024519979296C+0.00006469565217BC,方差結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4二次多項(xiàng)式逐步回歸法處理的數(shù)據(jù)結(jié)果

    因素偏相關(guān)tPB-0.98899.41090.0025C-0.96355.09230.0146BC0.98598.32190.0036

    相關(guān)系數(shù)R= 0.996 8,F(xiàn)值 = 105.270 6,顯著水平P= 0.009 4,剩余標(biāo)準(zhǔn)差S= 0.003 9,說(shuō)明該方程能很好的擬合熱水浸提鐵皮石斛多糖的過(guò)程。由回歸方程可知,溫度和水料比對(duì)多糖提取有一定的影響,提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響較小,二次多項(xiàng)式逐步回歸法可得到最高指標(biāo)時(shí)各個(gè)因素組合為,熱水浸提時(shí)間78.5 min,溫度90 ℃,水料比70∶1,提取率為42.32%。

    3.2.3 優(yōu)選工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn) 將鐵皮石斛粉碎成粉末過(guò)60目篩,精密稱取其約0.3 g,加70倍水以90 ℃熱水浸提78.5 min,提取2次,進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)表5,3次實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%,驗(yàn)證提取率41.31%與均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)預(yù)測(cè)提取率42.32%接近,表明該提取工藝模型準(zhǔn)確,穩(wěn)定可行。

    表5驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

    序號(hào)驗(yàn)證提取率(%)RSD(%)預(yù)測(cè)提取率(%)141.16241.620.6642.32341.14

    3.2.4 提取次數(shù)的考察 鐵皮石斛粉碎成粉末過(guò)60目篩,精密稱取約0.3 g,按上述條件分別提取1、2、3、4次,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)處理3次取平均值,結(jié)果見(jiàn)表6。提取1次時(shí)收率最低,可能是提取不完全,提取2、3、4次的收率相差不大,提取2次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最小,結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中能耗節(jié)約等原則,選擇提取次數(shù)為2次。

    表6提取次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

    提取次數(shù)平均提取率(%)RSD(%)137.887.07241.410.66341.402.60442.983.36

    4 討論

    本研究首先建立了黔產(chǎn)鐵皮石斛的多糖含量測(cè)定方法,進(jìn)而采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化了熱水浸提工藝,結(jié)果經(jīng)過(guò)優(yōu)化提取2次后,多糖提取率41.41%,且工藝穩(wěn)定簡(jiǎn)單。

    常規(guī)測(cè)量鐵皮石斛多糖,采用硫酸-苯酚法以紫外分光光度計(jì)完成,測(cè)試費(fèi)時(shí)且須清洗比色皿。本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)法同時(shí)檢測(cè)多樣本,測(cè)定樣品僅需幾百微升液體,測(cè)量時(shí)可避免試劑、原料的浪費(fèi),短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)多個(gè)樣品,操作簡(jiǎn)便快捷,減少儀器和外界環(huán)境干擾,使結(jié)果準(zhǔn)確性穩(wěn)定性更好[15-16]。

    目前鐵皮石斛多糖提取工藝的研究較多,多采用單因素復(fù)合正交設(shè)計(jì)或響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法。提取方法多以熱水浸提為主,如王培培等[12]采用正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化多糖提取工藝水液比為40∶1、浸提溫度70 ℃、浸提時(shí)間2 h、浸提2次,提取率31.9%。王琳等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝,水料比為31.28∶1、醇沉濃度95.42%、提取時(shí)間3 h、提取3次,提取率30.83%。然而上述方法存在工作量大、試驗(yàn)次數(shù)多、時(shí)間間隔久等特點(diǎn)。本研究采用均勻設(shè)計(jì)可使試驗(yàn)次數(shù)極大減少,同時(shí)優(yōu)化的范圍較寬,利于以后的中試放大。在試驗(yàn)中,本文結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道采用了3因素6水平方法,考察提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、水料比(C)三個(gè)主要因素,水平數(shù)高于文獻(xiàn)中正交設(shè)計(jì)的3水平[12],數(shù)據(jù)采用二項(xiàng)式逐步回歸分析處理得回歸方程并進(jìn)行分析,建立各因素與評(píng)價(jià)指標(biāo)間的數(shù)學(xué)模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度和水料比對(duì)黔產(chǎn)鐵皮石斛收率影響較大,優(yōu)化出了最優(yōu)條件。驗(yàn)證試驗(yàn)表明均勻設(shè)計(jì)用于黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖提取,驗(yàn)證值與理論值很接近,并通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證,說(shuō)明采用均勻設(shè)計(jì)和二次多項(xiàng)式回歸分析得到的試驗(yàn)因素的方法可行。

    最終得出鐵皮石斛多糖的最佳提取條件:70倍水,90 ℃熱水浸提78.5 min,提取2次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黔產(chǎn)鐵皮石斛的得率在41.41%,多糖提取的各因素重要程度依次為提取溫度gt;水料比gt;提取時(shí)間,雖然各因素重要程度與文獻(xiàn)中云南產(chǎn)鐵皮石斛多糖提取因素一致:提取溫度gt;水料比gt;提取時(shí)間[14],但具體的水提倍數(shù)、提取時(shí)間相差較大,所以本提取工藝可能更適合黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖的提取。

    綜上所述,均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化對(duì)黔產(chǎn)鐵皮石斛多糖提取工藝并采用酶標(biāo)儀檢測(cè)其含量是一種操作簡(jiǎn)單、方便的方法,且工藝穩(wěn)定可行,對(duì)于優(yōu)化不同產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛多糖提取工藝具有指導(dǎo)意義。

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    [15]趙艷,畢榮宇,牟德華.利用酶標(biāo)儀測(cè)定6種食用菌中多糖含量 [J].食用菌,2013,35(1):59-61.

    [16]趙福坤,吳芹,陸遠(yuǎn)福,等.金釵石斛總生物堿提取及含量測(cè)定方法的改進(jìn) [J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,38(5):533-535.

    [收稿2017-06-30;修回2017-08-26]

    (編輯:王福軍)

    綜述

    OptimizationofhotwaterextractionforpolysaccharidesinDendrobiumofficinaleKimuraetMigofromGuizhoubyuniformdesign

    ShanBingbing1,Chenkuan1,LiTing1,ZhangJianyong1,HuangHoujin2

    (1.Department of Pharmacy,School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Toxicology,School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

    ObjectiveTo optimize the hot water extraction of polysaccharides in Dendrobium officinale Kimura et Migo from Guizhou in order to provide reference for the development and utilization.MethodsFirstly,a method for determination of polysaccharide content was tested.The extraction time,temperature and ratio of water to material in extraction process were optimized by uniform design based on the yield of polysaccharides of Dendrobium officinale Kimura et Migo from Guizhou.ResultsThe content determination method of polysaccharides was established.The optimization of hot water extraction conditions were 78.5 min,90℃,70∶1 (ml/g) ratio of water to Dendrobium officinale Kimura et Migo and for 2 times.The extraction rate of polysaccharide was 41.31%,less than the predicted value 42.32%,but it exhibited good repeatability.ConclusionThe optimized extraction process is stable and feasible and could be used for hot water extraction of polysaccharides Dendrobium officinale Kimura et Migo.

    Dendrobium officinale Kimura et Migo; polysaccharide; optimization of extraction; uniform design

    貴州省科技重大專項(xiàng)(NO:黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6010)。

    張建永,男,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:中藥質(zhì)量評(píng)價(jià),E-mail:zhangjianyong2006@126.com; 黃厚今,男,博士,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:營(yíng)養(yǎng)毒理學(xué),E-mail:1026553087@qq.com。

    R917

    A

    1000-2715(2017)05-0560-04

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