慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)雷尼丁受體及其調(diào)節(jié)蛋白Calstabin2表達(dá)異常的研究

劉明明，牛治鑫，周永忠，胡淑婷

·論 著·

慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)雷尼丁受體及其調(diào)節(jié)蛋白Calstabin2表達(dá)異常的研究

劉明明，牛治鑫，周永忠，胡淑婷

目的研究慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)雷尼丁受體及其調(diào)節(jié)蛋白FK506結(jié)合蛋白(Calstabin2)的異常表達(dá)。方法雄性SD大鼠25只，按照3∶2的比例隨機(jī)分為心衰組(15只)和假手術(shù)組(10只)，運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡、Western-blot等方法研究2組大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量及鈣釋放通道雷尼丁受體(RyR2)和其調(diào)節(jié)蛋白Calstabin2表達(dá)的變化。結(jié)果慢性心衰大鼠心功能LVEDP(8.91±2.16)mmHg、dp/dtmax(2 250.19±172.44)mmHg/s，顯著低于假手術(shù)組大鼠心功能LVEDP(4.17±1.15)mmHg、dp/dtmax(4 822.54±221.62)mmHg/s(Plt;0.05)；慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量ΔF/F0=25.3±2.8，顯著低于假手術(shù)組大鼠肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量ΔF/F0=47.8±3.5(Plt;0.05)；慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Calstabin2的表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)。結(jié)論Calstabin2的表達(dá)下調(diào)所致RyR2穩(wěn)定性下降是導(dǎo)致心衰的原因之一。

心力衰竭；肌漿網(wǎng)；雷尼丁受體；FK506結(jié)合蛋白

近年來(lái)，心血管疾病逐漸威脅到人類的健康，在致死性疾病中居于首位。心力衰竭是所有心臟疾病發(fā)展的終末階段，病理生理學(xué)特點(diǎn)為心輸出量降低，重要臟器組織灌注不足，體循環(huán)或肺循環(huán)充血[1]。各種導(dǎo)致心衰的原因中，心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道狀態(tài)以及調(diào)控鈣離子通道的蛋白異常是其發(fā)病的主要原因之一[2]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠慢性心衰模型作為研究對(duì)象，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡和免疫印跡等技術(shù)對(duì)慢性心衰的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行討論和研究。

1 材料與方法

1.1 材料：選用標(biāo)準(zhǔn)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠25只，體質(zhì)量200～250 g，按照3∶2的比例隨機(jī)分為心衰組即心梗手術(shù)組(n=15)和假手術(shù)組(n=10)。試劑：Fluo-5N/AM熒光染料購(gòu)于Biotium公司，用二甲基亞砜溶解備用；RyR antibody和Calstabin2 antibody均購(gòu)于Abcam公司；Ⅱ型膠原酶、小牛血清蛋白、HEPES等購(gòu)于Sigma公司。

1.2 建構(gòu)大鼠慢性心衰模型：2組大鼠都用20%氨基甲酸乙酯進(jìn)行腹腔注射麻醉(3.5 mL/kg)，將已麻醉的大鼠固定在鼠臺(tái)上，手術(shù)暴露氣管，然后行經(jīng)喉氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，手術(shù)逐層開(kāi)胸，暴露心臟，穿線并結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)(假手術(shù)組僅做LAD穿線，并不結(jié)扎)。術(shù)后觀察20 min左右大鼠心電圖穩(wěn)定以后手術(shù)關(guān)閉胸腔，待其蘇醒恢復(fù)自主呼吸后回籠飼養(yǎng)[3-4]。手術(shù)前后，均應(yīng)記錄大鼠的心電圖，當(dāng)Ⅱ?qū)?lián)ST段出現(xiàn)弓背上抬時(shí)，說(shuō)明冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎成功(圖1-圖2，目錄后)。2組大鼠均飼養(yǎng)28 d，自由飲食。

模型建立28 d(4周)后，分別觀察并記錄2組大鼠的各項(xiàng)心功能指標(biāo)，包括心率(HR)、左心室壓力的最大上升速率(dp/dtmax)和左心室壓力的最大下降速率(dp/dtmin)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)。

1.3 分離大鼠心室肌細(xì)胞后運(yùn)用膠原酶Ⅱ消化法分離2組大鼠的心室肌細(xì)胞[5]：首先用20%氨基甲酸乙酯進(jìn)行腹腔注射麻醉(3.5 mL/kg)，將大鼠全身肝素化，立即開(kāi)胸剪下大鼠心臟放入無(wú)鈣臺(tái)式液(0 ℃)中清洗；然后主動(dòng)脈逆行插管，結(jié)扎、固定后將心臟懸掛于Langendorff裝置下，依次行無(wú)鈣臺(tái)式液逆行灌流(5～7 min)、臺(tái)式液灌流 (8～10 min)；隨后將心室剪下(心衰組在梗死區(qū)部位取材)，置于改良的Kraft-Bruhe(KB)液(37 ℃)中，將心室肌剪碎并吹打2 min，通過(guò)過(guò)濾獲得單個(gè)心室肌細(xì)胞，再將其沉淀10～15 min后置于改良的KB液中，室溫下靜置1～1.5 h后用于檢測(cè)Ca2+容量。

1.4 大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量的檢測(cè):以熒光染料Fluo-5N/AM將2組心肌細(xì)胞孵育好后放置于細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液中，用激光共聚焦掃描顯微鏡記錄SR內(nèi)的Ca2+容量，選用40倍油鏡，孔徑大小(NA)為1.25 mm，發(fā)射波波長(zhǎng)500～560 nm，激發(fā)光為波長(zhǎng)488 nm的氬光。激光共聚焦顯微鏡的成像方式為面掃描(xyz)，采樣速率20 s/幀。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫20～22 ℃的條件下進(jìn)行。Fluo-5N/AM是一種肌漿網(wǎng)鈣熒光探針，可以與Ca2+結(jié)合，能特異性地顯示肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的變化，直接測(cè)定SR內(nèi)Ca2+容量。用matlab 6.5軟件處理圖像，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度的凈變化來(lái)表示鈣瞬變的強(qiáng)弱，即ΔF/F0= (F-F0)/F0(F0代表本底的熒光強(qiáng)度；F：代表某一時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度)。

1.5 測(cè)定蛋白的表達(dá):提取大鼠心肌細(xì)胞膜蛋白，即取2組大鼠左心室肌組織(心衰組取梗死區(qū)部位)100 mg，剪碎心肌組織，置于離心管中，同時(shí)加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，在高速勻漿器中將其打碎，離心5 min(4 ℃，4 000 r/min)；然后吸取上清液，置于超速離心管中離心1 h(4 ℃，12 000 r/min)，加適量的細(xì)胞裂解液在沉淀物中，測(cè)定其膜蛋白濃度(Bradford法)并將其保存于-80 ℃冰柜中備用。分別取2組樣本25 μg，在沸水(95 ℃)中煮沸5 min，待溫度下降后行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移(110 V，60 min)置硝酸纖維膜上。膜封閉后分別用RyR antibody和Calstabin2 antibody(一抗)孵育，然后漂洗，用二抗孵育、漂洗后顯色，隨后曝光3 min。最終將膠片掃描至計(jì)算機(jī)行蛋白條帶灰度分析，分別計(jì)算RyR2和Calstabin2蛋白半定量表達(dá)水平(RyR2/Actin，Calstabin2/Actin)。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠心功能指標(biāo)的比較:術(shù)后4周檢測(cè)2組大鼠的心功能顯示，心衰組大鼠LVEDP與假手術(shù)組相比明顯升高(Plt;0.05)，左心室壓力最大上升速率(dp/dtmax)、最大下降速率(dp/dtmin)與假手術(shù)組相比顯著下降(Plt;0.05)，提示心衰組大鼠心室的收縮能力下降，符合慢性心衰標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明本次造模成功，見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠心功能指標(biāo)的檢測(cè)

2.2 2組大鼠肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣容量的檢測(cè)：2組大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)Fluo-5N/AM孵育后，采用激光掃描共焦顯微鏡面掃描模式(xyz)記錄單個(gè)心肌細(xì)胞SR內(nèi)Ca2+容量。結(jié)果顯示，心衰組大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞Fluo-5N染色后熒光強(qiáng)度明顯低于假手術(shù)組，且熒光強(qiáng)度變化的平均值(ΔF/F0)心衰組組(25.3±2.8，12個(gè)心肌細(xì)胞)較手術(shù)組(47.8±3.5，12個(gè)心肌細(xì)胞，Plt;0.05)顯著降低，提示心衰組大鼠心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+容量低于假手術(shù)組。

2.3 RyR2和其調(diào)節(jié)蛋白Calstabin2的表達(dá):采用免疫印跡技術(shù)測(cè)定2組大鼠心肌細(xì)胞SR鈣離子釋放通道雷尼丁受體(RyR2)及其調(diào)節(jié)蛋白FK506結(jié)合蛋白(Calstabin2)表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示RyR2的表達(dá)量心衰組與假手術(shù)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6，Pgt;0.05)；Calstabin2的表達(dá)心衰組較假手術(shù)組明顯下降(n=6，Plt;0.05)，見(jiàn)圖3(目錄后)。

3 討論

慢性心衰的發(fā)生是由于各種慢性心臟病變和長(zhǎng)期心室前、后負(fù)荷過(guò)重，導(dǎo)致心室肌收縮力減弱，最終使得心搏出量減少，靜脈淤血，不能滿足機(jī)體代謝需要的一種心臟疾病。導(dǎo)致心衰的因素中，鈣通道的狀態(tài)以及鈣離子調(diào)控異常是其發(fā)生的主要原因之一[6-9]。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)由Ca2+的釋放和回?cái)z兩個(gè)部分組成，Ca2+通過(guò)心肌細(xì)胞T管上的L-型鈣通道(DHPR)和肌漿網(wǎng)上的雷尼丁受體(RyR2)完成鈣誘導(dǎo)鈣釋放(Ca2+induced Ca2+release,CICR)的全過(guò)程。我們之前的研究證明[10]，慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞L-型鈣通道(DHPR)表達(dá)的降低將導(dǎo)致心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程異常，從而使得心肌的收縮功能受到影響。本實(shí)驗(yàn)在先前研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞SR鈣離子釋放通道RyR2及其調(diào)節(jié)蛋白Calstabin2的異常。

Fluo-5N/AM作為一種肌漿網(wǎng)Ca2+熒光探針，可直接用于測(cè)定SR內(nèi)Ca2+容量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心衰組大鼠心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度比假手術(shù)組有明顯下降，且心衰組ΔF/F0與假手術(shù)組相比也明顯降低，說(shuō)明心衰組大鼠心肌細(xì)胞SR內(nèi)Ca2+容量低于假手術(shù)組，此結(jié)果可能導(dǎo)致心衰組大鼠在興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程中經(jīng)RyR2 釋放的Ca2+量減少，從而導(dǎo)致心肌收縮力降低。

RyR2是存在于心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)膜上的一種Ca2+釋放通道，其功能主要是通過(guò)鈣誘導(dǎo)鈣釋放的方式介導(dǎo)肌漿網(wǎng)內(nèi)的Ca2+釋放[11]。RyR2是同源四聚體細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放通道大家族成員之一，其分子量大，貫穿于肌漿網(wǎng)膜并包含大量的N末端結(jié)構(gòu)域。RyR2分子上包含很多調(diào)節(jié)蛋白，如鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)、FK506結(jié)合蛋白(Calstabin 2)、可溶抗藥性相關(guān)鈣結(jié)合蛋白(Sorcin)、集鈣蛋白(calsequestrin)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)等[12]。其中，F(xiàn)K506結(jié)合蛋白(Calstabin2)對(duì)RyR2通道功能的調(diào)節(jié)尤為重要。Calstabin2是一種順?lè)词诫幕滨．悩?gòu)酶，在RyR2上的結(jié)合比例為4∶1。Calstabin2作為RyR2的調(diào)節(jié)蛋白，具有穩(wěn)定RyR2通道關(guān)閉的功能。有研究表明[13]，該基因敲除的小鼠存在著不同程度的Ca2+滲漏。本次研究表明，心衰組RyR2蛋白表達(dá)水平與假手術(shù)組相比無(wú)明顯差異，但Calstabin2的表達(dá)水平心衰組與假手術(shù)組相比顯著降低。由于Calstabin2的作用在于穩(wěn)定雷尼丁通道的開(kāi)放，心衰組Calstabin2表達(dá)量降低使得其對(duì)RyR2穩(wěn)定性作用下降，導(dǎo)致RyR2在心臟舒張期也部分開(kāi)放，造成異常的Ca2+泄漏，從而使得肌漿網(wǎng)內(nèi)的Ca2+容量減少，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞SR興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程中的Ca2+釋放減少，心肌收縮力降低，進(jìn)而出現(xiàn)心力衰竭。鑒于RyR2的調(diào)節(jié)蛋白種類繁多，將在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討其他相關(guān)蛋白的分子機(jī)制。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞RyR2調(diào)節(jié)蛋白Calstabin2表達(dá)水平下調(diào)，使得RyR2在舒張期部分開(kāi)放泄漏過(guò)多Ca2+，導(dǎo)致興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程中由RyR2釋放的Ca2+減少，造成心肌收縮力降低，最終導(dǎo)致心衰。

[1] Pichette M,Liszkowski M,Ducharme A.Preoperative optimization of the heart failure patient undergoing cardiac surgery[J].Canadian Journal of Cardiology,2017,33(1):72-79.

[2] Koza Y.Treatment with enhanced external counterpulsation improves cognitive functions in chronic heart failure patients[J].Turk Kardiyoloji Dernegi Arsivi,2013,41(6):568.

[3] Ding Chunhua,Gepstein L,Nguyen DT,et al.High-Resolution optical mapping of ventricular tachycardia in rats with chronic myocardial infarction[J].Pacing and Clinical Electrophysiology,2010,33(6):687-695.

[4] Tanonaka K,Furuhama KI,Yoshida H,et al.Protective effect of heat shock protein 72 on contractile function in the perfused failing heart[J].American Journal of Physiology,2001,281:215-222.

[5] Ohmoto Sekine Y,Uemura H,Tamagawa M,et al.Inhibitory effects of aprindine on the delayed rectifier K+current and the muscarinic acetylcholine receptor-operated K+current in guinea-pig atrial cells[J].British Journal of Pharmacology,1999,126(3):751-761.

[6] Gorski PA,Ceholski DK,Hajjar RJ.Altered myocardial calcium cycling and energetics in heart Failure-A rational approach for disease treatment[J].Cell Metabolism,2015,21(2):183-194.

[7] Choi E,Cha MJ,Hwang KC.Roles of Calcium regulating MicroRNAs in cardiac Ischemia-Reperfusion injury[J].Cells,2014,3(3):899-913.

[8] Kalyanasundaram A,Lacombe VA,Belevych AE,et al.Up-regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+uptake leads to cardiac hypertrophy,contractile dysfunction and early mortality in mice deficient in CASQ2[J].Cardiovascular Research,2013,98(2):297-306.

[9] Rozentryt P,Niedziela JT，Hudzik B,et al.Abnormal serum Calcium levels are associated with clinical response to maximization of heart failure therapy[J].Polskie Archiwum Medycyny Wewnetrznej,2015,125(1/2):54-64.

[10] HU Shuting,SHEN Yafeng,LIU Guansheng,et al.Altered intracellular Ca2+regulation in chronic rat heart failure[J].The Journal of Physiological Sciences,2010,60(2):85-94.

[11] Rozentryt P,Niedziela JT,Hudzik B,et al.Abnormal serum calcium levels are associated with clinical response to maximization of heart failure therapy[J].Polskie Archiwum Medycyny Wewnetrznej,2015,125(1/2):54-64.

[12] Oda T,Yang Y,Uchinoumi H,et al.Oxidation of ryanodine receptor(RyR)and calmodulin enhance Ca2+release and pathologically alter,RyR structure and calmodulin affinity[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2015,85:240-248.

[13] Bito V,Biesmans L,Gellen B,et al.BFKBP12.6 overexpression does not protect against remodelling after myocardial infarction[J].Experimental Physiology,2013,98(1):134-148.

Abnormalintracellularryanodinereceptoranditsregulatoryproteincalstabin2inchronicratheartfailure

LIUMingming,NIUZhixin,ZHOUYongzhong,HUShuting.

PhysiologyDepartment,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Correspondingauthor:HUShuting,Email: hst7312@163.com

ObjectiveTo study abnormal intracellular ryanodine receptor and its regulatory protein Calstabin2 in chronic rat heart failure (HF).MethodsAdult male SD rats were randomized to divided into myocardial infarction (MI) group and sham operation group.We investigated the sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+content and assessed the expression of ryanodine receptor (RyR2) and Calstabin2 by using laser scanning confocal microscope and Western-blot.ResultsThere was a significant increase in the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) in HF rats (8.91±2.16 mmHg,n=15) compared with sham rats (4.17±1.15 mmHg,n=10,Plt;0.05).There was a significant decrease in the maximal change of systolic pressure over time (dp/dtmax) in HF rats (2 250.19±172.44 mmHg/s,n=12) compared with control rats (4 822.54±221.62 mmHg/s,n=10,Plt;0.05). SR Ca2+content was dramatically reduced in HF myocytes(ΔF/F0=25.3±2.8,n=12) compared with sham myocytes (ΔF/F0=47.8±3.5,n=12,Plt;0.05).The expression of Calstabin2 was significantly reduced in HF rat compared with sham group.ConclusionStability decrease of RyR2 that due to down-regulation of Calstabin2 could contribute to HF.

Heartfailure;Sarcoplasmicreticulum;Ryanodinereceptor;Calstabin2

10.13621/j.1001-5949.2017.10.0865

R541.6

A

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NZ15082)

寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，寧夏 銀川 750004

劉明明(1986-)男，在讀碩士研究生，主要從事心血管生理研究方向。

胡淑婷，Email:hst7312@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171018.1102.020.html

2016-04-02責(zé)任編輯馬興忠