環(huán)靶明在體內及體外可抑制人膠質母細胞瘤A172細胞的生長

薛立新 楊春福

(枝江市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 枝江 443200)

·腦膠質細胞瘤研究·

環(huán)靶明在體內及體外可抑制人膠質母細胞瘤A172細胞的生長

薛立新*楊春福

(枝江市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 枝江 443200)

目的研究Hedgehog信號通路特異性阻斷劑環(huán)靶明(cyclopamine)在體內及體外對人膠質母細胞瘤A172細胞生長的影響。方法用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測環(huán)靶明對A172細胞增殖的抑制作用，流式細胞術檢測細胞凋亡率；反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測環(huán)靶明處理前后Smoothened蛋白(Smoothened, SMO)、GLI家族鋅指蛋白1(GLI-Kruppel family member 1, GLI1)在A172中的mRNA表達及變化，免疫印跡法(Western Blot)檢測環(huán)靶明處理前后SMO、GLI1在A172中的蛋白表達及變化；環(huán)靶明對A172裸鼠皮下移植瘤生長的影響。結果環(huán)靶明抑制A172細胞的增殖，其作用呈劑量和時間依賴性；經(jīng)不同濃度的環(huán)靶明作用48 h后A172細胞的凋亡率逐漸升高，明顯高于對照組的凋亡率(Plt;0.01)，并存劑量依賴性。SMO、GLI1的mRNA和蛋白均在A172中表達，環(huán)靶明下調A172的SMO、GLI1表達。環(huán)靶明可抑制A172裸鼠皮下移植瘤的生長。結論在體內及體外阻斷Hedgehog信號通路可抑制人膠質母細胞瘤細胞A172的生長。

人膠質母細胞瘤; Hedgehog信號通路; 環(huán)靶明; 增殖; 凋亡; 裸鼠

腦膠質瘤是人類最常見的原發(fā)性顱內腫瘤，約占成人顱內原發(fā)腫瘤的 30%～50%，有很高的發(fā)病率和病死率，近年來發(fā)病率還有不斷增加的趨勢。最新資料顯示在所有膠質細胞瘤中占半數(shù)的膠質母細胞瘤患者1年生存率約為 30%，5年生存率不足5%[1]。目前各種對于腦膠質瘤治療方式的療效仍不佳，因此，加強人膠質母細胞瘤基礎研究，提高臨床診療水平，改善患者預后，是“精準”醫(yī)學時代迫切需要解決的問題。

材料與方法

一、材料和試劑

人膠質母細胞瘤細胞A172 細胞購自美國 ATCC 公司，由本實驗室保存。無特定病原體級雌性裸鼠36 只，購自三峽大學實驗動物中心。主要試劑包括cyclopamine(環(huán)靶明)；tomatidine(番茄堿，環(huán)靶明類似藥物)購自美國Sigma公司；MTT購自武漢谷歌生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V和碘化吡啶雙重染色(annexin V and propidium iodide double staining, AnnexinⅤ-FITC/PI)試劑盒購自凱基生物技術公司；β-actin抗體、兔抗人 Gli-1抗體、羊抗人SMO抗體購自美國Santa Cruz公司；反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒和Western Blot試劑盒購自美國Sigma公司；β-actin及SMO、Gli-1基因引物由上海生物工程有限公司合成。

二、MTT法檢測環(huán)靶明抑制A172細胞的增殖

A172細胞用洛斯維(Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640)培養(yǎng)基常規(guī)消化傳代培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中傳代細胞融合生長至80%左右，以2.0×103個/孔的密度接種96孔板培養(yǎng)24 h，用無血清培養(yǎng)液同步化24 h，實驗組分別加入2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L濃度的環(huán)靶明，陰性對照組加入相應濃度番茄堿，每種濃度均設5個復孔；空白對照組僅加入等體積培養(yǎng)液，具體操作按說明書進行，實驗結果均重復3次。

三、Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測環(huán)靶明促進A172細胞凋亡

將A172細胞以1.0×104個/孔的密度接種至6孔板培養(yǎng)過夜，無血清培養(yǎng)液同步化24 h，吸棄培養(yǎng)液，實驗組分別加入5.0、10.0、20.0 μmol/L的環(huán)靶明，陰性對照組加入番茄堿，每濃度均設3個復孔；空白對照組不加藥物。作用48 h后按試劑盒操作說明書進行Annexin-V-FITC/PI雙染法，流式細胞儀檢測凋亡，實驗結果均重復3次。

四、處理后A172細胞 RNA的提取與熒光實時定量PCR檢測

在環(huán)靶明處理A172細胞48 h后分別收集各組細胞, 用Trizol RNA抽提試劑提取細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。引物序列如下：SMO上游引物序列5'-ATTCATCCAAACCTCTTGAT-3'， SMO下游引物序列，5'-GAGTCATTAACTGGAACATA-3'；GLI1上游引物序列，5'-CTGGTGCACCACATCAACAG-3'，GLI1下游引物序列，5'-CCTTCAAACGTGCACTT GTGT-3'；GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)上游引物序列，5'-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3'，GAPDH下游引物序列，5'-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3'。操作按試劑盒操作說明書進行。由熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳判斷PCR反應的特異性。用基于2-△△Ct方法進行相對定量分析。

五、處理后A172細胞的Western Blot檢測

Western Blot從液氮凍存組織或對數(shù)生長細胞提取總蛋白，按照本實驗室的操作步驟進行實驗，使用的一抗分別為兔抗人Gli-1抗體(1 ∶200)、羊抗人SMO抗體(1 ∶200)、β-actin抗體(1 ∶200)。

六、裸鼠移植瘤模型的建立及cyclopamine處理

采用貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)A172細胞，調整細胞懸液濃度為1×108個/mL。裸鼠30只，若裸鼠生長正常即分別于裸鼠左肋背部皮下接種A172細胞懸液0.1 mL/只[2]。注射10 d后，裸鼠隨機分成A組(空白組)、B組(PBS磷酸緩沖鹽溶液皮下給藥組)、C組(cyclopamine皮下給藥組)。cyclopamine連續(xù)7 d皮下注射劑量為1.2 mg/只[3]。定期觀察小鼠精神、飲食及排便情況，稱裸鼠重量，測量腫瘤結節(jié)的長度(a)、寬度(b)和厚度(c)，按公式V=π(abc)/6計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長體積對比圖。實驗結束后麻醉動物，手術取下腫瘤組織，稱重并分別計算腫瘤平均質量，并繪制腫瘤生長平均質量對比圖。

七、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用χ2檢驗，單因素和多因素方差分析，Plt;0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、MTT法檢測環(huán)靶明對A172細胞生長的抑制作用

MTT比色法檢測表明環(huán)靶明對A172細胞生長有抑制作用(圖1A)，且有劑量依賴性，與對照組相比有差異(Plt;0.01)。選取20 μmol/L濃度環(huán)靶明作用于培養(yǎng)的細胞，可以發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)靶明作用于A172細胞時間的延長，細胞的生長能力明顯下降，與對照組相比有非常顯著性差異(Plt;0.01，圖1B)。

二、環(huán)靶明促進A172細胞的凋亡

5、10、20 μmol/L環(huán)靶明分別作用于A172細胞48 h后的細胞凋亡率依次為6.19%±0.83%、13.57%±1.30%、23.48%±2.20%，而對照組的凋亡率為1.22%±1.40% (圖2)，各組間差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。

圖1 環(huán)靶明可抑制A172細胞的生長

Fig 1 Cyclopamin inhibited the growth of A172 cells

A: A172 cell inhibition rate (%) of cyclopamine concentrations (aPlt;0.05,bPlt;0.01,vscontrol group); B: 20 μmol/L cyclopamine affects on A172 cell growth curve.

三、環(huán)靶明體外處理A172后SMO、GLI1的mRNA表達下調

熒光實時定量PCR檢測結果顯示各組A172細胞中存在SMO、GLI1的mRNA表達，并且5 μmol/L和10 μmol/L 環(huán)靶明實驗組SMO、GLI1的mRNA表達較對照組表達下調。PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠水平電泳檢測SMO、GLI1及GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)RT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)有特異的目的條帶長度分別約為170、166、177 bp,與SMO、GLI1、GAPDH基因大小的理論值相符(圖3)。擴增GAPGH和SMO、GLI1每樣本作2復孔，得到兩組Ct平均值。5 μmol/L和10 μmol/L環(huán)靶明實驗組與番茄堿對照組比較，環(huán)靶明實驗組SMO、GLI1的2-ΔΔCt顯著減少(Plt;0.01)，表明SMO、GLI1的mRNA表達下調。

四、環(huán)靶明體外處理A172細胞后SMO、GLI1的蛋白表達下調

Western Blot檢測結果顯示：人膠質母細胞瘤細胞A172存在SMO、GLI1的蛋白高表達。環(huán)靶明處理后，SMO、GLI1的蛋白表達有明顯下調的趨勢(Plt;0.01，圖4)。

圖2 Annexin-V-FITC /PI雙染法檢測環(huán)靶明促進A172細胞凋亡的結果

Fig 2 Cyclopamine promotes the apoptosis of A172 by Annexin-V-FITC/PI double staining

A: A172 cell apoptosis in the control group; B: A172 cell apoptosis in the 5 μmol/L cyclopamine group; C: A172 cell apoptosis in the 10 μmol/L cyclopamine group; D: A172 cell apoptosis in the 10 μmol/L cyclopamine group

五、皮下cyclopamine給藥對A172裸鼠皮下移植瘤的生長影響

裸鼠皮下注射A172細胞懸液10 d后皮下長出平均大小5.7 mm×3.4 mm×3.0 mm腫瘤(圖5提示cyclopamine可抑制A172裸鼠皮下移植瘤的生長)。此時實驗組裸鼠皮下注射cyclopamine，同時對照組裸鼠皮下注射PBS(磷酸鹽緩沖液)。連續(xù)7次

cyclopamine給藥后實驗組出現(xiàn)明顯的腫瘤生長抑制，而對照組卻繼續(xù)生長，兩組體積對比圖(圖6A)，組間差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。切除的對照組的腫瘤平均重量(0.79±0.16) g，而對應實驗組的腫瘤平均重量(0.25±0.08) g，兩組質量對比圖(圖6B)，組間差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。結果顯示cyclopamine能夠抑制腫瘤的生長。

圖3 SMO、GLI1、GAPDH的瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig 3 Agarose gel electrophoresis of SMO, GLI1 and GAPDH

1: Blank group; 2: Tomatidine control group; 3: 5 μmol/L cyclopamine group; 4: 10 μmol/L cyclopamine group.

圖4 環(huán)靶明體外處理A172細胞后SMO、GLI1的蛋白表達下調

Fig 4 Cyclopamine-treated A172 cells down-regulated the expression of SMO and GLI1 in vitro

1: Blank group; 2: Tomatidine control group; 3: 5 μmol/L cyclopamine group; 4: 10 μmol/L cyclopamine group.

圖5 環(huán)靶明可抑制A172裸鼠皮下移植瘤的生長

Fig 5 Cyclopamin inhibited the growth of A172 subcutaneas tumor in nude rat

A: The subcutaneous injection of A172 cell suspension 9 days out of the tumor; B: The subcutaneous injection of A172 cell suspension 9 days out of the tumor; C: The average size of tumor growth was (71.40+3.75) mm3after 4 days of subcutaneous injection of PBS; D: The average size of tumor growth was (47.20±3.90) mm3after 4 days of subcutaneous injection of cyclopamine; E: The average size of tumor growth after subcutaneous injection of PBS and cyclopamine for 7 days; F: The tumor removed after injection of PBS and cyclopamine for 7 days.

圖6 環(huán)靶明給藥后腫瘤生長受抑制的體積及質量對比圖

Fig 6 Comparison of volume and mass of tumor growth inhibition after cyclopamine administration

A: The growth of tumor volumes at different times; B: Weight comparison between two groups

aPlt;0.05,bPlt;0.01,vscontrol group.

討 論

Hh信號通路是一個經(jīng)典的胚胎發(fā)育信號系統(tǒng)，在胚胎發(fā)育和胚胎形成后細胞的生長和分化過程中都起著重要作用。Hh信號通路過度激活可引起多種腫瘤細胞的異常增殖，并且在腫瘤細胞增殖與凋亡的調控中起著重要作用。特異性阻斷劑環(huán)靶明主要通過對抗Hh下游分子SMO而抑制Hh信號通路的活性[4-5]。

本實驗首先發(fā)現(xiàn)Hh信號通路在A172細胞中呈高激活狀態(tài)。以往研究證實SMO是該信號通路重要的調節(jié)因子，而GLI1是Hh信號通路下游的一個重要因子，起著承上啟下的關鍵性調控作用，SMO和GLI1的高表達是Hh信號通路的過度激活的重要特征[6-7]。通過Western Blot及RT-PCR結果顯示SMO、GLI1蛋白及mRNA呈高表達狀態(tài)；這與S Bensalma等學者研究該通路在腦膠質瘤中的表達情況相一致[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)MTT的結果顯示2～20.0 μmol/L的環(huán)靶明可以劑量依賴性地抑制A172細胞的生長，并且A172細胞的生長抑制作用也隨時間的延長而趨于明顯；AnnexinⅤ/PI雙染法流式細胞術結果提示隨著環(huán)靶明藥物劑量增加,細胞凋亡率逐漸升高。RT-PCR及Western Blot結果顯示環(huán)靶明作用48 h后， SMO、GLI1的mRNA及蛋白在A172中表達下調，尤以20 μmol/L 環(huán)靶明組為著。通過對裸鼠移植瘤的實驗發(fā)現(xiàn)番茄堿對照組腫瘤呈遞增性生長,而同期環(huán)靶明實驗組生長曲線較為低平，腫瘤生長明顯受到抑制。對照組腫瘤質量平均為(0.82±0.11) g，實驗組腫瘤質量平均為(0.22±0.06) g，兩者差異有顯著性。對照組腫瘤平均體積大小為(130.90±5.63) mm3，實驗組腫瘤平均體積大小為(36.20±3.59) mm3，兩者差異有顯著性。

本研究結果表明Hh信號分子對人膠質母細胞瘤細胞A172的增殖起維持作用，在體內及體外阻斷該信號通路可以抑制人膠質母細胞瘤細胞A172生長與增殖，并促進細胞凋亡。通過特異性抑制Hh信號傳遞可以達到分子靶向治療的目的，而SMO、GLI1蛋白可以作為人膠質母細胞瘤細胞早期診斷和預后判斷的分子標志物，因此在人膠質母細胞瘤的防治中可望有良好的應用前景。

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CyclopamineinhibitsthegrowthofhumanglioblastomaA172cellsinvivoandinvitro

XUELixin,YANGChunfu

DepartmentofNeurosurgery,ZhijiangHospital,Zhijiang443200, China

ObjectiveThe study aims to investigate Hedgehog signaling pathway specific blocker (cyclopamine) effects human glioblastoma A172 cells growth in vivo and in vitro.MethodsThe proliferation of A172 cells was detected with Methylcyclopentadienyl Manganese Tricarbonyl (MTT) method. Cells apoptotic rate was analyzed with the flow cytometry assay. The expressions of the tumor-related genes and proteins in A172 cells before and after cyclopamine treatment was detected with reverse transcriotion-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot. Cyclopamine affected A172 tumor growth in nude mice.ResultsCyclopamine inhibited the growth of A172 cells in a time- and dose-dependent manner. After cyclopamine treatment with different concentrations for 48 h, the apoptotic rates of A172 cells were increased in a dose-dependent manner, which were significantly higher than those of the control group (Plt;0.01). Furthermore, cyclopamine down-regulated the mRNA and protein levels of SMO and GLI1 in A172 cells. Cyclopamine inhibited A172 tumor growth in nude mice.ConclusionBlocking hedgehog signaling pathway inhibits human glioblastoma A172 cells growth in vivo and in vitro.

Human glioblastoma; Hedgehog signaling pathway; Cyclopamine; Proliferation; Apoptosis;Nude mice

1671-2897(2017)16-020-05

R 739

A

薛立新，碩士研究生，E-mail:1023823062@qq.com

*通訊作者： 薛立新，碩士研究生，E-mail:1023823062@qq.com

2016-01-25；

2016-06-20)