降解玉米芯木質(zhì)纖維素放線菌的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化

劉曉飛 侯 艷 馬京求 關(guān)樺楠 張 娜 馬永強

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院， 哈爾濱 150076)

0 引言

全球玉米的年產(chǎn)量超過10.3億t，其中近50%由玉米芯、秸稈等組成[1]。玉米芯是玉米生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的具有高木糖含量的能量密集型農(nóng)業(yè)廢棄物[2]，也是一種木質(zhì)纖維素材料，其成分主要有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[3]。玉米芯能量密度比常見的生物質(zhì)(如玉米秸稈和柳枝稷)高出近兩倍。與玉米秸稈和柳枝稷相比，玉米芯中木質(zhì)素含量較低，是開發(fā)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)產(chǎn)品的適宜原料[4]，可作為一種可再生生物質(zhì)生產(chǎn)可溶性糖，還可以通過化學(xué)、微生物降解等發(fā)酵方法生產(chǎn)液體生物燃料，如乙醇等[5-7]。文獻[8]以O(shè)2為氧化劑，在水溶液中將玉米芯轉(zhuǎn)化為甲酸和乙酸。文獻[9]以硫酸為催化劑，通過水解玉米芯生產(chǎn)乙酰丙酸。

由于玉米芯中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的復(fù)雜性和頑固性，在溫和條件下將其轉(zhuǎn)化為有價值、高收率、高選擇性的化工產(chǎn)品還面臨諸多挑戰(zhàn)，尤其是在前期預(yù)處理階段[10-11]。文獻[12]通過研發(fā)3種不同的微波輔助堿鹽預(yù)處理方法來提高玉米芯廢料的糖產(chǎn)量，這些預(yù)處理方法可有效提高木質(zhì)纖維素糖的回收效率，可用于可溶性糖、微生物燃料的生產(chǎn)。文獻[13]研發(fā)了一種利用表面活性劑(吐溫80)同時進行玉米芯預(yù)處理和糖化來提高生物乙醇產(chǎn)量的方法，結(jié)果表明，添加10%的吐溫80進行預(yù)處理和糖化，得到的葡萄糖和木糖產(chǎn)量最大，乙醇產(chǎn)量也有所提高。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物具有纖維素降解能力，并且可應(yīng)用于玉米芯的降解。文獻[14]構(gòu)建了一株具有天然木糖醇積累能力的產(chǎn)木糖醇工業(yè)酵母菌株P(guān)E-2，用來降解玉米芯、生產(chǎn)木糖醇。文獻[15]利用經(jīng)生物整合處理的纖維素水解梭狀芽胞桿菌發(fā)酵玉米芯，生產(chǎn)正丁醇。

放線菌通過提高纖維素的水溶性、增強菌絲穿透性從而降解纖維素，且在高溫及高堿等極端環(huán)境下對木質(zhì)素仍具有顯著的降解作用。本文從東北寒地黑土中篩選得到一株具有高效降解纖維素的放線菌GS-3-39，將其作為玉米芯工業(yè)生產(chǎn)的預(yù)處理劑，以提高玉米芯木質(zhì)纖維素降解率，從而提高其利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1樣品來源

土壤樣品來自黑龍江省牡丹江市(43°24′N，128°2′E)，玉米芯產(chǎn)自黑龍江省哈爾濱市。

1.1.2儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(深圳市中盛科儀科技有限公司)；ZHJH-C1115B型超凈工作臺(上海雙旭有限公司)；TG16-WS型臺式高速離心機(山東博科科學(xué)儀器有限公司)；PerkinElmer UATR Two型紅外光譜儀(珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司)；S-3400NⅡ型掃描電鏡(蘇州佐藤精密儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基制備

GS固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉6 g，KNO30.3 g，NaCl 0.15 g，K2HPO4·3H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003 g，瓊脂5.4 g，pH值7.2～7.4。

燕麥汁瓊脂(ISP3)固體培養(yǎng)基：燕麥片20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO4·3H2O 0.8 g，NaCl 0.8 g，瓊脂粉20.0 g，pH值7.2～7.4。

GY液體培養(yǎng)基：酵母浸粉1 g，葡萄糖1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，pH值7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米秸稈2 g，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，pH值7.2～7.4。

CMC培養(yǎng)基：CMC(羧甲基纖維素鈉)1.5%，酵母膏0.1%，NH4NO30.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.05%，pH值7.2～7.4。

1.2.2菌種的分離、純化

土樣經(jīng)自然風(fēng)干，研磨后取5 g與45 mL無菌水混合，加適量玻璃珠于28℃、180 r/min振蕩30 min，過濾后得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%原液，原液依次稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.01%、0.001%，分別取200 μL于培養(yǎng)基上進行涂布，于28℃條件下倒置培養(yǎng)15 d，然后將培養(yǎng)基上長出的放線菌挑入ISP3培養(yǎng)基進行單一菌的篩選。

1.2.3剛果紅染色試驗

將篩選出的菌種接入CMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，進行剛果紅染色試驗，進行纖維素降解能力的測定。

1.2.4菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株接入ISP3固體培養(yǎng)基上，28℃下恒溫培養(yǎng)3～4 d后，觀察菌落大小、顏色、邊緣狀況；將菌株接入GY液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)3～4 d，取適量菌液于載玻片上，固定后用番紅染色，觀察菌絲形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：參照文獻[16]并加以修改進行16S rRNA分子生物學(xué)鑒定。將獲得的單菌株進行DNA提取，連接T載體，熱轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆，進行PCR擴增；送到檢測機構(gòu)測序，構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5單因素試驗

以玉米芯木質(zhì)纖維素降解率為指標(biāo)，研究發(fā)酵時間(1、3、5、7、9 d)、培養(yǎng)基初始pH值(4、5、6、7、8)、發(fā)酵轉(zhuǎn)速(120、140、160、180、200 r/min)、發(fā)酵溫度(24、26、28、30、32℃)及接菌量(玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)基中菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%)對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響，按照上述單因素依次進行試驗并測定玉米芯木質(zhì)纖維素降解率，且后續(xù)單因素試驗均在前一因素試驗的較優(yōu)結(jié)果上進行。

1.2.6玉米芯木質(zhì)纖維素降解率測定

玉米芯洗凈、干燥，利用萬能粉碎機粉碎后，過40目篩，備用。將配制好的菌懸液接種到玉米芯發(fā)酵培養(yǎng)基中，按單因素試驗條件進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，降解后的玉米芯用質(zhì)量恒定后的質(zhì)量為m0的濾紙進行過濾，經(jīng)水沖洗后，經(jīng)中性洗滌劑(3%十二烷基硫酸鈉)煮沸處理，除去可溶性物質(zhì)，置于105℃干燥1 h，干燥冷卻器中靜置30 min后稱量，質(zhì)量記為m1，再105℃干燥1 h，干燥冷卻器中靜置30 min后稱量，質(zhì)量記為m2(m1與m2相差不高于0.02 g即為質(zhì)量恒定)，質(zhì)量恒定后的質(zhì)量減濾紙的質(zhì)量m0即為降解剩余物質(zhì)量m3。玉米芯木質(zhì)纖維素降解率Y計算公式為

Y=(m-m3)/m×100%

(1)

式中m——培養(yǎng)基中玉米芯粉末質(zhì)量，g

1.2.7發(fā)酵條件響應(yīng)曲面法優(yōu)化

利用Design-Expert 8.0軟件對發(fā)酵條件進行優(yōu)化[17]。確定玉米芯木質(zhì)纖維素降解率最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.8玉米芯中主要成分的測定

采用范氏洗滌法[18]測定降解前、后玉米芯中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和灰分的含量。

1.2.9掃描電鏡觀察

參照文獻[19]處理玉米芯，在響應(yīng)曲面法確定的最優(yōu)條件下發(fā)酵玉米芯，對玉米芯降解前后進行掃描電鏡觀察。

1.2.10紅外光譜觀察

參照文獻[20]處理玉米芯，在響應(yīng)曲面法確定的最優(yōu)條件下發(fā)酵玉米芯，對玉米芯降解前后進行紅外光譜觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株GS-3-39剛果紅染色結(jié)果

篩選出一株纖維素降解能力較強的放線菌，命名為GS-3-39，其剛果紅染色結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株GS-3-39剛果紅染色結(jié)果Fig.1 Strain GS-3-39 Congo red staining results

由圖1得到透明圈與菌落直徑比值最大的菌株，該菌株剛果紅染色后透明圈的直徑D為(22.63±2.36) mm，菌落生長的直徑為(4.93±0.74) mm，其透明圈與菌落直徑比值為4.62±0.26，說明GS-3-39具有較好的纖維素降解能力。

2.2 菌種鑒定結(jié)果

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

菌株形態(tài)學(xué)鑒定如圖2、3所示。

圖2 單菌落形態(tài)Fig.2 Morphology of single colony

圖3 番紅染色鏡檢圖Fig.3 Gram staining microscopy

由圖2可知該菌株在ISP3固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)，菌體呈黃色且周圍產(chǎn)生黃色孢子，圖3為番紅染色結(jié)果，該菌可產(chǎn)生均勻菌絲，可初步鑒定該菌為放線菌屬。

2.2.2分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

(1)菌株的PCR擴增結(jié)果

圖4 菌株GS-3-39的PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of strain GS-3-39

菌株的PCR擴增結(jié)果如圖4(圖中Marker為DL2000 DNA Marker，1、2均為菌株GS-3-39的PCR擴增結(jié)果)所示。圖4中1 500 bp左右有一個明亮且清晰的條帶。

(2)菌株的質(zhì)粒提取結(jié)果

質(zhì)粒提取結(jié)果如圖5(圖中Marker為DL5000 DNA Marker，1、2均為菌株GS-3-39的質(zhì)粒提取結(jié)果)所示。由圖5可知，質(zhì)粒條帶清晰，外送測序。

(3)系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建結(jié)果如圖6所示。由圖6可確定菌株GS-3-39為放線菌屬。

圖5 菌株GS-3-39的質(zhì)粒提取結(jié)果Fig.5 Plasmid extraction results of strain GS-3-39

圖6 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strains

2.3 單因素試驗結(jié)果分析

2.3.1發(fā)酵時間

發(fā)酵時間對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同發(fā)酵時間時的玉米芯木質(zhì)纖維素降解率變化曲線Fig.7 Effect of fermentation time on cellulose degradation rate of corn cob

由圖7可知，玉米芯木質(zhì)纖維素降解率隨發(fā)酵時間的延長而增大，在發(fā)酵5 d時降解率達到16.95%。原因可能是放線菌GS-3-39繁殖數(shù)量增多，產(chǎn)酶量增多，降解率增大。后隨著時間的增長降解率雖有提高但并不顯著，考慮到成本問題，將最佳發(fā)酵時間定為5 d。

2.3.2培養(yǎng)基初始pH值

培養(yǎng)基初始pH值對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同培養(yǎng)基初始pH值時的玉米芯木質(zhì)纖維素降解率變化曲線Fig.8 Effect of initial pH value of medium on cellulose degradation rate of corn cob

由圖8可知，在培養(yǎng)基初始pH值為5時達到木質(zhì)纖維素降解率的最高值18.355%。原因可能是放線菌GS-3-39生長最適pH值為5。

2.3.3發(fā)酵轉(zhuǎn)速

發(fā)酵轉(zhuǎn)速對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響結(jié)果如圖9所示。

圖9 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響Fig.9 Effect of fermentation revolution on cellulose degradation rate of corn cob

由圖9可知，在轉(zhuǎn)速為160 r/min時達到最高降解率19.485%。原因可能是隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速的增大，放線菌GS-3-39產(chǎn)的木質(zhì)纖維素酶與玉米芯充分接觸，使木質(zhì)纖維素的降解率逐漸增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速再增大時，致使菌細胞壁破裂，菌種死亡，降解率下降。

2.3.4發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響結(jié)果如圖10所示。

圖10 發(fā)酵溫度對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響Fig.10 Effect of fermentation temperature on cellulose degradation rate of corn cob

由圖10可知，在28℃時達到降解率最高值20.57%。原因可能是此溫度是放線菌GS-3-39最適生長溫度，此溫度下酶作用能力最強。

2.3.5接菌量

接菌量對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響結(jié)果如圖11所示。

圖11 接菌量對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的影響Fig.11 Effect of bacterial inoculation on cellulose degradation rate of corn cob

由圖11可知，當(dāng)接菌量為3%時達到最高的降解率21.335%。原因可能是接菌量逐漸增加，酶濃度增大使降解率增大，當(dāng)接菌量繼續(xù)增加時，菌數(shù)量過多培養(yǎng)基營養(yǎng)不足造成菌間競爭增大，菌大量死亡使降解率下降。

2.4 響應(yīng)曲面法發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果分析

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果可知，玉米芯木質(zhì)纖維素降解率最佳發(fā)酵時間為5 d，因此選擇培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、接菌量作為響應(yīng)面優(yōu)化的影響因素。確定玉米芯木質(zhì)纖維素降解率最佳提取的條件為培養(yǎng)基初始pH值為5、發(fā)酵轉(zhuǎn)速為160 r/min、發(fā)酵溫度為28℃、接菌量為3%，各因素在最佳條件點左右分別選取1個試驗點，進行四因素三水平的響應(yīng)面試驗，如表1所示。使用Design-Expert 8.0軟件對表2(表中A、B、C、D分別表示培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、接菌量的編碼值)中試驗數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面回歸分析，得到該試驗的回歸模型方程

Y=26.68+0.48A+1.36B+0.41C+0.72D-
0.28AB-0.39AC+0.13AD-0.060BC+0.45BD+
1.08CD-3.55A2-3.45B2-2.11C2-5.04D2

表1 響應(yīng)面因素與編碼Tab.1 Response surface factors and coding

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Response surface test design and results

對試驗所得的數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Tab.3 Variance analysis of response surface test results

由表3可以看出，玉米芯木質(zhì)纖維素降解率回歸方程P<0.000 1，表明玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的回歸方程與全部自變量間的關(guān)系極為顯著，方程極顯著；而玉米芯木質(zhì)纖維素降解率回歸方程的失擬項P>0.05，差異性不顯著，這表示上述4個因素對試驗結(jié)果的干擾不明顯，殘差由隨機誤差引起，表示該回歸模型與實測值能夠較好地擬合。獲得的響應(yīng)曲面圖如圖12～14所示。

圖12 培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的等高線及響應(yīng)曲面Fig.12 Contour line and response surface of initial pH value of medium and fermentation temperature on cellulose degradation rate of corn cob

圖13 發(fā)酵轉(zhuǎn)速、接菌量對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的等高線及響應(yīng)曲面Fig.13 Contour line and response surface of fermentation revolution and inoculation amount on cellulose degradation rate of corn cob

圖14 發(fā)酵溫度、接菌量對玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的等高線及響應(yīng)曲面Fig.14 Contour line and response surface of fermentation temperature, inoculation amount and cellulose degradation rate of corn cob

運用Design-Expert 8.0軟件，設(shè)置玉米芯木質(zhì)纖維素降解率同時達到極大值時，求解得到玉米芯木質(zhì)纖維素降解的理論最優(yōu)條件為：培養(yǎng)基初始pH值為5.06、發(fā)酵溫度28.22℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速163.98 r/min、接菌量為3.09%，在此條件下的玉米芯木質(zhì)纖維素降解率理論值為26.881%。在該條件下做重復(fù)試驗得到降解率為27.264%，與理論值相差不大，證明該模型有效。

2.5 玉米芯主要成分的測定

玉米芯降解前后成分及其含量如表4所示。由表4可知，接種放線菌GS-3-39降解后，玉米芯中纖維素的降解率為39.84%、半纖維素的降解率為38.33%、木質(zhì)素的降解率為47.38%，說明GS-3-39對纖維素、半纖維素、木質(zhì)素均具有一定的降解作用。文獻[21]采用連續(xù)堿擠壓降解玉米芯中木質(zhì)纖維素，結(jié)果表明：處理后纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從(42.0±0.15)%降至(37.6±1.22)%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從(45.9±0.1)%降至(39.4±1.2)%，比較可知，GS-3-39對纖維素、半纖維素的降解效果均比該方法高。文獻[22]評估不同玉米芯的預(yù)處理方法，其中堿性過氧化法效果最好，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從16%增加至59%，木質(zhì)素降解率約78%，半纖維素溶解高達79%，雖然木質(zhì)素及半纖維素降解率較高，但增加了纖維素含量，預(yù)處理較困難，而GS-3-39對纖維素、半纖維素、木質(zhì)素均有降解作用。

表4 玉米芯降解前后成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.4 Components of corn cob before and after degradation %

2.6 玉米芯降解前后掃描電鏡觀察結(jié)果

圖15 降解前玉米芯表面組織結(jié)構(gòu)Fig.15 Surface structure of corn cob before degradation

圖16 降解后玉米芯表面組織結(jié)構(gòu)Fig.16 Surface structure of corn cob after degradation

玉米芯降解前、后表面組織結(jié)構(gòu)掃描電鏡結(jié)果如圖15、16所示。由圖15、16可得，降解前玉米芯表面結(jié)構(gòu)呈緊密、平整排列，降解后結(jié)構(gòu)遭到破壞，裂解且多孔，說明GS-3-39對玉米芯中的結(jié)構(gòu)成分就有降解作用。

2.7 玉米芯降解前后紅外光譜觀察結(jié)果

圖17 玉米芯降解前后紅外光譜Fig.17 Infrared spectra of corn cob before and after degradation

3 討論

玉米芯是玉米生產(chǎn)的副產(chǎn)物，是重要的木質(zhì)纖維素資源，木質(zhì)纖維素是自然界中最為豐富的有機物質(zhì)，它的生物降解是許多需氧、兼性厭氧和專性厭氧細菌和真菌的特征[23]。木質(zhì)纖維素經(jīng)預(yù)處理后可以作為原料生產(chǎn)生物質(zhì)能源。如纖維素燃料乙醇[24]，是指充分利用纖維素原料(如玉米芯)中的纖維素及半纖維素，使之經(jīng)水解、糖化后，再經(jīng)糖發(fā)酵過程生產(chǎn)的一種燃料乙醇。文獻[25]以玉米芯為原料，研究了木素磺酸鹽(SLQA)和十二烷基二甲基甜菜堿(BS12)對乙醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，SLQA和1 g/L BS12通過促進酶解，可有效提高乙醇產(chǎn)量。文獻[26]以玉米芯為原料，研究利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)木糖醇。優(yōu)化預(yù)處理方法得到最佳木糖醇的產(chǎn)率為85%。因此找到一種有效降解玉米芯中的木質(zhì)纖維素成分的方法成為當(dāng)前的研究重點。本文研究放線菌GS-3-39對其的降解作用，未來可利用GS-3-39作玉米芯生產(chǎn)生物能源的預(yù)處理劑，或通過基因工程改造技術(shù)，使其降解木質(zhì)纖維素能力更強。

4 結(jié)束語

本文篩選出一株高效降解纖維素的放線菌GS-3-39，運用Design-Expert 8.0軟件，得到最優(yōu)組合條件下玉米芯木質(zhì)纖維素降解率的理論最優(yōu)值為26.881%。在最優(yōu)條件下進行重復(fù)試驗得到降解率為27.264%，且GS-3-39對玉米芯中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率分別為39.84%、38.33%、47.38%。