親子鑒定技術在遺傳學實驗教學中的應用

牛東紅，沈玉幫，汪桂玲，白志毅

摘要：在遺傳學實驗教學中，親子鑒定實驗是對遺傳學基本定律的實際應用。該實驗利用微衛(wèi)星分子標記分析了海產貝類縊蟶家系的親本和子代的基因型，確定了樣本間的親緣關系，深入理解了孟德爾定律的內涵。該實驗是一個綜合性實驗，不僅鍛煉了學生分子生物學技術的實際操作能力，更加培養(yǎng)了學生的科研思維和創(chuàng)新能力，是科研成果轉化為教學實驗的成功案例。

關鍵詞：遺傳學實驗；親子鑒定；微衛(wèi)星；科研成果

中圖分類號：G642.0；Q3 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）46-0247-03

遺傳學是生物類和農學類專業(yè)重要的基礎課程，以理論和實驗相結合為特點，是一門實踐性較強的學科[1]。遺傳學實驗是遺傳學課程教學的必要組成部分，而遺傳學實驗仍然停留在傳統(tǒng)的實驗課程和設計，以驗證性和示范性實驗為主，實驗對象主要集中在染色體水平。在高等教育階段，以培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目蒲兴季S和提高主觀能動性為主，因此遺傳學實驗的設計可以緊密結合科學研究，將科研成果帶入課堂，培養(yǎng)具有創(chuàng)造力的科研人才[2]。

親子鑒定也稱親權鑒定，是指通過對子代個體遺傳特征的分析確定可能的父母，或通過父母的遺傳特征來尋找可能的子女[3]。在水產生物家系選育的過程中，親子鑒定技術可以對早期家系混養(yǎng)的個體進行有效的親緣關系判定[4]。微衛(wèi)星標記，由于其共顯性和高重復性特點[5]，在遺傳分析中占有重要地位。我們將利用微衛(wèi)星標記進行親子鑒定的實驗引入了遺傳學實驗中。本實驗設計了利用6對微衛(wèi)星標記進行縊蟶親本和子代個體間親緣關系鑒定，是一個綜合性實驗。

一、實驗原理

微衛(wèi)星（Microsatellites）以1-6個堿基為單位進行串聯(lián)重復，兩側的單拷貝序列較為保守，標記符合孟德爾遺傳特性，是一種理想的共顯性分子標記。根據(jù)孟德爾遺傳定律，子代分別遺傳父本和母本的一個等位基因，對于不符合孟德爾遺傳規(guī)律的個體，便可排除在外。因此，通過分析親代和子代的微衛(wèi)星標記的長度變異，可以有效進行親子鑒定。通過該實驗，熟悉實驗過程和分析技術，掌握親子鑒定的原理與技術，深入理解孟德爾定律的內涵。

二、實驗材料與方法

1.實驗材料。在縊蟶繁殖季節(jié)，以一對一交配的方式構建家系。交配結束，取親本個體外套膜分別浸泡于無水乙醇中保存。次年，每個家系隨機采集30個子代，取其外套膜組織，保存在無水乙醇中，備用。

2.DNA提取?？O蟶基因組DNA的提取采用改良的酚氯仿抽提法。取0.2g縊蟶樣本組織剪碎，溶解于裂解液中，徹底裂解至澄清；在裂解液中加入500uL苯酚，12000rpm離心20min；吸取上清液，加入500uL氯仿，12000rpm離心20min；吸取上清液，加入2倍體積預冷無水乙醇，靜置20min，12000rpm離心15min；棄掉上清液，將DNA溶解于100uL無菌水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.PCR擴增。用于縊蟶個體親子鑒定的微衛(wèi)星引物6對，合成5′上游熒光引物（FAM）（表1）。PCR反應體系為25μL，含1×Taq Master Mix，上、下游引物各0.2μmol/mL，模板DNA 20ng；PCR反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行35循環(huán)，最后72℃延伸10min。

4.瓊脂糖凝膠電泳檢測。配制1%的瓊脂糖凝膠凝膠，檢測DNA和PCR產物，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并拍照。

5.毛細管電泳檢測基因型。將PCR樣品進行毛細管電泳檢測，利用GeneMapper v4.0對微衛(wèi)星的分型結果進行分析。

三、實驗結果

本實驗包含了核酸提取，PCR擴增，凝膠電泳初步檢測以及毛細管電泳基因分型；采集的樣本包括1對父母本和10個子代。實驗中將學生分為6組，每組同學分別提取2個樣本的DNA，之后每組同學對12個樣本進行2對微衛(wèi)星引物的PCR擴增和基因型檢測。

1.瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。本實驗對于微衛(wèi)星引物擴增產物的檢測，進行了瓊脂糖凝膠電泳的初步檢測，保障實驗中能夠擴增出預期的產物（圖1）。但是，由于凝膠電泳分辨率較低，而微衛(wèi)星等位基因片段差異較小，需要進一步根據(jù)采取分辨率較高的檢測方法。

2.毛細管電泳檢測結果。本實驗設計了熒光標記的微衛(wèi)星單向引物，采用了毛細管電泳檢測方法，對PCR產物進行了進一步檢測，利用GeneMapper軟件獲得了樣本的測試峰圖和基因型，并轉化成擴增產物的長度表示。以引物以M129857為例，測序結果的數(shù)據(jù)如圖2所示，分別為母本、父本和10個子代的基因型。該引物可以獲得4種基因型，假設母本為ab，父本為cd，那么根據(jù)孟德爾定律，這10個子代的基因型必然是4種組合，包括ac，ad，bc和bd。學生通過對比各個微衛(wèi)星引物擴增產物在父母本和子代個體中的片段大小，可以推斷出它們之間的親緣關系。

四、實驗教學總結

在高等教育階段，教學和科研是相輔相成，相互補充的。教學是科研的理論基礎，而科研是教學的實踐、補充和延伸。本實驗中，我們利用了6對微衛(wèi)星分子標記進行親子鑒定實驗，實現(xiàn)了科研成果的轉化，也是對孟德爾定律的再次理解和實際應用。在傳統(tǒng)的遺傳學實驗中，以掌握實驗方法為出發(fā)點，大家在實驗過程中僅僅是照搬實驗步驟和機械性重復，缺乏主觀能動性。本實驗的不同在于是一個科學性的綜合性實驗，具有一定生物學意義，具備了“提出問題、解決問題和分析問題”的思路，相當于一個小課題。因此，在實驗過程中，較好地激發(fā)了學生的學習興趣，能夠培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W思維。

本實驗屬于綜合性實驗，涉及到了基本的分子生物學技術，也進行了實驗和分析技術的改進。例如，對于傳統(tǒng)的核酸抽提，我們進行了步驟簡化，這樣就可以節(jié)約時間。采用瓊脂糖凝膠電泳抽測，對PCR結果進行初步檢測，之后主要采用毛細管電泳檢測方法，保證基因分型更加精確。對于整個實驗，注重遺傳學分析即基因型的判斷，更加深刻理解遺傳的本質。

總之，學生科研思維和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)是現(xiàn)代高等教育的重要方向，我們將不斷調整實驗教學方案，構建完善的實驗教學體系，培養(yǎng)高素質的科研人才。

參考文獻：

[1]吳燕華，盧大儒，林娟，等.案例式教學在遺傳學課堂中的運用與效果分析[J].高校生物學教學研究：電子版，2013，3（2）：25-28.

[2]蔡梅紅，劉天磊，王云，段玉清.基于遺傳學實驗教學改革的大學生科研素質培養(yǎng)探索[J].安徽農業(yè)科學，2015，（01）：310-311.

[3]Gao H，Kong J，Yu F，Wang WJ，Luo K，Meng XH，Liu P，Zhang TS.The Chinese shrimp paternal recognition in conditions of artificially control and natural JiaoWei using microsatellite[J]. Mar Fisher Res，2007，28（1）：1-5.

[4]苗貴東，杜民，楊景峰，等.大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR技術建立及應用[J].中國海洋大學學報自然科學版，2011，41（1）：97-106.

[5]Tautz D，Renz M.Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，12（10）：4127-4138.