鹽生草HgNHX1基因啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證

鄒蘭，楊軻，徐先良，汪軍成，任盼榮，姚立蓉，孟亞雄，李葆春，馬小樂，王化俊*

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

鹽生草HgNHX1基因啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證

鄒蘭1,2**，楊軻1,2**，徐先良1,2，汪軍成1,2，任盼榮1,2，姚立蓉1,2，孟亞雄1,2，李葆春1,3，馬小樂1,2，王化俊1,2*

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

為了進(jìn)一步探明鹽生草HgNHX1基因啟動(dòng)子的功能，從鹽生草基因組中克隆了HgNHX1基因上游 5′側(cè)翼調(diào)控區(qū)1523 bp的序列，即HgNHX1基因啟動(dòng)子(pHgNHX1)序列，并利用PlantCARE、PLACE等在線軟件對HgNHX1基因5′ 端上游序列進(jìn)行預(yù)測和分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心啟動(dòng)子元件外，還含有多個(gè)與鹽、干旱、缺水、冷、傷害等逆境脅迫誘導(dǎo)有關(guān)的作用元件；同時(shí)具有生長素、脫落酸、赤霉素及乙烯等植物激素誘導(dǎo)響應(yīng)的功能元件，表明分離得到的DNA片段具有典型啟動(dòng)子的一般特征。構(gòu)建pBI-HgNHX1啟動(dòng)子植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草，利用組織染色法鑒定轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥的 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因擬南芥的各個(gè)器官均有GUS 酶的活性，說明pHgNHX1具有一定的組成型啟動(dòng)子活性。

鹽生草；HgNHX1基因；啟動(dòng)子；GUS

土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源和生態(tài)問題，是嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要非生物脅迫之一。據(jù)聯(lián)合國教科文組織和糧農(nóng)組織的不完全統(tǒng)計(jì)，全世界約有9.54億hm2的土地存在不同程度的鹽堿化，占世界總耕地面積的20%，超過世界土地面積的6%[1-2]。因此，合理開發(fā)利用鹽堿地、改善土地鹽堿化程度以及提高作物耐鹽性是未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展急需解決的重大課題。

土壤鹽害可抑制種子萌發(fā)、生長發(fā)育以及光合作用等，劉愛榮等[3]研究表明，鹽脅迫會(huì)引起彩葉草(Coleusscutellarioides)離子穩(wěn)態(tài)被破壞并發(fā)生滲透脅迫，對生長產(chǎn)生抑制作用。而Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對于植物體的離子平衡、耐鹽性以及植株的整個(gè)發(fā)育過程，都起到非常重要的作用。高等植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于液泡膜和質(zhì)膜上，分別以V型H+-ATPase和H+-PPiase、P型H+-ATPase，通過水解ATP和PPi，形成跨膜質(zhì)子梯度，來驅(qū)動(dòng)Na+進(jìn)入液泡或排出細(xì)胞，以維持體內(nèi)離子平衡[4-5]。植物抵御鹽脅迫的有效策略之一是通過液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vacuolar Na+/H+exchanger or antiporter，簡稱NHX)將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na+區(qū)域化在液泡，一方面降低Na+對細(xì)胞質(zhì)的毒害，另一方面又可將Na+作為一種滲透調(diào)節(jié)劑來降低細(xì)胞的滲透勢[6-7]，從而使植物能更好地適應(yīng)鹽漬生境。植物液泡膜NHX1類蛋白大多由500多個(gè)氨基酸組成，具有12個(gè)推測的高度保守的跨膜區(qū)[8]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組數(shù)據(jù)庫中有16個(gè)基因被標(biāo)注為編碼推測的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Yokoi等[9]通過分析這16個(gè)產(chǎn)物與AtNHX1的氨基酸序列和拓?fù)湎嗨菩园l(fā)現(xiàn)，AtNHX基因家族包括6個(gè)成員AtNHX1～AtNHX6。在NaCl脅迫下擬南芥葉中，AtNHX1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平比對照高出4倍，而根中則與對照無明顯差異，表明液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)具有組織特異性[10]。He等[11]發(fā)現(xiàn)200 mmol/L NaCl處理?xiàng)l件下，棉花(Gossypiumspp.)過量表達(dá)AtNHX1，其植株產(chǎn)量會(huì)增加，且能產(chǎn)生更多的棉纖維?？梢?，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的遺傳研究對植物的耐鹽脅迫意義重大。

啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，通常僅位于基因上游，可以指導(dǎo)全酶與模板的正確結(jié)合，能夠與RNA聚合酶相互識別、結(jié)合，從而開啟基因的轉(zhuǎn)錄過程，是植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心[12]。啟動(dòng)子核心區(qū)域中含有RNA聚合酶識別位點(diǎn)CAAT-box和RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)TATA-box[13]，具有一些能與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的順式作用元件，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子按其調(diào)控基因的表達(dá)方式可分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織器官特異性啟動(dòng)子3種。目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物所用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子(如35S啟動(dòng)子)，它能夠在組織中非特異性和高效表達(dá)，可以滿足人類的需求，但是外源基因的這種表達(dá)方式打破了植物原有的代謝平衡，影響了植物的正常生長。為了減少這種不利影響，克隆新的啟動(dòng)子對其進(jìn)行功能驗(yàn)證以尋求具有組織特異性的啟動(dòng)子就顯得尤為重要[14]。

鹽生草(Halogetonglomeratus)為藜科(Chenopodiaceae)鹽生草屬一年生雙子葉植物，廣泛分布于我國西北旱區(qū)及半干旱區(qū)，其莖、葉高度肉質(zhì)化，可以在高度鹽堿化的環(huán)境中正常生長。Wang 等[15-16]研究表明，鹽生草具有很強(qiáng)的耐鹽性，其最主要的耐鹽機(jī)制是將毒性離子(主要為Na+、Cl-)區(qū)隔化在葉片細(xì)胞液泡中。是植物耐鹽基因挖掘及研究耐鹽調(diào)控機(jī)理的良好材料，對改良作物抗逆性及培育耐鹽堿作物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。而當(dāng)前關(guān)于鹽生草耐鹽相關(guān)啟動(dòng)子的研究還屬空白，基于此，本實(shí)驗(yàn)以鹽生草為材料，克隆了HgNHX1基因啟動(dòng)子，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)和擬南芥，并利用GUS表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證，闡明了pHgNHX1具有一定的啟動(dòng)子活性，為其通過基因工程手段培育耐鹽植物育種中的運(yùn)用提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1植物材料

實(shí)驗(yàn)所用鹽生草種子采自甘肅省會(huì)寧縣河灘鹽堿地。于2015年播種于裝有蛭石與細(xì)沙(體積比1∶1混合)的花盆中，在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類實(shí)驗(yàn)室人工氣候室培養(yǎng)，每天澆灌適量1/2 Hoagland’s 營養(yǎng)液，待幼苗長至2個(gè)月后，利用200 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理48 h，挑取長勢較好的鹽生草葉片提取DNA。

1.2主要試劑

PCR擴(kuò)增所用的Ex Taq酶、DNA Marker、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4DNA Ligase均購自大連寶生物工程有限公司，PCR引物合成和樣品測序均由上海生工生物科技有限公司完成，Kan、Amp、IPTG、X-gal、Rif等均為進(jìn)口分析純級試劑。

1.3菌株和載體

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌菌株LBA4404、植物表達(dá)載體pBI121均由麥類實(shí)驗(yàn)室保存(甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。PMD19-T Vector購自大連寶生物工程有限公司。

1.4鹽生草基因組DNA的提取

基因組總DNA的提取采用CTAB法，參照文獻(xiàn)[17]，略有改動(dòng)。

1.5鹽生草HgNHX1基因啟動(dòng)子的克隆

本實(shí)驗(yàn)利用TAIL-PCR方法[18-19]從鹽生草基因組DNA中分離HgNHX1基因起始密碼子(ATG)的上游片段。特異引物均由Oligo 7軟件設(shè)計(jì)，并添加酶切位點(diǎn)BamHI和保護(hù)堿基；隨機(jī)簡并引物參考Li等[20]，并添加酶切位點(diǎn)ScaI及保護(hù)堿基。擴(kuò)增5′端上游序列所用隨機(jī)簡并引物及特異性引物如表1所示，其中N=A/G/C/T，W=A/T，S=G/C。序列送上海生工生物科技有限公司合成，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆到PMD19-T載體中，序列測定由上海生工生物科技有限公司進(jìn)行。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in experiment

1.6表達(dá)載體的構(gòu)建

用ScaI和BamHI雙酶切表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒，同時(shí)雙酶切已經(jīng)轉(zhuǎn)入了目的基因的大腸桿菌菌液所提的質(zhì)粒，利用 T4連接酶連接到pBI121載體，替換pBI121 載體上的 CaMV35S 啟動(dòng)子。連接體系為 PCR 片段 6 μL，載體 DNA 1 μL，10×T4DNA Ligase Buffer 1 μL，T4DNA Ligase 1 μL，ddH2O 1 μL，除過T4DNA Ligase，上述其他反應(yīng)物加入后，在65 ℃條件下保溫3 min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰中冷卻數(shù)秒，加入T4DNA Ligase， 16 ℃過夜連接，連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)，測序確定pBI-HgNHX1啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性克隆保存菌液待用。

1.7擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的篩選

利用浸花法[21]轉(zhuǎn)化擬南芥，將含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液在28 ℃，200 r/min的YEP液體培養(yǎng)基(Yeast extract Tryptone medium)中振蕩培養(yǎng)至OD600=1.2～1.6，離心棄上清，用5%蔗糖懸浮至OD600=0.8，浸染前加入Silwet-77 至終濃度為0.05%，混合均勻。擬南芥浸染前保證有大量未成熟的花序，將花序浸入菌液中5～10 s，用黑色塑料袋罩住浸染后植株暗培養(yǎng)16～24 h，之后正常培養(yǎng)，待種子成熟將其收集。

1.8煙草遺傳轉(zhuǎn)化和檢測

煙草種子經(jīng)75%乙醇和5%次氯酸鈉消毒，無菌水洗凈后播于MS培養(yǎng)基上生長4～5周，利用葉盤法[22]轉(zhuǎn)化煙草。取煙草葉片，剪成小塊(0.5 cm×0.5 cm)在MS分化培養(yǎng)基中25 ℃預(yù)培養(yǎng)兩天，將保存的攜帶有pBI-HgNHX1啟動(dòng)子表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液于28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，5000 r/min離心5 min，棄上清，用MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體。將預(yù)培養(yǎng)兩天的煙草葉片浸在菌液中5～10 min，取出后吸干多余菌液接于MS分化培養(yǎng)基上28 ℃共培養(yǎng)2～3 d，用含Cef的無菌水洗葉片2次，再用含MS的液體培養(yǎng)基洗1次，吸干多余液體，轉(zhuǎn)入含Kan和Cef的分化培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，待抗性芽1 cm左右時(shí)，將叢生芽切下放入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，將生根后的幼苗移入盛有無菌土的花盆，溫室常規(guī)管理。

利用CTAB法[17]提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片的 DNA，利用上下游引物進(jìn)行 PCR 檢測，陽性煙草和原始煙草留苗繼續(xù)生長以待用。

1.9GUS組織化學(xué)染色

將抗性篩選的擬南芥植株和陽性煙草葉片加入 GUS 染液，并設(shè)置野生型擬南芥和煙草為對照，37 ℃保溫?cái)?shù)小時(shí)，然后用70%乙醇沖洗浸泡，觀察GUS染色結(jié)果并照相。

2 結(jié)果與分析

圖1 TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Products of TAIL-PCR M: DL4000 marker; SP1:第1輪擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Primary PCR product; SP2:第2輪擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Secondary PCR product; SP3: 第3輪擴(kuò)增PCR產(chǎn)物Tertiary PCR product; AD1:隨機(jī)兼并引物Arbitrary degenerate primer.

2.1HgNHX1啟動(dòng)子的克隆

以鹽生草基因組DNA為模板，利用TAIL-PCR方法經(jīng)過三輪巢式反應(yīng)后將三輪擴(kuò)增產(chǎn)物一起進(jìn)行電泳檢測，選取PCR產(chǎn)物大小差別與特異性引物位置差異相符的DNA片段回收。電泳結(jié)果如圖1。

將目的片段連接克隆載體后測序，得到HgNHX1基因上游全長為1523 bp的序列。通過將該序列ATG上游區(qū)域的Blast比對發(fā)現(xiàn)，它與無翅豬毛菜(Salsolakomarovii)NHX1基因(SkNHX1)5′ UTR區(qū)同源性較高。并將該序列與引物設(shè)計(jì)序列比對，發(fā)現(xiàn)其3′ 端111個(gè)堿基與HgNHX1基因5′ 端序列基本相符。通過以上分析初步證明擴(kuò)增得到的DNA片段是HgNHX1基因5′ 端上游序列。

2.2HgNHX1基因啟動(dòng)子區(qū)域及其順式作用元件分析

利用PlantCARE、PLACE等在線軟件對HgNHX1基因5′ 端上游序列進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果表明該啟動(dòng)子中除具有TATA-box、CAAT-box等核心啟動(dòng)子元件外，還含有多個(gè)與鹽、干旱、缺水、冷、傷害等逆境脅迫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；同時(shí)具有多個(gè)植物激素誘導(dǎo)響應(yīng)的功能元件，預(yù)測的功能元件在序列中的具體位置及元件功能分析見圖2和表2。

2.3pBI-HgNHX1啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

如圖3，為了檢測HgNHX1基因啟動(dòng)子的活性，將HgNHX1啟動(dòng)子構(gòu)建到pBI121載體，替換掉CaMV35s 啟動(dòng)子，與報(bào)告基因 GUS 融合。對構(gòu)建的pBI-HgNHX1 啟動(dòng)子載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在大腸桿菌內(nèi)大量擴(kuò)增，進(jìn)行菌液PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化(圖4)，可知pHgNHX1已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.4pBI-HgNHX1啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定

將攜帶有pHgNHX1的大腸桿菌菌液提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在附加Rif與Kana的YEP固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑取單菌落，菌液PCR 篩選陽性克隆并送出測序。測序結(jié)果與原序列一致，如圖5，表明表達(dá)載體pBI-HgNHX1啟動(dòng)子已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，可進(jìn)行后續(xù)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥實(shí)驗(yàn)。

圖2 HgNHX1啟動(dòng)子上的順式作用元件分布Fig.2 Distribution of cis-elements in HgNHX1 promoter

續(xù)圖2 HgNHX1啟動(dòng)子上的順式作用元件分布Continued Fig.2 Distribution of cis-elements in HgNHX1 promoter

2.5轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

為了探索HgNHX1啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片以獲得轉(zhuǎn)基因苗。如圖6A，將預(yù)培養(yǎng)兩天的煙草葉片用活化好的農(nóng)桿菌菌液浸染，共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至含有Kan和Cef的分化培養(yǎng)基(圖6B)，進(jìn)行抑菌培養(yǎng)及抗性篩選，由圖6C可看出，在抗性篩選過程中大多數(shù)愈傷組織逐漸發(fā)生褐化而死亡，未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生成的芽則會(huì)發(fā)生芽白化或花葉現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化后切口處能分化出綠色抗性小芽的只有少數(shù)。待抗性芽長出，將這些小芽切下移至生根培養(yǎng)基(圖6D)，待其進(jìn)一步分化、生根，直至長成轉(zhuǎn)基因苗(圖6E)。

表2 HgNHX1基因啟動(dòng)子所含元件的具體功能Table 2 Function of cis-elements including in HgNHX1 promoter

續(xù)表2 Continued Table 2

圖3 HgNHX1基因啟動(dòng)子與 GUS 基因融合示意圖 Fig.3 Schematic structure of GUS gene under the control of the HgNHX1 promoter

圖4 pBI-HgNHX1啟動(dòng)子載體的PCR分析Fig.4 PCR analysis of pBI-HgNHX1 vector

圖5 農(nóng)桿菌菌液的PCR鑒定Fig.5 PCR detection of agrobacterium tumefaciens

1～3：載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌液PCR產(chǎn)物PCR-amplified product；-：陰性對照Negative control；M：DL2000 marker. 1～3：農(nóng)桿菌菌液PCR產(chǎn)物PCR-amplified product; -：陰性對照Negative control；M：DL2000 marker.

2.6HgNHX1啟動(dòng)子在煙草葉片中的表達(dá)

轉(zhuǎn)基因煙草葉片及莖經(jīng)X-Gluc染色和脫色后，觀察GUS組織化學(xué)染色情況。結(jié)果顯示，與對照煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片和莖在X-Gluc染液中均變藍(lán)(圖7)，說明該啟動(dòng)子片段具有啟動(dòng)子活性并可指導(dǎo)GUS報(bào)告基因在煙草葉片及莖中表達(dá)。

圖6 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得Fig.6 Obtain the transgenic tobacco A：轉(zhuǎn)化后葉盤; B：愈傷篩選; C、D：抗性芽; E：轉(zhuǎn)基因株系。A：Leaf disc after transformation; B：Callus on selective medium; C,D：Resistance shoots； E：Transgenic plants.

圖7 轉(zhuǎn)基因煙草的 GUS 染色Fig.7 GUS staining of the transformed tobacco lines A,B:轉(zhuǎn)基因煙草葉片; C:野生型煙草葉片; D:轉(zhuǎn)基因煙草莖; E:野生煙草莖。A,B: Leaves of transgenic tobacco; C: Leaves of wild type tobacco; D: Stems of transgenic tobacco; E: Stems of wild type plants.

2.7HgNHX1啟動(dòng)子在擬南芥中的表達(dá)分析

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的 GUS 染色Fig.8 GUS staining of the transformed A. thaliana seedlings lines A:轉(zhuǎn)基因擬南芥; B: 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片(5×)；C: 轉(zhuǎn)基因擬南芥根莖(5×)；D:野生型擬南芥； E: 野生擬南芥葉片(5×)； F: 野生擬南芥根莖(5×)。A: Transgenic A. thaliana; B: Leaves of transgenic plants (5×); C: The roots and stems of transgenic plants (5×); D: Wild type A. thaliana; E: Leaves of wild type plants (5×); F: The roots and stems of wild type plants (5×).

為了探索HgNHX1啟動(dòng)子在擬南芥特異部位表達(dá)的性質(zhì)，用含HgNHX1啟動(dòng)子質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染擬南芥野生型植株，將得到的T0代種子經(jīng)消毒后播種于含有50 mg/L Kan的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。對篩選出的抗性植株的花序及不同生長階段的抗性株系進(jìn)行GUS染色，分析HgNHX1啟動(dòng)子引導(dǎo)的GUS基因在擬南芥中的表達(dá)部位。對轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色分析結(jié)果可看出，擬南芥花序及不同生長時(shí)期的株系在X-Gluc染液中都變?yōu)樗{(lán)色(圖8和圖9)，表明該啟動(dòng)子片段可指導(dǎo)GUS報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥各個(gè)器官中都可表達(dá)。

圖9 轉(zhuǎn)基因擬南芥的 GUS 染色Fig. 9 GUS staining of the transformed A. thaliana lines A,B:轉(zhuǎn)基因擬南芥; C:野生擬南芥; D:轉(zhuǎn)基因擬南芥花序; E:野生擬南芥花序。A,B: Transgenic A. thaliana; C: Wild type A. thaliana; D: Inflorescence of transgenic plants; E: Inflorescence of wild type plants.

3 討論

啟動(dòng)子是一段RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，是轉(zhuǎn)錄水平上基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵部位。植物基因啟動(dòng)子中包含多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基因表達(dá)，從而使植物能夠抵御外界環(huán)境脅迫[23]。啟動(dòng)子上的順式作用元件通常含有TATA-box、CAAT-box 和 GC-box 元件，其中 TATA-box 是啟動(dòng)子上最具特征的序列[24]。本研究利用 Plant CARE、PLACE 等在線軟件對HgNHX1基因5′ 端上游序列進(jìn)行預(yù)測和分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子中具有TATA-box、CAAT-box 等核心啟動(dòng)子元件，表明其具有典型啟動(dòng)子的特征。

不同的啟動(dòng)子都具有自己特異的調(diào)節(jié)序列，楊國棟[25]利用TAIL-PCR方法克隆得到棉花GhNHX1基因的啟動(dòng)子片段。序列分析表明，該啟動(dòng)子中存在與冷、干旱脅迫、鹽脅迫誘導(dǎo)有關(guān)的順式作用元件，包括MYB識別位點(diǎn)、MYC識別位點(diǎn)以及GT1GMSCAM4。楊云堯等[26]得到的新牧1號苜蓿(Medicagosativa)MvNHX1基因啟動(dòng)子包含MYC、G-box以及TC重復(fù)區(qū)等多個(gè)水分脅迫相關(guān)作用元件，表明其可能是一個(gè)與干旱、脫水誘導(dǎo)有關(guān)的啟動(dòng)子。大多數(shù)綠色植物都包含若干個(gè)光應(yīng)答元件, 如 G-box[27]、I-box[28]、GT1 元件(或 GATA元件)[29]、Z-box[27]等，這些作用元件對光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活是必需的[30]。在pHgNHX1中也含有一些光應(yīng)答元件，如AE-BOX、Box I等，預(yù)示著pHgNHX1的表達(dá)調(diào)控可能會(huì)受到光信號的影響。

本研究對獲得的啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該啟動(dòng)子具有多個(gè)與非生物逆境脅迫及植物激素誘導(dǎo)有關(guān)的調(diào)控元件。包括鹽誘導(dǎo)元件GAAAAA，傷害誘導(dǎo)元件TGACY，抗寒、抗凍、缺水和脫落酸誘導(dǎo)元件CANNTG，脫落酸誘導(dǎo)元件ACACNNG，脫水反應(yīng)相關(guān)元件ACGTG、CNGTTR、ACGT等與逆境脅迫相關(guān)的調(diào)控元件；還包括乙烯響應(yīng)元件AWTTCAAA，生長素響應(yīng)順式作用元件TGTCTC，以及赤霉素響應(yīng)順式元件CCTTTT、TAACAAR等與激素誘導(dǎo)有關(guān)的調(diào)控元件。這與文獻(xiàn)[25-26]中報(bào)道的NHX1基因啟動(dòng)子中的功能元件具有一定的一致性，預(yù)示著HgNHX1基因啟動(dòng)子可能是一個(gè)受逆境脅迫和激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草后，對轉(zhuǎn)基因植株的葉片和莖進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，酒精脫色后發(fā)現(xiàn)與對照相比，煙草葉片和莖均被染成藍(lán)色，結(jié)果表明克隆的HgNHX1啟動(dòng)子序列具有啟動(dòng)子活性。然后用同樣的方法侵染擬南芥，并對轉(zhuǎn)基因擬南芥花序和不同生長時(shí)期的株系進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列不僅能正確啟動(dòng)GUS基因表達(dá)，而且在轉(zhuǎn)基因擬南芥生長的各個(gè)時(shí)期、各個(gè)器官中都可表達(dá)，說明pHgNHX1具有一定的組成型啟動(dòng)子活性。下一步工作是對該啟動(dòng)子序列進(jìn)行系列缺失，并構(gòu)建包含不同長度啟動(dòng)子缺失片段的植物表達(dá)載體，導(dǎo)入煙草葉片和擬南芥植株進(jìn)行功能驗(yàn)證，并確定核心啟動(dòng)子區(qū)域，通過研究該啟動(dòng)子在植物耐鹽方面的功能，進(jìn)一步研究HgNHX1在鹽脅迫中的作用，提高作物的耐鹽性，并對培育耐鹽作物具有重要意義。

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CloningandfunctionalanalysisofhalophyteHalogetonglomeratusHgNHX1promoter

ZOU Lan1,2**, YANG Ke1,2**, XU Xian-Liang1,2, WANG Jun-Cheng1,2, REN Pan-Rong1,2, YAO Li-Rong1,2, MENG Ya-Xiong1,2, LI Bao-Chun1,3, MA Xiao-Le1,2, WANG Hua-Jun1,2*

1.Gansu Provincial Key Lab of Aridland Crop Science, Gansu Key Lab of Crop Improvement amp; Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, China; 2.College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3.College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China

In order to test the function ofpHgNHX1, the promoter sequence of theHgNHX1 gene fromHalogetonglomeratuswas cloned and a 1523 bp fragment flanking 5′-upstream ofHgNHX1 was isolated and namedpHgNHX1. The software PlantCARE and PLACE were used to predict and analyze the elements ofpHgNHX1. The results showed that besides the TATA-box and CAAT-box, a number of potential cis-elements and transcription binding motifs related to stress responses were found, including salt, dehydration, cold and wound responsive elements. Other potential cis-elements responsive to phytohormones, including auxin, abscisic acid, gibberellin and ethylene were also found in the sequence. Sequence analysis indicated that it had the general characteristics of typical promoter. In order to evaluate the activity ofpHgNHX1, we constructed pBI-pHgNHX1 expression vector and introduced it into tobacco and Arabidopsis using agrobacterium mediated transformation. The expression pattern was monitored using GUS histochemical staining. Results showed that GUS activity driven by thepHgNHX1 was detected in almost all vegetative and reproductive tissues, indicating thatpHgNHX1 has a constitutive promoter activity.

Halogetonglomeratus;HgNHX1 gene; promoter; GUS

10.11686/cyxb2017018http//cyxb.lzu.edu.cn

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ZOU Lan, YANG Ke, XU Xian-Liang, WANG Jun-Cheng, REN Pan-Rong, YAO Li-Rong, MENG Ya-Xiong, LI Bao-Chun, MA Xiao-Le, WANG Hua-Jun. Cloning and functional analysis of halophyteHalogetonglomeratusHgNHX1 promoter. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(11): 57-68.

2017-01-18；改回日期：2017-03-14

973計(jì)劃前期研究專項(xiàng)(2014CB160313)，國家大麥青稞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-05)和國家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目(31460347)資助。

鄒蘭(1992-)，女，甘肅會(huì)寧人，在讀碩士。E-mail:956805769@qq.com。楊軻(1983-)，男，甘肅蘭州人，在讀博士。Email：yk_831116@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author. E-mail:whuajun@yahoo.com