酶聯(lián)免疫法快速檢測奶粉中的葉酸

李江,嚴(yán)家俊,綦艷,佘之蘊(yùn),張娟,黃寶瑩,趙玲

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣東),佛山 528300)

酶聯(lián)免疫法快速檢測奶粉中的葉酸

李江,嚴(yán)家俊,綦艷,佘之蘊(yùn),張娟,黃寶瑩,趙玲

(廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣東),佛山 528300)

建立一種檢測奶粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酶聯(lián)免疫分析方法.奶粉樣本經(jīng)純水溶解提取,再做1∶4稀釋,通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定奶粉中的葉酸.結(jié)果表明,當(dāng)加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20,40 μg/kg和80 μg/kg時,空白基質(zhì)奶粉中葉酸的提取回收率為93.5%~118.0%;非空白基質(zhì)樣品中葉酸的加標(biāo)回收率為88%~92%;方法檢出限為4 μg/kg;與高效液相色譜法結(jié)果的相對偏差小于10%.酶聯(lián)免疫法能夠快速、準(zhǔn)確檢測奶粉中的葉酸.

葉酸;酶聯(lián)免疫法;奶粉

0 引言

葉酸,也叫維生素B9,是一種重要的水溶性B族維生素[1],缺乏葉酸會導(dǎo)致人體產(chǎn)生各種疾病,如孕婦缺乏葉酸會造成新生兒神經(jīng)管缺陷(NTDs)或無腦等疾病[2-3].目前,《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸限值:一為500~2 500 μg/kg[4].葉酸是人體維持正常生理功能必須的微量物質(zhì),對孕婦和新生兒也有著特殊的重要性[5],因此建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測分析方法就顯得格外重要.

現(xiàn)葉酸含量多采用紫外分光光度法、熒光法[6-7]、液相色譜法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[8-9],由于嬰幼兒乳制品中葉酸含量低、基質(zhì)復(fù)雜,定量分析困難;而ELISA法因其檢測結(jié)果快速準(zhǔn)確,靈敏度高,操作簡便,可廣泛用于奶粉樣品中葉酸的檢測.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

甲醇(分析純),葉酸標(biāo)準(zhǔn)品.

葉酸檢測試劑盒,試劑盒的組成:包被有葉酸抗原的酶標(biāo)板、葉酸抗體、酶標(biāo)二抗、葉酸標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色A、B液、終止液和濃縮洗滌液,試劑盒快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定,無需長時間培養(yǎng).

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀,渦旋儀,Thermo高速離心機(jī),微量移液器,Gamp;G電子天平.

奶粉樣本(市售).

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取2.0 g奶粉樣品于50 mL離心管中,加入40 mL純水溶解;于渦旋儀上劇烈振蕩2 min至奶粉充分溶解;取200 μL上述樣品,加入800 μL樣本稀釋液;充分振蕩混勻,取50 μL進(jìn)行分析.

1.2.2 ELISA檢測樣本中葉酸

將葉酸檢測試劑盒從冰箱中取出,置于室溫(23~25℃)平衡30~40 min,取出微孔板,將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號;加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對應(yīng)的微孔中,加入葉酸酶標(biāo)物50 μL/孔,再加入葉酸抗試劑50 μL/孔,輕微搖動混勻,置室溫避光反應(yīng)30 min;反應(yīng)時間結(jié)束,小心揭開膜,將微孔內(nèi)液體甩干,用洗滌液300 μL/孔,充分洗滌5次,每次間隔15 s,然后在吸水紙上拍干;加入底物顯色A液50 μL/孔,再加入底物顯色B液50 μL/孔,輕輕搖動混勻,置室溫避光反應(yīng)15 min;反應(yīng)時間結(jié)束,加入終止液50 μL/孔,在雙波長450/630 nm處測定每孔OD值.

1.3 定量分析方法

采用試劑盒專用的分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析,該試劑盒靈敏度為0.003 μg/kg,變異系數(shù)小于10%.最終檢測結(jié)果以實(shí)際測定的吸光度值與稀釋倍數(shù)換算后得出.

2 結(jié)果與分析

2.1 加標(biāo)回收率結(jié)果

對加標(biāo)后的空白基質(zhì)奶粉(加標(biāo)濃度分別為20.0,40.0 μg/kg和80.0 μg/kg)按照試劑盒操作方法提取、稀釋、測定(雙孔雙平行),計算出葉酸加標(biāo)回收率的結(jié)果(見表1).由表1可知,加標(biāo)回收率結(jié)果在93.5%~118.0%,說明該方法適用于奶粉中葉酸的測定.

表1 空白基質(zhì)樣品加標(biāo)回收率結(jié)果(n=6)

2.2 進(jìn)一步增大稀釋比例結(jié)果

為使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確,在提取比例1∶20不變條件下對提取后的稀釋比例進(jìn)一步分析、優(yōu)化,考慮方法檢出限不能過高的原因,因此選取1∶4,、1∶6和1∶9(體積比)三個稀釋比例,的檢測結(jié)果,由結(jié)果可知三個稀釋比例條件下回收率都在可接受的范圍內(nèi)(見表2),本研究方法選用1∶4比例稀釋,樣本檢測結(jié)果見表3.

2.3 方法檢出限

用試劑盒分別檢測6份采用液相色譜方法測定為陰性的樣本,計算樣本中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),方法的檢出限等于陰性空白樣本的檢測平均值加上陰性樣本檢測濃度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,檢測結(jié)果如表4所示.

表2 進(jìn)一步增加稀釋比例的回收率結(jié)果(n=6)

表3 樣本檢測結(jié)果

表4 方法檢出限的結(jié)果(n=6)

2.4 結(jié)果與液相方法比較

為確定研究方法的準(zhǔn)確性,選取已知濃度的5個奶粉樣本與液相檢測結(jié)果進(jìn)行比較(表5).由表5結(jié)果可以看出,試劑盒法與液相法符合率在91.4%~107.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%,說明該方法能夠?qū)δ谭壑腥~酸進(jìn)行定量檢測.

表5 試劑盒方法與液相方法檢測結(jié)果對比

3 結(jié)論

建立了一種對奶粉中葉酸進(jìn)行檢測的酶聯(lián)免疫分析方法,通過對整個檢測體系的優(yōu)化,用純水1∶20提取,再以1∶4水稀釋,方法靈敏度高,精密度均小于10%,與液相檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%,檢測效率高、實(shí)驗(yàn)周期短、為進(jìn)一步探究其他食品中葉酸的檢測奠定了基礎(chǔ).

[1]文小青,楊月欣.食物中維生素A、葉酸和維生素E分析方法研究進(jìn)展[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2004,16(1):65-70.

[2]劉莉治,羅曉燕,周洪偉,等.高效液相柱后衍生法測定嬰幼兒食品中的葉酸[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(7):1179-1180.

[3]黃宏南,陳宏靖,黃健文,等.高效液相色譜熒光快速測定保健食品中的葉酸[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2002,12(1):70-70.

[4]GB 14880-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S]2012.

[5]羅敏婷,吳克剛,黃偉乾,等.嬰幼兒輔食營養(yǎng)補(bǔ)充品中葉酸的測定方法[J].食品與機(jī)械,2016,32(9):34-38.

[6]郭健,李敏,孟妍,等.熒光分光光度法測定食品中葉酸的含量[J].中國公共衛(wèi)生,2003,19(10):1259-1259.

[7]李全霞,崔亞娟,趙寅菲,等.微生物法測定食品中水溶性維生素的原理及進(jìn)展[J].食品科學(xué),2013,34(13):338-344.

[8]陳雄,吳周和,吳傳茂,等.利用高效液相色譜儀初步研究葉酸的穩(wěn)定性[J].食品科學(xué),2001,22(7):70-71.

[9]王鳳玲,劉愛國,孫佳佳,等.高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中葉酸、VB12和生物素[J].食品科學(xué),2013,34(22):269-272.

Rapid detection of folic acid in milk powder by enzyme linked immunosor bent assay

LI Jiang,YAN Jiajun,QI Yan,SHE Zhiyun,ZHANG Juan,HUANG Baoying,ZHAO Ling
(Guangdong Testing Institute for Product Quality Supervision,China National Quality Supervision and Testing Center for Foods,Foshan 528300,China)

To establish a method for the detection of folic acid in milk powder by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Milk pow?der was extracted with pure water and processed with 1∶4 dilution,and then the content of folic acid in samples was determined by ELISA.When the spiked concentrations were 20,40 μg/kg and 80 μg/kg,the recoveries of folic acid in blank milk powder were 93.5%~118.0%;the recoveries of folic acid in milk powder were 88%~92%;the limit of detection was 4 μg/kg.Compared with the high performance liquid chromatography(HPLC)method,the relative standard deviation of result was less than 10%.This method can detect folic acid in milk pow?der quickly and accurately.

folic acid;enzyme linked immunosorbent assay;milk powder

TS252.7

A

1001-2230(2017)10-0037-02

2017-04-07

國家質(zhì)檢總局項(xiàng)目(2013QK281).

李江(1985-),男,工程師,主要研究方向?yàn)槭称钒踩L(fēng)險評估和毒理學(xué)研究.