大苞水竹葉組培快繁及再生體系的建立

李翠+韋瑩+李林軒+郭曉云+趙以民+張占江

摘要：擬采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)解決大苞水竹葉種苗短缺和種質(zhì)資源可持續(xù)開發(fā)利用的問題，從而為人工種植提供技術(shù)支持。對消毒劑、消毒時間進行篩選，以大苞水竹葉側(cè)芽為外植體，以MS、B5、N6為基本培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計研究植物生長調(diào)節(jié)劑多因素組合[6-BA、KT、NAA、IAA、IBA、活性炭（AC）]對大苞水竹葉進行初代誘導、不定芽分化和誘導生根的影響。結(jié)果表明，體積分數(shù)為0.1%的氯化汞為最佳滅菌劑，滅菌時間為8 min時誘導率最高，最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；不定芽最佳誘導培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT，外植體經(jīng)15 d誘導培養(yǎng)，可分化形成11個不定芽；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA最利于不定芽繼代增殖；MS+2.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA最適于誘導生根獲得再生植株，生根率93.1%；生根苗宜移栽于泥炭+黃沙（體積比 3 ∶1）的基質(zhì)上，成活率84%。由結(jié)果可以看出，該組培快繁途徑繁殖速度快、再生率高，有望為栽培大苞水竹葉提供大量種苗，為壯藥深入開發(fā)利用研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大苞水竹葉；壯藥；組培快繁；再生體系

中圖分類號： Q945.51 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0143-03

收稿日期：2016-04-28

基金項目：廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥標準化課題（編號：GZBZ14-15）；廣西壯藥質(zhì)量標準研究項目（編號：MZY2013052）。

作者簡介：李 翠（1982—），女，黑龍江依安人，碩士，助理研究員，主要研究方向為藥用植物繁育與保存。Tel：（0771）5602850；E-mail：licuicui941@aliyun.com。

通信作者：張占江，博士，副研究員，研究方向為藥用資源保護與開發(fā)利用。Tel：（0771）5603824；E-mail：zzj1811@163.com。 大苞水竹葉{Murdannia bracteata（C. B. Clarke） O. Kuntze[Aneilema bracteata （C. B. Clarke） O. Kuntze]}為鴨趾草科水竹草屬植物[1]，是著名的壯藥痰火草的源植物，為多年生常綠草本。大苞水竹葉根呈圓柱狀，長20～30 cm，花期5—8月，果期6—9月，主要生長在海拔500～850 m的水溝邊及密林下，分布于廣東、海南、廣西、云南等地。收載于《中華本草》《全國中草藥匯編》《廣西藥用植物名錄》等。大苞水竹葉多分布于長江以南各?。▍^(qū)），尤以西南地區(qū)為盛。其根入藥，具有較高的藥用價值，售價約100元/kg，具有逐水通便、消腫散結(jié)的功效，主治水腫，此外還有通經(jīng)之效，用于治療慢性腎炎、晚期血吸蟲病腹水或其他肝硬變腹水等癥[2]。近年來，隨著市場需求量的不斷增加，野生大苞水竹葉資源瀕臨枯竭，生產(chǎn)上難以實現(xiàn)大面積栽培。采用生物技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)，可以有效快速地提高大苞水竹葉種苗的繁殖速度和質(zhì)量，滿足大苞水竹葉的市場需求，也可為壯藥痰火草資源可持續(xù)開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和基本培養(yǎng)條件

本試驗所需材料采集自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園引種繁育圃內(nèi)引種栽培的生長健壯、無病蟲害的優(yōu)良大苞水竹葉植株，選取其側(cè)芽作為外植體進行誘導，先將大苞水竹葉側(cè)芽表面洗凈去污，用濃度為75%的乙醇滅菌30～45 s，然后用無菌水沖洗1～3次，放入滅菌劑滅菌，再用無菌水沖洗2～5次，然后用無菌濾紙將側(cè)芽表層的水分吸干，最后將測芽置于基本培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，在平均光照度2 000 lx下培養(yǎng)，光照時間12 h/d，溫度（24±2） ℃。

1.2 適宜滅菌條件的篩選

設(shè)計2組消毒試驗。第1組設(shè)計不同消毒劑種類：0.1% HgCl2 10 min，2% NaClO 20 min，50%的84消毒液20 min，2% H2O2 20 min，從中篩選最適合的消毒劑；第2組設(shè)計不同的消毒時間：5、6、7、8、9、10 min。所有的試驗都是在接種后 15 d 對試驗對象的污染率、成活率進行統(tǒng)計。

1.3 不定芽誘導分化條件的篩選

本試驗基于MS、B5、N6培養(yǎng)基，添加NAA、IAA、6-BA這3種不同類型激素，并開展NAA濃度（0.5、1.0、1.5 mg/L）、KT濃度（0.1、0.2、0.4 mg/L）、6-BA濃度（1.0、1.5、2.0 mg/L）的正交設(shè)計（表1），研究不同激素組合對大苞水竹葉不定芽誘導的影響，每個處理10瓶，每瓶4個外植體，20 d后記錄外植體的誘導情況，比較不同組合誘導不定芽能力的差異。

1.4 不定芽繁殖條件的篩選

在MS為基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以6-BA、IAA為生長調(diào)節(jié)激素，考察大苞水竹葉不定芽繁殖情況。通過6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IAA（0.2、0.4、0.6 mg/L）2種激素濃度組合試驗，對大苞水竹葉的繁殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，每個處理10瓶，每瓶4個單芽，20 d后測定試管苗生長情況和芽增殖倍數(shù)[芽增殖倍數(shù)=（20 d后芽數(shù)-接種時芽數(shù)）/接種時芽數(shù)]，以芽增值倍數(shù)為主要考察指標來優(yōu)化繁殖培養(yǎng)基。

1.5 生根條件的篩選

為了研究大苞水竹葉無菌苗生根壯苗的最適合培養(yǎng)基，以MS為基本培養(yǎng)基，對IBA濃度（1.0、2.0 mg/L）、活性炭（AC）濃度（0.5、1.0、1.5 mg/L）進行組合試驗，對大苞水竹葉的繁殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，將生長健壯、高2～3 cm的無根苗接種于4種不同處理的生根培養(yǎng)基上，每個處理10瓶，每瓶8個單芽，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計結(jié)果，計算生根率與生根數(shù)平均值，相關(guān)公式如下：

生根率=（生根數(shù)/接種總數(shù)）×100%；endprint

生根數(shù)平均值=（總生根數(shù)/接種總數(shù)）×100%。

1.6 煉苗及移栽

當生根培養(yǎng)的大苞水竹葉瓶苗長至3～5 cm高、有3張以上葉片和3～5條根時，即可出瓶移栽。挑選生長旺盛、根系發(fā)達的試管苗，為使無菌苗移栽后適應(yīng)自然環(huán)境，出瓶前在實驗室散射光下煉苗2 d，轉(zhuǎn)移至走廊處煉苗3 d，其間需向瓶內(nèi)植株灑水以保持瓶內(nèi)水分充足，將生根試管苗小心地從培養(yǎng)瓶中取出，用水洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，單株栽入基質(zhì)（V木屑 ∶V草炭土=3 ∶1），置于室內(nèi)1周，2 d澆水1次，保持土質(zhì)80%左右的濕潤度，溫度18～25 ℃，木屑保水性、透氣性都很好。30 d后統(tǒng)計不同基質(zhì)中組培苗的成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌條件的選擇

如表2所示，0.1% HgCl2具有較好的消毒效果，外植體消毒成功率達到60%；NaClO、84消毒液、H2O2消毒效果均不夠理想，消毒不徹底，污染率高。由表3知：使用0.1% HgCl2消毒 8 min成功率最高，達到90%， 低于8 min時污染率高，

高于8 min時，污染率雖然降低，但是死亡率不斷升高。因此，綜合比較可知，較好的消毒劑為0.1% HgCl2，較好的消毒時間為8～10 min。

2.2 不定芽的誘導條件選擇

將頂芽分化獲得的不定芽進行快速繁殖培養(yǎng)，外植體接種到MS、B5、N6培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23～26 ℃、光照度為1 400～2 000 lx、光照時間為10～12 h/d的條件下培養(yǎng)15 d，側(cè)芽分化后獲得不定芽。B5培養(yǎng)基中側(cè)芽分化成愈傷褐化，N6培養(yǎng)基中側(cè)芽分化慢，系數(shù)低；MS培養(yǎng)基中含0.1～0.4 mg/L KT、1.0～2.0 mg/L 6-BA、1.0～2.0 mg/L NAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為58。觀察發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度的增加，大苞水竹葉不定芽數(shù)均增加。由表4可以看出，最優(yōu)組合是A3B2C1，即在培養(yǎng)基中添加0.4 mg/L KT、1.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的不定芽繁殖效果最好，平均分化出11個不定芽。組培苗誘導的各個階段效果見圖1。

2.3 不定芽壯苗條件選擇

將“2.2” 節(jié)中得到的試管苗不定芽置于MS壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23～26 ℃、光照度1 400～2 000 lx、光照時間10～12 h/d的條件下培養(yǎng)40 d，得到健壯植株，其中MS壯苗培養(yǎng)基中含0.5～1.5 mg/L 6-BA、0.2～0.6 mg/L IAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8，觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.6 mg/L IAA時壯苗效果最好，株高達到5.37 cm（表5）。

2.4 健壯植株生根培養(yǎng)條件選擇

將得到的健壯植株置于生根培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度23～26 ℃、光照度1 400～2 000 lx、光照時間10～12 h/d的條件下培養(yǎng)40 d，得到帶根的完整植株，其中MS生根培養(yǎng)基中含0.5～1.5 mg/L IAA、1.0～2.0 mg/L IBA、25～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.8。觀察發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中IAA濃度增加，組培苗的生根率也提高；培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L IBA和1.0 mg/L IAA的生根效果最好，生根率達93.1%，平均根長達到4.49 cm（表6）。

2.5 試管苗移栽條件

經(jīng)生根培養(yǎng)后的大苞水竹葉，挑選生長旺盛、根系發(fā)達的試管苗移入常溫室內(nèi)放置，擰松蓋子，2 d后掀開蓋子讓大苞水竹葉幼苗與空氣完全接觸，其間需向瓶內(nèi)的植株灑水以保持瓶內(nèi)的水分充足。3 d后從瓶內(nèi)取出幼苗，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽于消過毒的泥炭、泥炭+蛭石（體積比3 ∶1）、泥炭+黃沙（體積比3 ∶1）3種不同基質(zhì)上，適度遮陰，并保持一定的濕度。30 d后統(tǒng)計生根率和生長率。由表7可以看出，不同基質(zhì)成活率的高低順序為泥炭+黃沙（體積比3 ∶1）>泥炭+蛭石（體積比3 ∶1）>泥炭。因此，試管苗移栽最好的基質(zhì)為泥炭+黃沙（體積比3 ∶1），移栽30 d成活率為84%。

3 討論

鴨跖草科植物均為草本，主要分布于熱帶，少數(shù)種產(chǎn)于亞熱帶、溫帶地區(qū)，中國產(chǎn)13屬49種，多分布于長江以南各?。▍^(qū)），尤以西南地區(qū)為盛。目前對鴨跖草科植物的研究開展的較少，僅有關(guān)于其生物學特性[1-2]、分布與分類[3]、種植栽培、病蟲害[4]、化學成分[5-7]、藥理作用的報道[8]，未見有關(guān)組培的報道。本研究采用大苞水竹葉側(cè)芽為外植體，以芽繁芽，未經(jīng)過愈傷組織階段，對側(cè)芽分化及植株再生方法進行探討，建立了大苞水竹葉的離體再生體系，有利于保持大苞水竹葉的遺傳穩(wěn)定性，不但滿足了工廠化生產(chǎn)的需求，還具有實際意義。

植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，能以極微小的量影響植物的細胞分化、分裂和發(fā)育，在植物離體培養(yǎng)中起重要調(diào)節(jié)作用[9]。當細胞分裂素/生長素的比值合適時，能誘導芽的形成和促進芽的生長。6-BA是重要的細胞分裂素，能促進細胞分裂、非分化組織分化、側(cè)芽生長等；NAA是植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進細胞分裂與擴大、誘導形成不定根等作用；IAA是植物生長素，能促進細胞分裂與細胞生長，誘導形成不定根[10-11]。多種激素組合能更有效地促進植物的生長，因此在MS培養(yǎng)基中加入6-BA、IAA配合使用，對大苞水竹葉生長均具有較大的影響。本研究得出，大苞水竹葉增殖的最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA，在此培養(yǎng)基上增值率為6.5且芽苗翠綠粗壯。試驗中不定芽生根率達93.1%，移栽成活率為98%，生產(chǎn)出的種苗，既可滿足人們對大苞水竹葉的用途需求，又可保護珍稀瀕危種質(zhì)資源，同時還為豐富我國園林植物種類提供保障。本研究為著名壯藥植物大苞水竹葉的保護和可持續(xù)開發(fā)利用開辟了一條新的途徑，同時可為同屬其他物種的組織培養(yǎng)研究提供借鑒。

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