真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜屏障功能的保護作用*

王 慧， 毛晶磊， 吳艷敏， 王 琪， 羅曉慶， 官 杰△

(1齊齊哈爾醫(yī)學院免疫教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2大慶油田總醫(yī)院藥劑科， 黑龍江 大慶 163000)

真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜屏障功能的保護作用*

王 慧1， 毛晶磊2， 吳艷敏1， 王 琪1， 羅曉慶1， 官 杰1△

(1齊齊哈爾醫(yī)學院免疫教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2大慶油田總醫(yī)院藥劑科， 黑龍江 大慶 163000)

目的觀察真人養(yǎng)臟湯(ZRYZ)對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠腸道黏膜屏障功能的保護作用以及緊密連接相關(guān)蛋白閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)和閉鎖蛋白(occludin)的表達變化，探討其可能作用機制。方法將Wistar雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶(SASP)陽性對照組、ZRYZ高劑量組和ZRYZ低劑量組。除正常組外，其它各組用TNBS/50%乙醇混合溶液局部灌腸法復制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。造模成功后陽性對照組給予SASP混懸液灌胃；ZRYZ高劑量組和ZRYZ低劑量組分別按生藥30.4 g/kg和15.2 g/kg劑量灌胃；正常組與模型組等量生理鹽水灌胃，共21 d。給藥結(jié)束后，考察大鼠疾病活動指數(shù)(DAI)變化，進行大體損傷評分，測定腸道黏膜通透性(以尿中乳果糖/甘露醇的比值表示，即L/M值)，測定結(jié)腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性，計數(shù)結(jié)腸組織杯狀細胞數(shù)量，測定血清二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸(D-LA)水平，檢測ZO-1和occludin的表達。結(jié)果與正常組相比，模型組DAI、大體損傷評分、L/M值、結(jié)腸組織MPO活性以及血清D-LA和DAO水平明顯升高(P<0.05)，結(jié)腸組織杯狀細胞數(shù)量以及ZO-1和occludin表達明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，ZRYZ高劑量組和ZRYZ低劑量組DAI、大體損傷評分、L/M值、結(jié)腸組織MPO活性以及血清DAO和D-LA水平明顯降低(P<0.05)，結(jié)腸組織杯狀細胞數(shù)量以及ZO-1和occludin表達明顯升高(P<0.05)。結(jié)論真人養(yǎng)臟湯可通過降低腸道黏膜通透性，保護潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道上皮細胞黏膜屏障功能，其機制可能與升高ZO-1和occludin表達有關(guān)。

真人養(yǎng)臟湯； 潰瘍性結(jié)腸炎； 黏膜屏障； 閉鎖小帶蛋白1； 閉鎖蛋白

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種非特異性腸黏膜的慢性炎癥性疾病[1-2]。中醫(yī)學雖無潰瘍性結(jié)腸炎病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，應(yīng)歸屬于“大瘕泄”、“便血”、“腸癖”、“泄瀉”等范疇[3]。潰瘍性結(jié)腸炎臨床上表現(xiàn)為腹瀉，黏液、膿血便，腹痛及里急后重，其病理特點為結(jié)腸黏膜的慢性炎癥和潰瘍形成。研究表明，黏膜屏障在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制中占重要地位[4]。緊密連接蛋白是腸黏膜屏障的主要組成部分，因此維持緊密連接蛋白的完整性、保護腸黏膜屏障對治療潰瘍性結(jié)腸炎顯得至關(guān)重要[5]。真人養(yǎng)臟湯(Zhenrenyangzang decoction，ZRYZ)出自《太平惠民和劑局方》，由人參、當歸、白術(shù)、肉豆蔻、肉桂、甘草、白芍、木香、訶子等組成，具有補虛溫中、澀腸固脫之功效，為治療脾腎虛寒型泄痢的良方，服之可使已傷之臟氣得以補養(yǎng)，虛寒之瀉痢，滑脫不禁諸癥自愈，故名“真人養(yǎng)臟”，現(xiàn)多單獨或加減化裁后用于治療慢性潰瘍性結(jié)腸炎。本研究前期實驗表明，真人養(yǎng)臟湯通過影響腸黏膜sIgA合成、γδT細胞表達，減輕潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞病變，對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜免疫屏障具有一定的修復作用，同時能夠恢復潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠體內(nèi)已失衡的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，如降低IL-17、IFN-γ、TNF-α水平等[6-7]。本研究旨在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道黏膜屏障功能的保護作用以及緊密連接相關(guān)蛋白閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)和閉鎖蛋白(occludin)的表達變化，探討其可能作用機制。

材 料 和 方 法

1實驗動物

72只健康成年雄性Wistar大鼠，SPF級，體重(220±20)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號為SCXK(黑)2013-001。空調(diào)恒溫室內(nèi)22 ℃，相對濕度50%，自由飲水，通風換氣每小時8次。

2藥物與試劑

本實驗用的ZRYZ組方在古文獻記載基礎(chǔ)上略有改動，藥物組成：人參、當歸、炒白術(shù)、肉豆蔻、肉桂、炙干草、白芍、木香、訶子。藥材由齊齊哈爾市中醫(yī)院中藥房提供，水煎濃縮至生藥量2×103g/L，高壓滅菌后冰箱保存?zhèn)溆?。柳氮磺吡?salazosulfapyridine， SASP)腸溶片購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司(國藥準字：H31020557)，使用前用蒸餾水配制成50 g/L；三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid， TNBS； Sigma)；兔抗ZO-1抗體和小鼠抗occludin抗體(Abcam)； FITC標記抗兔 II 抗和FITC標記抗小鼠 II 抗(Abbkine)；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

3方法

3.1潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型制備 隨機抽取12只大鼠，設(shè)為正常(normal)組，其余60只大鼠進行造模。采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制備潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型：將大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(2.5 mL/kg)后，一次性將TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 mL)溶液用改良的大鼠灌胃針輕緩注入大鼠距肛門約7～8 cm深的腸腔內(nèi)，注射完畢用手捏住肛門停留數(shù)分鐘，防止溶液外漏，讓動物保持下腹部上傾狀態(tài)，注意保暖，自然清醒。正常組12只大鼠也采用同樣方法用等量的0.9%生理鹽水溶液灌腸。

3.2分組與給藥 12 h后觀察造模動物，約85%大鼠出現(xiàn)稀便和血便。3 d后，隨機處死3只，取距肛門約7～8 cm處結(jié)腸，肉眼可見潰瘍面，表明造模成功。造模動物隨機分成模型(model)組、SASP陽性對照(positive control)組、ZRYZ高劑量(ZRYZ-H)組和ZRYZ低劑量(ZRYZ-L)組，每組均12只。ZRYZ高劑量組和ZRYZ低劑量組分別按生藥30.4 g/kg和15.2 g/kg劑量灌胃(按照臨床成人用量的10及20倍折算)，陽性對照組按0.5 g/kg劑量灌胃給予SASP，正常組和模型組灌服等體積0.9%生理鹽水溶液。各組于造模后第3天開始灌胃，每天1次，連續(xù)21 d。給藥期間，記錄動物體重及糞便性狀的變化。

3.3病變活動指數(shù)(disease activity index，DAI)的評價[5, 8]每天觀察并記錄所有大鼠的一般情況、體重變化、大便性狀和大便隱血情況，按照DAI評分標準進行評分：(1)體重下降：體重下降<1%，計0分；體重下降1%～5%，計1分；體重下降6%～10%，計2分；體重下降10%～15%，計3分；體重下降>15%，計4分。(2)大便性狀：正常，計0分；軟便但成形，計2分；軟便不成形，計3分；腹瀉，計4分。(3)大便隱血/肉眼血便：正常，計0分；隱血陽性，計2分；肉眼血便，計4分。DAI=(體重下降評分+大便性狀評分+大便隱血情況評分)/3。

3.4血清及標本的采集 末次給藥后禁食不禁水24 h，各組分別取6只大鼠，7%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血。血樣3 500 r/min離心15 min，收集血清，-20 ℃保存，用于二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)和D-乳酸(D-lactic acid，D-LA)的測定。采血后處死大鼠，取距肛門大約8 cm深結(jié)腸，沿縱軸剪開，用冰生理鹽水清洗干凈。

3.5大體形態(tài)損傷評價[9]肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)、結(jié)腸黏膜損傷情況，大體形態(tài)損傷評分參照Luk等[9]標準進行：無損傷，計0分；充血但沒有潰瘍，計1分；充血且腸壁變厚但沒有潰瘍，計2分；有一處小潰瘍，直徑約0～1 cm，計3分；潰瘍較大，直徑約1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連，計4分；潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴重，計5分。

3.6黏膜通透性的評價 末次給藥后禁食不禁水24 h，各組分別取6只大鼠，放置代謝籠中，環(huán)境溫度控制在25～28 ℃。取2 mL 乳果糖(L)/甘露醇(M)混合液灌胃，收集24 h內(nèi)尿液，以3 000 r/min離心10 min，取10 mL尿液加入2 mL 0.2 g/L硫柳汞防腐后，置于離心管中，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩２捎酶邏阂合嗌V分析法測定尿液中的乳果糖和甘露醇含量，計算L/M值。

3.7髓過氧化物酶(myeloperoxidase， MPO)活性的測定[10]將結(jié)腸組織50 mg置于0.5%十六烷基三甲基溴化胺溶液中勻漿，4 ℃以14 000 r/min離心15 min。棄沉渣，取上清80 μL，加入磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 6.0，含有0.0005%鄰聯(lián)二茴香胺和0.1% H2O2)120 μL。以30 s為間隔測定吸光度(A)值，共計2 min。計算2 min內(nèi)A值變化率并計算MPO活性。MPO活性以1 g結(jié)腸組織中含有的酶活性單位數(shù)表示。

3.8過碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色觀察結(jié)腸杯狀細胞數(shù)量 結(jié)腸經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，碘酸酒清染液染色，洗片后，置于Schiff染色液中染色10 min。洗片，蘇木精染色3 min。然后常規(guī)脫水、透明、封片。計數(shù)每個隱窩-絨毛軸中的杯狀細胞數(shù)量。

3.9血清DAO和D-LA含量測定 采用ELISA法測定血清DAO和D-LA的含量，嚴格按照ELISA試劑盒的操作說明進行操作。

3.10Western blot法檢測ZO-1和occludin 的表達 結(jié)腸組織勻漿后，加入適量RIPA裂解液，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄沉渣，收集上清液，BCA法測定總蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣后進行10% SDS-PAGE。當電泳完成后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉。I 抗孵育過夜，PBST沖洗后 II 抗孵育，ECL化學發(fā)光劑顯色。ImageJ 2x軟件對各條帶進行進行灰度值分析。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行描述性統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠DAI的影響

在實驗過程中，正常組大鼠飲食飲水正常，體重逐漸增加，毛發(fā)光澤，活動敏捷，未出現(xiàn)稀便情況，肛周潔凈；模型組大鼠出現(xiàn)懶動，精神萎靡，飲食下降，體重降低，血便，稀便等癥狀；陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組初期出現(xiàn)飲食減少，體重下降，腹瀉等癥狀，但是程度明顯較輕。隨著給藥時間的延長，各組大鼠飲食逐漸好轉(zhuǎn)，體重逐步增加，腹瀉逐漸消失。模型組大鼠DAI顯著增高，與正常組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組大鼠在給藥7 d后，DAI顯著降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠大體形態(tài)損傷的影響

正常組大鼠的結(jié)腸細長均勻，呈粉紅色而且色澤均一；模型組大鼠結(jié)腸形成巨結(jié)腸，黏膜表面壞死，病變處黏膜呈黑褐色，腸壁增厚，伴有潰瘍出現(xiàn)，而且出現(xiàn)不同程度充血，與正常組比較，結(jié)腸長度顯著縮短(P<0.05)，結(jié)腸重量和形態(tài)損傷評分顯著升高(P<0.05)。陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組可見結(jié)腸充血減輕，恢復較好，未見明顯巨結(jié)腸，僅見個別出現(xiàn)小潰瘍，與模型組比較，結(jié)腸長度顯著延長(P<0.05)，結(jié)腸重量和形態(tài)損傷評分顯著降低(P<0.05)，見圖1。

表1 各組大鼠DAI的測定結(jié)果

*P<0.05vsnormal group;﹟P<0.05vsmodel group.

Figure 1. The results of colon length (A), colon weight (B) and morphological damage score (C) in each group of rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

圖1各組大鼠結(jié)腸長度、結(jié)腸重量和組織病理學評分的結(jié)果

3真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸道黏膜通透性的影響

與正常組比較，模型組大鼠尿中L/M值顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組大鼠尿中L/M值顯著降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The results of L/M in each group of rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;﹟P<0.05vsmo-del group.

圖2各組大鼠尿中L/M值的測定結(jié)果

4真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織MPO活性的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中MPO活性顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組大鼠結(jié)腸組織中MPO活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The results of colonic MPO activity in each group of rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;﹟P<0.05vsmodel group.

圖3各組大鼠結(jié)腸組織MPO活性的測定結(jié)果

5真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠杯狀細胞的影響

PAS染色結(jié)果顯示，正常組大鼠的結(jié)腸杯狀細胞均勻分布于腸黏膜上皮內(nèi)，呈藍色，體積較大，較為飽滿，成熟的分泌態(tài)細胞較多；與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸成熟的分泌態(tài)細胞較少，杯狀細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，提示模型大鼠存在腸道杯狀細胞數(shù)量和功能的異常。與模型組比較，陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組可見結(jié)腸杯狀細胞數(shù)顯著增多，分泌態(tài)細胞數(shù)量接近正常(P<0.05)，結(jié)腸重量和形態(tài)損傷評分顯著降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The results of goblet cell number in each group of rats (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;﹟P<0.05vsmodel group.

圖4各組大鼠杯狀細胞數(shù)量的測定結(jié)果

6真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清DAO和D-LA水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清DAO和D-LA水平均顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組大鼠血清DAO和D-LA水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The serum DAO (A) and D-LA (B) levels in each group of rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

圖5各組大鼠血清DAO和D-LA水平的測定結(jié)果

7真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織ZO-1和occludin表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠ZO-1和 occludin表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和真人養(yǎng)臟湯高、低劑量組大鼠ZO-1和occludin表達水平均顯著升高(P<0.05)，見圖6。

Figure 6. The results of ZO-1 and occludin expression in each group of rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

圖6各組大鼠結(jié)腸組織ZO-1和occludin表達的測定結(jié)果

討 論

目前研究顯示，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制可能與腸道黏膜屏障功能減弱有關(guān)[11]。當潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病時黏膜屏障功能異常，腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)向腸黏膜固有層移位，從而導致腸道促炎因子的釋放，并進一步損傷腸道上皮細胞，破壞腸黏膜屏障[12]。因此也有研究認為，腸道黏膜屏障的功能受損或許可以被認為是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的始動因素之一[13]。如何有效增強腸道黏膜屏障功能可能是潰瘍性結(jié)腸炎的新的治療手段。

本研究結(jié)果顯示，真人養(yǎng)臟湯顯著延長了潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸長度，降低結(jié)腸重量、形態(tài)損傷評分和DAI評分。以上結(jié)果提示，真人養(yǎng)臟湯能夠有效改善TNBS誘導的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎。

潰瘍性結(jié)腸炎的特征就是腸上皮細胞旁路通透性增高，允許腸腔內(nèi)病原菌及其毒素通過并進入上皮下層，這是導致炎癥反復發(fā)作的重要原因。測定尿中L/M值可間接且全面、準確地反映腸黏膜的通透性變化，L/M值增大，說明潰瘍性結(jié)腸炎腸通透性增高，腸屏障功能損害[14]。本研究結(jié)果顯示，真人養(yǎng)臟湯能有效降低L/M值，表明真人養(yǎng)臟湯加強了潰瘍性結(jié)腸炎的腸黏膜屏障功能。

由于MPO是中性粒細胞中含量比較高的一種酶，所以檢測MPO的活性可間接反映中性粒細胞浸潤的數(shù)量及程度。本研究前期實驗表明真人養(yǎng)臟湯可顯著減輕潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中炎細胞浸潤程度和減少炎癥因子的釋放[6-7]，結(jié)合本次實驗研究結(jié)果，真人養(yǎng)臟湯可降低潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中MPO活性，提示真人養(yǎng)臟湯可能具有促進潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠黏膜修復、改善黏膜屏障功能的作用。

DAO是腸道黏膜上皮細胞中的細胞內(nèi)酶，當腸道黏膜上皮損傷時DAO釋放入血，因而血清DAO升高可間接反映腸道黏膜上皮細胞損傷程度，可用來判斷腸黏膜屏障功能的狀態(tài)[10]。作為細菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物D-LA通過受損黏膜入血，使血漿D-LA水平升高，故監(jiān)測血漿D-LA可及時反映腸黏膜損害程度[15]。同時，杯狀細胞通過分泌黏蛋白來發(fā)揮黏膜屏障作用，潰瘍性結(jié)腸炎最典型的病理特點是大量隱窩壞死，形成膿腫，破壞大量杯狀細胞[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，真人養(yǎng)臟湯還具有降低潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清DAO和D-LA水平的作用，增加分泌狀態(tài)的杯狀細胞數(shù)量。進一步提示，真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療作用可能與其改善腸道黏膜屏障功能有關(guān)。

細胞間緊密連接主要包括3種連接方式：黏附型連接(adherens junctions，AJs)、緊密型連接(tight junctions，TJs)和縫隙型連接，而緊密連接是細胞與細胞之間最重要的連接方式，形成腸上皮細胞之間的調(diào)控屏障[17]。緊密連接蛋白被認為是維持腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整性的重要組成部分，并在腸黏膜屏障功能的維持中起到?jīng)Q定性作用。Occludin蛋白是第一個被發(fā)現(xiàn)的定位于緊密連接的跨膜蛋白，在腸緊密連接屏障中發(fā)揮重要作用，其表達降低是導致腸上皮緊密連接通透性增加的重要機制，在潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠中，occludin蛋白表達明顯降低[17]；而ZO-1蛋白是腸上皮細胞間的重要連接蛋白，是腸黏膜屏障的重要組成結(jié)構(gòu)，在潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠中，ZO-1蛋白表達明顯降低[18]。為進一步討論真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠腸道黏膜屏障功能保護作用的可能機制，本研究檢測了ZO-1和occludin蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)，真人養(yǎng)臟湯可顯著升高ZO-1和occludin表達水平。以上結(jié)果提示，真人養(yǎng)臟湯保護潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道上皮細胞黏膜屏障功能的機制可能與升高ZO-1和occludin表達有關(guān)。

綜上所述，真人養(yǎng)臟湯可通過降低腸道黏膜通透性、MPO活性、血清DAO和D-LA水平及升高杯狀細胞數(shù)量而保護潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道上皮細胞黏膜屏障功能，其機制可能與升高ZO-1和occludin表達有關(guān)。關(guān)于真人養(yǎng)臟湯對潰瘍性結(jié)腸炎的黏膜屏障功能的保護作用是否存在其它機制，如對杯狀細胞分泌的黏蛋白和三葉因子多肽是否有影響，我們將繼續(xù)進行探討。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Protective effect of Zhenrenyangzang decoction on intestinal mucosal barrier function in ulcerative colitis rats

WANG Hui1, MAO Jing-lei2, WU Yan-min1, WANG Qi1, LUO Xiao-qing1, GUAN Jie1

(1DepartmentofImmunology,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China;2DepartmentofPharmacy,DaqingOilfieldGeneralHospital,Daqing163000,China.E-mail: 25285280@qq.com)

AIM: To investigate the protective effect of Zhenrenyangzang decoction (ZRYZ) on the intestinal mucosal barrier function and the expression of tight junction proteins， zonula occludens-1 (ZO-1) and occludin， in the colon of rats with trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)-induced ulcerative colitis in order to explore the possible mechanism involved.METHODSMale Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, salazosulfapyridine (SASP) positive control group, high-dose ZRYZ (ZRYZ-H) group and low-dose ZRYZ (ZRYZ-L) group. Except the normal group, the rats in other groups were given the TNBS/50% ethanol mixed solution by enema to make the ulcerative colitis model. The rats in positive control group were given SASP suspension liquid. The rats in ZRYZ-H group and ZRYZ-L group were orally administered with ZRYZ at doses of 30.4 g/kg and 15.2 g/kg, respectively, while the rats in normal group and model group were orally administered with saline. All the drugs were administered to the rats for consecutive 21 d. Disease activity index (DAI) was investigated during the drug treatment, and colon samples were collected after drug administration for evaluating morphological damage score. Intestinal mucosal permeability was measured by detection of lactulose/mannitol (L/M) in urine. Colonic myeloperoxidase (MPO) activity and goblet cell number, serum diamine oxidase (DAO) and D-lactic acid (D-LA) levels， and the colonic expression of ZO-1 and occludin were also measured.RESULTSCompared with normal group, DAI, morphological damage score, L/M value, colonic MPO activity as well as serum D-LA and DAO levels in model group significantly increased (P<0.05), while goblet cell number as well as the expression levels of ZO-1 and occludin in model group were significantly reduced (P<0.05). Compared with model group, DAI, morphological damage score, L/M value, colonic MPO activity as well as serum DAO and D-LA levels in ZRYZ-H group and ZRYZ-L group were reduced significantly (P<0.05), while goblet cell number as well as the expression of ZO-1 and occludin in ZRYZ-H group and ZRYZ-L group increased significantly (P<0.05).CONCLUSIONZRYZ protects the intestinal mucosal barrier function in ulcerative colitis rats by reducing intestinal mucosal permeability, and its mechanisms may be related to increasing the expression of ZO-1 and occludin.

Zhenrenyangzang decoction; Ulcerative colitis; Mucosal barrier; Zonula occludens-1; Occludin

1000- 4718(2017)11- 2053- 07

2017- 03- 30

2017- 05- 17

黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(No. 12531798)

△通訊作者 Tel： 0452-2663164； E-mail： 25285280@qq.com

R242； R574.6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.021