針刺對(duì)運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷大鼠骨骼肌線粒體自噬的影響*

尚畫雨， 付 玉， 夏 志， 周 越， 王瑞元△

(1成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院， 四川 成都 610041； 2井岡山大學(xué)體育學(xué)院， 江西 吉安 343009； 3北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院， 北京 100084)

針刺對(duì)運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷大鼠骨骼肌線粒體自噬的影響*

尚畫雨1,3， 付 玉1， 夏 志2， 周 越3， 王瑞元3△

(1成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院， 四川 成都 610041；2井岡山大學(xué)體育學(xué)院， 江西 吉安 343009；3北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院， 北京 100084)

目的通過(guò)觀察針刺對(duì)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討針刺在運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制。方法將128只成年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照(control，C；n=8)組、單純運(yùn)動(dòng)(exercise，E；n=40)組、單純針刺(acupuncture，A；n=40)組和運(yùn)動(dòng)針刺(exercise and acupuncture，EA；n=40)組。其中，E和EA組進(jìn)行1次下坡跑運(yùn)動(dòng)，A組和EA組(運(yùn)動(dòng)后即刻)施加針刺處理。后3組根據(jù)干預(yù)后不同時(shí)相又分為0 h、12 h、24 h、48 h和72 h亞組(n=8)，分別于對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)分離比目魚肌進(jìn)行檢測(cè)，使用透射電子顯微鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)變化；采用ELISA法檢測(cè)比目魚肌線粒體定量酶檸檬酸合成酶(CS)的含量變化；應(yīng)用Western blot法檢測(cè)骨骼肌PTEN誘導(dǎo)假定激酶1(PINK1)、parkin和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果1次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后大鼠比目魚肌線粒體出現(xiàn)明顯腫脹和肌膜下積聚等超微結(jié)構(gòu)異常變化，伴有大量自噬體形成；同時(shí)CS的含量明顯減少(P<0.05)；線粒體自噬蛋白PINK1、parkin和LC3均出現(xiàn)一過(guò)性的表達(dá)升高(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)后針刺明顯改善了線粒體超微結(jié)構(gòu)的異常變化，減少自噬溶酶體的出現(xiàn)，同時(shí)抑制CS的含量減少，下調(diào)PINK1、parkin和LC3在線粒體上的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論1次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量受損，通過(guò)激活PINK1/parkin途徑誘發(fā)線粒體自噬的過(guò)度發(fā)生。大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后針刺可以緩解骨骼肌線粒體的損傷，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)線粒體外膜蛋白PINK1表達(dá)，抑制其對(duì)下游胞漿蛋白parkin的招募，進(jìn)而影響LC3與線粒體的結(jié)合以抑制線粒體自噬過(guò)度激活。

針刺； 大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)； 骨骼??； 線粒體自噬； PTEN誘導(dǎo)假定激酶1； Parkin蛋白

骨骼肌收縮和舒張是人體運(yùn)動(dòng)的原動(dòng)力。但長(zhǎng)時(shí)間和(或)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，特別是離心運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌纖維會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷(exercise-induced muscle damage，EIMD)，進(jìn)而造成延遲性肌肉酸痛(delayed onset muscle soreness，DOMS)和運(yùn)動(dòng)能力下降，若不及時(shí)治療，將進(jìn)一步加劇運(yùn)動(dòng)損傷并造成慢性疼痛或損傷。因此，探尋促進(jìn)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)快速恢復(fù)的干預(yù)手段，是目前運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。針刺(acupuncture)療法作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法之一，在治療肌肉病患和促進(jìn)肌肉功能恢復(fù)方面占據(jù)重要地位。目前我們實(shí)驗(yàn)室研究認(rèn)為，針刺可有效抑制大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌膠原纖維的增生，加強(qiáng)損傷肌肉中膠原的降解，從而有效地促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后骨骼肌修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)重塑[1]。

近期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EIMD的發(fā)生與骨骼肌細(xì)胞凋亡[2]、自噬[3]和壞死[4]有著極為密切的關(guān)系，其中細(xì)胞自噬作為關(guān)鍵的細(xì)胞降解過(guò)程，可選擇性清除受損線粒體等細(xì)胞器以延緩細(xì)胞衰老[5-6]以及抑制細(xì)胞凋亡[7]，并通過(guò)線粒體自噬作用于線粒體質(zhì)量控制(mitochondrial quality control，MQC)。線粒體自噬的直接動(dòng)力來(lái)自于線粒體自噬蛋白及其相關(guān)的受體蛋白，因此研究線粒體自噬蛋白及其相關(guān)受體蛋白在運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相的變化尤為必要，在進(jìn)一步證明大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘發(fā)線粒體自噬的同時(shí)也有助于探明EIMD是否與線粒體自噬的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，從而找到預(yù)防EIMD的方法。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，除NIP3樣蛋白X(NIP3-like protein X, NIX/BNIP3L)、BCL2/腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1B 19 kD protein-interacting protein 3, BNIP3)和線粒體外膜蛋白FUNDC1(FUN14 domain containing 1)是與低氧環(huán)境關(guān)系密切的線粒體自噬途徑外，介導(dǎo)骨骼肌線粒體自噬途徑的主要為PTEN誘導(dǎo)假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)/parkin通路[8-9]。然而，目前國(guó)內(nèi)外鮮見對(duì)PINK1/parkin介導(dǎo)線粒體自噬與EIMD關(guān)系的研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌損傷動(dòng)物模型，并在運(yùn)動(dòng)后即刻施加針刺干預(yù)，通過(guò)針刺骨骼肌觀察針刺能否對(duì)骨骼肌線粒體損傷起到緩解作用，并分析其作用機(jī)制，為研究針刺干預(yù)骨骼肌損傷的恢復(fù)和預(yù)防提供一定的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1主要儀器與試劑

JEM-1400透射電子顯微鏡(JEOL)；酶標(biāo)儀和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；兔抗PINK1、parkin多克隆抗體和鼠抗線粒體內(nèi)參照細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅳ(cytochrome C oxidease subunit Ⅳ, COXⅣ)單克隆抗體購(gòu)自Abcam；兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；鼠抗胞漿內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz； HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)和山羊抗鼠IgG(H+L)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；BCA蛋白定量試劑盒和動(dòng)物組織線粒體分離試劑盒均為上海碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；大鼠檸檬酸合成酶(citrate synthase, CS)ELISA分析試劑盒為 USCNLIFE 產(chǎn)品；TEMED、Tween-20和β-巰基乙醇購(gòu)自Sigma；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

2動(dòng)物分組

SPF級(jí)Spraque-Dawley(SD)大鼠128只，雄性，8周齡，(221.77±7.32) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照(control，C；n=8)組、單純運(yùn)動(dòng)(exercise，E；n=40)組、單純針刺(acupuncture，A；n=40)組和運(yùn)動(dòng)針刺(exercise and acupuncture，EA；n=40)組。其中，E組、A組和EA組根據(jù)干預(yù)后不同時(shí)點(diǎn)，又分為干預(yù)后0 h(即刻)組、干預(yù)后12 h組、干預(yù)后24 h組、干預(yù)后48 h組和干預(yù)后72 h組。本實(shí)驗(yàn)共分為16個(gè)組別，每組8只。

3運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

采用小動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)進(jìn)行大鼠運(yùn)動(dòng)干預(yù)。在正式實(shí)驗(yàn)前所有運(yùn)動(dòng)組的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行2 d適應(yīng)性訓(xùn)練：第1天跑臺(tái)坡度0°，16 m/min，5 min；第2天跑臺(tái)坡度0°，16 m/min，10 min。

在適應(yīng)訓(xùn)練后間歇休息1 d，次日開始正式實(shí)驗(yàn)。本研究的運(yùn)動(dòng)方案參照Armstrong等[10]的離心運(yùn)動(dòng)模型，采取持續(xù)性下坡跑，跑臺(tái)坡度為-16°，速度為16 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為90 min。

4針刺干預(yù)方案

在1次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻(0 h)對(duì)EA組大鼠進(jìn)行針刺干預(yù)，同期對(duì)A組予以相同的針刺處理。固定好大鼠后對(duì)其雙后肢進(jìn)行消毒，用直徑0.25 mm的針灸針[漢醫(yī)牌，津食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2009第2270002號(hào)]沿大鼠小腿三頭肌的縱向，從遠(yuǎn)端斜刺(進(jìn)針角度約30°)穿過(guò)小腿三頭肌肌腹，并留針2 min[11]。

5測(cè)試指標(biāo)與方法

5.1透射電鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)點(diǎn)，將大鼠分批稱重后經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，迅速分離大鼠比目魚肌，用刀片去除兩側(cè)肌腱和結(jié)締組織，剪取約1 mm×1 mm×1 mm的小塊比目魚肌，然后放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液，隨后用0.1 mol/L PBS沖洗，再用1%鋨酸固定，用0.1 mol/L PBS再次沖洗后進(jìn)行脫水(乙醇溶液梯度為50%、70%、90%和100%)，環(huán)氧樹脂(Spurr epoxy)包埋后將其縱切，制成超薄切片，待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察其線粒體超微結(jié)構(gòu)。每1張組織切片，先在低倍視野(×500～1 000)下確定觀察區(qū)域，后在高倍視野(×2 000～8 000)下觀察其超微結(jié)構(gòu)，主要觀察線粒體的分布、大小、形態(tài)、嵴的結(jié)構(gòu)和自噬體的形成變化等。

5.2ELISA檢測(cè)比目魚肌線粒體CS的含量 切取100 mg新鮮的比目魚肌放入離心管內(nèi)稱重后，使用動(dòng)物組織線粒體分離試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書行差速離心提取骨骼肌線粒體。采用大鼠CS ELISA分析試劑盒檢測(cè)酶的含量，測(cè)試步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

5.3Western blot測(cè)定比目魚肌PINK1及線粒體parkin和LC3的蛋白含量 將稱取的比目魚肌置于研缽中；加入液氮，將組織研磨成粉末后按照1 mg組織加入10 μL裂解液的比例進(jìn)行裂解，再以4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后統(tǒng)一調(diào)整，使上樣量保持一致。然后以4∶1比例加入5×上樣緩沖液，98 ℃煮沸5 min。取已分裝保存的樣品加樣，樣品體積每孔20 μL，蛋白濃度1.5 g/L。隨后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉1 h后加 I 抗(PINK1 1∶500，GAPDH 1∶1 000， parkin 1∶1 000, LC3 1∶500, COXⅣ 1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。漂洗后加 II 抗(1∶5 000)，室溫下孵育1 h后放入凝膠成像系統(tǒng)中拍攝保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用Gel-Pro軟件分析蛋白條帶灰度值。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)，對(duì)處理因素和取材時(shí)間因素的主效應(yīng)以及兩者的交互作用進(jìn)行分析。各組間的單獨(dú)效應(yīng)統(tǒng)計(jì)方法使用單因素方差分析，若方差齊性，采用SNK-q法進(jìn)行檢驗(yàn)；若方差不具齊性，則將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換至齊性后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)于不能轉(zhuǎn)換至齊性的指標(biāo)數(shù)據(jù)，直接采用Tamhane’s T2的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

本實(shí)驗(yàn)使用透射電鏡觀察了1次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1) C組大鼠骨骼肌線粒體均勻分布于Z線兩側(cè)，肌膜下較少；線粒體呈細(xì)長(zhǎng)桿狀和橢圓形，大小均一，未觀察到明顯的自噬體(雙層膜結(jié)構(gòu))。(2) E組大鼠在一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體分布不均，在肌膜下大量積聚，出現(xiàn)大量不同成熟階段的自噬體(如圖1中白色空心箭頭所示)。其中在運(yùn)動(dòng)后即刻，線粒體開始變大、腫脹，大小不一；運(yùn)動(dòng)后12 h，線粒體腫脹、變圓，此時(shí)線粒體損傷最為嚴(yán)重；運(yùn)動(dòng)后24 h，Z線較為清晰，肌膜下線粒體數(shù)量減少，線粒體形態(tài)有所恢復(fù)；運(yùn)動(dòng)后48 h線粒體再次出現(xiàn)損傷表現(xiàn)，但線粒體損傷程度小于運(yùn)動(dòng)后12 h的表現(xiàn)；運(yùn)動(dòng)后72 h線粒體的形態(tài)基本恢復(fù)到正常水平。(3) EA組大鼠在運(yùn)動(dòng)針刺后可見自噬體與單層被膜的溶酶體融合形成自噬溶酶體(如圖1中黑色箭頭所示)。運(yùn)動(dòng)針刺后即刻肌膜下線粒體較多，部分線粒體變圓、腫脹，有自噬體形成；運(yùn)動(dòng)針刺后12 h線粒體損傷最為嚴(yán)重，其表現(xiàn)比單純運(yùn)動(dòng)后12 h較輕，肌膜下線粒體積聚減少，但此時(shí)線粒體仍較大，有自噬溶酶體形成；在運(yùn)動(dòng)針刺后24 h和48 h，觀察到線粒體的結(jié)構(gòu)逐漸向正常結(jié)構(gòu)恢復(fù)的趨勢(shì)，仍可見自噬溶酶體；運(yùn)動(dòng)針刺后72 h，線粒體已經(jīng)恢復(fù)到正常狀態(tài)，未觀察到明顯的自噬體和自噬溶酶體，見圖1。

Figure 1. Ultrastructural and autophagic changes of mitochondria at different time points after exercise and acupuncture (transmission electron microscopy, ×2 000). White hollow arrows show autophagosomes and black arrows show autophagolysosomes.

圖1運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相線粒體超微結(jié)構(gòu)與自噬體的變化

2骨骼肌線粒體CS含量的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) A組在處理后CS含量整體上呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢(shì)，各時(shí)相與C組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(2) E組在運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相線粒體中CS含量呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，各時(shí)相均低于A組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，其中在12 h和24 h差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，且在運(yùn)動(dòng)后即刻和24 h CS含量明顯低于C組(P<0.05)。(3) EA組在處理后CS含量總體呈先減少后增多的趨勢(shì)，各時(shí)相均略高于E組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，但差異不顯著，而在針刺后24 h CS含量較C組及A組均明顯減少(P<0.05)，見表1。

表1 運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相線粒體CS含量變化

*P<0.05vsC group;☆P<0.05vsA group.

3骨骼肌PINK1蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) A組在處理后骨骼肌PINK1蛋白的表達(dá)圍繞C組的水平上下波動(dòng)，但與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(2) E組在運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌PINK1蛋白表達(dá)總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，除72 h外其余時(shí)相E組蛋白表達(dá)均高于A組，其中在12 h和24 h 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，且在運(yùn)動(dòng)后12 h較C組明顯升高了1.55倍(P<0.05)，此后逐漸下降，運(yùn)動(dòng)后72 h PINK1蛋白表達(dá)與運(yùn)動(dòng)后12 h和24 h相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。(3) EA組在處理后呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在針刺后12 h EA組蛋白表達(dá)較C組顯著升高了73.8%，較A組升高了77.7%，且與EA 48 h組及72 h組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖2。

4骨骼肌線粒體中parkin蛋白表達(dá)的變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) A組在處理后線粒體中parkin蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(2) E組在運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相骨骼肌線粒體中parkin蛋白表達(dá)整體呈先升高，然后逐漸下降的趨勢(shì)。E組各時(shí)相parkin蛋白表達(dá)較A組均有所升高，其中在運(yùn)動(dòng)后即刻差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，且E組在運(yùn)動(dòng)后即刻和24 h蛋白表達(dá)明顯高于C組(P<0.05)，此后逐漸降低，運(yùn)動(dòng)后72 h恢復(fù)至C組水平，此時(shí)明顯低于即刻水平(P<0.05)。(3) EA組在處理后parkin蛋白表達(dá)總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中EA組在針刺后即刻出現(xiàn)最高峰，此時(shí)較72 h組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。

5骨骼肌線粒體中LC3蛋白表達(dá)的變化

LC3經(jīng)過(guò)加工成為L(zhǎng)C3-Ⅰ，LC3-Ⅰ被Atg3切除22個(gè)氨基酸，變成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ特異地與自噬體膜結(jié)合，其含量與自噬體形成密切相關(guān)，被視為自噬體的“標(biāo)志物”[12-13]。且LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變被認(rèn)為是檢測(cè)自噬的一個(gè)金指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1) A組在處理后線粒體中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(2) E組在運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相線粒體中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，除24 h外其余各時(shí)相均高于A組，其中即刻、12 h和48 h較A組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。與C組相比，E組在運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h和48 h差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，比C組分別升高了1.14倍、1.76倍和82.7%，最高峰出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后12 h，此時(shí)明顯高于運(yùn)動(dòng)后即刻水平(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)后24 h和72 h則明顯低于即刻和12 h水平(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)后48 h也顯著低于12 h水平(P<0.05)。(3) EA組在處理后LC3-Ⅱ/Ⅰ比值總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，各時(shí)相均低于E組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，在12 h組差異顯著(P<0.05)，而A組在各時(shí)相的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。此外EA組在針刺后12 h與C組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，比C組升高了71.8%，24 h出現(xiàn)下調(diào)，72 h蛋白表達(dá)恢復(fù)至C組水平，見圖4。

Figure 2. The protein expression of PINK1 in the skeletal muscle at different time points after exercise and acupuncture. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsC group;△P<0.05vsEA 12 h group;☆P<0.05vsA group.

圖2運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相骨骼肌PINK1蛋白表達(dá)的變化

Figure 3. The protein expression of parkin in the mitochondria at different time points after exercise and acupuncture. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsC group;△P<0.05vsEA 0 h group;☆P<0.05vsA group.

圖3運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相線粒體中Parkin蛋白表達(dá)的變化

討 論

1針刺對(duì)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響

針刺療法作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法之一，治療骨骼肌損傷歷史悠久，療效肯定。早期研究報(bào)道了針刺機(jī)體特定的部位，可將局部刺激信號(hào)通過(guò)組織間機(jī)械力的傳導(dǎo)傳遞給周邊組織，并產(chǎn)生相應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞后續(xù)功能性反應(yīng)[14-16]。盧鼎厚等[17]按照《靈樞》中提出的應(yīng)用斜刺針?lè)ㄖ委熂∪鈸p傷的理論依據(jù)，摸索采用針刺方法干預(yù)骨骼肌損傷，取得了良好的治療效果。段昌平等[16]通過(guò)人體肌肉活檢發(fā)現(xiàn)，在大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后對(duì)肌肉進(jìn)行針刺，可以抑制線粒體腫脹，使線粒體數(shù)量增多，緩解肌痙攣，從而促進(jìn)肌纖維超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)，對(duì)DOMS有較好的緩解作用。張學(xué)林等[18]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺干預(yù)能修復(fù)骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷，有效治療大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)引起的骨骼肌過(guò)度使用損傷，其效應(yīng)與增加線粒體數(shù)量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，提取離心運(yùn)動(dòng)最易損傷的慢肌(比目魚肌)進(jìn)行研究，觀察斜刺比目魚肌對(duì)其線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響，試圖從線粒體的角度來(lái)探尋針刺緩解骨骼肌損傷的作用效果及機(jī)理。首先，我們沿用盧鼎厚等[19]肌肉斜刺的針刺手法，觀察了運(yùn)動(dòng)針刺后比目魚肌線粒體的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果可見，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后比目魚肌線粒體出現(xiàn)明顯腫脹和肌膜下積聚等超微結(jié)構(gòu)異常變化，有大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體形成。然而，運(yùn)動(dòng)后針刺干預(yù)對(duì)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的線粒體結(jié)構(gòu)破壞有緩解作用，自噬體積累的情況得到明顯改善，能見到與溶酶體融合的自噬體(即自噬溶酶體)，促進(jìn)了骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)。在此基礎(chǔ)上，我們還檢測(cè)了針刺處理后比目魚肌線粒體定量酶[19-20]CS的含量，以觀察線粒體數(shù)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純針刺對(duì)正常骨骼肌組織線粒體數(shù)量沒(méi)有影響。EA組總體上各時(shí)相CS含量均高于E組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，其中48 h和72 h分別增多了19.2%和19.8%，提示運(yùn)動(dòng)后施加針刺能有效增加運(yùn)動(dòng)后線粒體的數(shù)量，這與段昌平[16]、張學(xué)林等[18]的研究結(jié)果一致，表明大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致骨骼肌線粒體受損，運(yùn)動(dòng)后針刺干預(yù)能通過(guò)改善骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)和增加線粒體數(shù)量，從而減輕大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌線粒體的損害，這可能是針刺緩解骨骼肌線粒體損傷的重要原因之一。

Figure 4. The protein expression of LC3 in the mitochondria at different time points after exercise and acupuncture. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsC group;△P<0.05vs0 h group;▲P<0.05vs12 h group;☆P<0.05vsA group;■P<0.05vsE group.

圖4運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相線粒體中LC3蛋白表達(dá)的變化

2針刺對(duì)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌線粒體自噬蛋白的影響

目前已證實(shí)，PINK1是parkin的上游蛋白，PINK1/parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬途徑在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬依賴的對(duì)受損線粒體的降解過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21-23]，但在運(yùn)動(dòng)及針刺誘導(dǎo)線粒體自噬中所扮演的角色仍知之甚少。Vainshtein等[24]報(bào)道，1次力竭性運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體融合分裂和自噬能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為parkin和Drp1表達(dá)上調(diào)。崔迪等[25]對(duì)小鼠進(jìn)行6周高脂膳食干預(yù)后，小鼠骨骼肌中線粒體自噬相關(guān)的PINK1/parkin、NIX/BNIP3信號(hào)在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均存在不同程度的異常，但耐力訓(xùn)練可改善線粒體自噬水平，穩(wěn)定線粒體功能，而且PINK1/parkin信號(hào)相對(duì)于NIX/BNIP3信號(hào)的變化在骨骼肌中更加敏感。以上說(shuō)明，適度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可在一定程度上激活自噬水平，這有利于維持骨骼肌的穩(wěn)態(tài)以及介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)；而當(dāng)不良應(yīng)激作用于機(jī)體時(shí)，引起自噬水平的過(guò)度激活可能會(huì)導(dǎo)致線粒體以及細(xì)胞的功能異常。此外，何方[26]報(bào)道了帕金森病模型大鼠中腦黑質(zhì)部parkin、泛素(ubiquitin, Ub)及泛素激活酶1(ubiquitin-activating enzyme 1，UBE1)表達(dá)較健康大鼠顯著降低，經(jīng)電針預(yù)處理或治療后parkin、Ub和UBE1表達(dá)高于模型大鼠，提示針刺防治帕金森病的機(jī)制可能與改善泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能有關(guān)。然而，有關(guān)針刺骨骼肌對(duì)線粒體自噬蛋白影響的研究目前尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一些嘗試性的探索。

本研究觀察了針刺對(duì)骨骼肌線粒體自噬蛋白PINK1和parkin的影響。首先我們發(fā)現(xiàn)，A組在處理后骨骼肌線粒體外膜蛋白PINK1的表達(dá)與C組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示針刺對(duì)正常骨骼肌組織PINK1表達(dá)可能沒(méi)有影響。EA組在處理后PINK1蛋白表達(dá)總體上低于E組水平，在處理后0 h、12 h、24 h和48 h分別下調(diào)了50.3%、31.9%、52.6%和42.7%，提示運(yùn)動(dòng)后針刺干預(yù)可下調(diào)運(yùn)動(dòng)后PINK1蛋白的表達(dá)。結(jié)合研究中大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后施加針刺能促進(jìn)骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)的結(jié)果，PINK1作為損傷線粒體的分子感受器，運(yùn)動(dòng)針刺后PINK1蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)雖與E組基本相似，但變化幅度要小很多，這也可說(shuō)明針刺具有緩解運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的線粒體結(jié)構(gòu)破壞的作用。

其次，我們還發(fā)現(xiàn)，A組在處理后線粒體中parkin蛋白的表達(dá)與C組相比無(wú)明顯差異，提示針刺對(duì)正常骨骼肌線粒體parkin表達(dá)可能沒(méi)有影響。EA組在處理后parkin蛋白表達(dá)總體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，各時(shí)相表達(dá)均低于E組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，且在12 h時(shí)下降幅度最大。在整體上parkin表達(dá)升高趨勢(shì)與E組基本相似，但升高幅度比E組小，提示運(yùn)動(dòng)后施加針刺能下調(diào)運(yùn)動(dòng)后線粒體中parkin的表達(dá)。Parkin介導(dǎo)受損線粒體的清除(線粒體自噬)，在PINK1誘導(dǎo)途徑下游起作用，在針刺干預(yù)措施下，PINK1蛋白表達(dá)在處理后12 h和24 h左右起到的緩解作用最為明顯，因此，提示在大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行針刺下調(diào)了PINK1蛋白表達(dá)，減少了PINK1在線粒體上的累積，使得胞漿中的parkin轉(zhuǎn)移至線粒體的量也隨之減少，可能通過(guò)對(duì)線粒體自噬的調(diào)節(jié)而起到了緩解線粒體損傷的作用。

進(jìn)一步，我們采用Western blot方法檢測(cè)自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3在線粒體中的表達(dá)，以求證針刺骨骼肌是否對(duì)線粒體自噬具有調(diào)節(jié)作用，及針刺緩解自噬體積累的作用機(jī)制是否與改善線粒體自噬發(fā)生程度有關(guān)。結(jié)果顯示，A組在處理后線粒體中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示針刺對(duì)正常骨骼肌線粒體LC3表達(dá)可能沒(méi)有作用。另外，E組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h和48 h顯著上調(diào)，比C組分別升高了1.14倍、1.76倍和82.7%，最高峰出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后12 h，由此可看出，本研究結(jié)果與電鏡下觀察到的結(jié)果相符，表明大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可引起大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬體的積聚。而EA組在處理后LC3-Ⅱ/Ⅰ比值總體變化趨勢(shì)與E組相似，但相同時(shí)點(diǎn)和E組相比，EA組均低于E組水平，且在12 h組差異顯著，此時(shí)下調(diào)了37.7%，提示運(yùn)動(dòng)后針刺干預(yù)可以下調(diào)運(yùn)動(dòng)后線粒體中LC3的表達(dá)。結(jié)合線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，可以看出，運(yùn)動(dòng)后施加針刺顯著減少了自噬體與線粒體的結(jié)合，自噬體得到了較好地清除，有自噬溶酶體的出現(xiàn)，我們分析，針刺可能是通過(guò)減少胞漿蛋白parkin的線粒體轉(zhuǎn)位，抑制其E3泛素酶活性，從而改善了由于運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的線粒體自噬過(guò)度激活狀態(tài)。然而，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)胞漿parkin實(shí)現(xiàn)線粒體轉(zhuǎn)位及針刺介導(dǎo)parkin調(diào)控自噬的機(jī)制仍未明確，有待于后續(xù)研究進(jìn)一步闡明。

目前，線粒體自噬在細(xì)胞死亡中的作用仍然存在爭(zhēng)議。據(jù)報(bào)道，線粒體自噬負(fù)責(zé)清除受損的線粒體，并將分解后的物質(zhì)循環(huán)再利用[27]。然而，線粒體自噬也可誘發(fā)致死性后果。如果太多的線粒體(包括健康的線粒體)由大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)過(guò)度的自噬清除或者降解，致使線粒體數(shù)量顯著減少，細(xì)胞活力則不能維持，最終引發(fā)自噬性細(xì)胞死亡或凋亡。目前，線粒體自噬性死亡已被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的形式之一[28-29]，除細(xì)胞自噬性死亡而外，細(xì)胞死亡的方式還包括兩大類，即細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。過(guò)往研究中，對(duì)于EIMD機(jī)理研究主要基于以下3種死亡方式：(1)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)上調(diào)絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的表達(dá)，促進(jìn)X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)與Omi/HtrA2相互結(jié)合，進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3的活性，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這一過(guò)程已在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中證實(shí)，并推測(cè)針刺治療運(yùn)動(dòng)性骨骼肌線粒體損傷主要在于減弱線粒體凋亡機(jī)制[30]。(2)正常肌肉在離心運(yùn)動(dòng)中被過(guò)度拉伸會(huì)丟失一些肌細(xì)胞膜蛋白，從而導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡或壞死[31]。(3)第3種死亡方式，即自噬性死亡，這種細(xì)胞死亡方式往往伴有特征性雙層膜包裹的自噬體的形成，而目前國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究我們發(fā)現(xiàn)了一次大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)引起了過(guò)度的線粒體自噬的發(fā)生，可能加重了線粒體丟失，使得線粒體供能出現(xiàn)障礙，這一發(fā)現(xiàn)是對(duì)運(yùn)動(dòng)致細(xì)胞自噬性死亡的這一機(jī)制的重要探索，但仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

基于大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)于線粒體自噬的影響，選擇有針對(duì)性的線粒體自噬的抑制劑和其它干預(yù)方式進(jìn)行保護(hù)，很可能為預(yù)防運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷提供新的線索。本研究我們發(fā)現(xiàn)，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后結(jié)合針刺有效地下調(diào)了運(yùn)動(dòng)后PINK1和Parkin在線粒體上的表達(dá)，最終LC3與線粒體的結(jié)合量也明顯下降，從而抑制了線粒體自噬過(guò)度激活，這可能是大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后針刺緩解線粒體損傷的又一機(jī)制。此外，值得注意的是，針刺抑制過(guò)度線粒體自噬可以恢復(fù)線粒體數(shù)量，線粒體自噬的抑制防止了線粒體異常清除并逆轉(zhuǎn)了線粒體丟失，這可能是線粒體的產(chǎn)能恢復(fù)正常的重要原因。今后的研究中還應(yīng)尋求更為直接的證據(jù)，以探明線粒體自噬過(guò)度激活究竟是線粒體丟失的原因還是后果。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of acupuncture on mitophagy of skeletal muscle in rats with exercise-induced skeletal muscle damage

SHANG Hua-yu1，3, FU Yu1, XIA Zhi2, ZHOU Yue3, WANG Rui-yuan3

(1SchoolofSportMedicineandHealth,ChengduSportUniversity,Chengdu610041,China;2PhysicalEducationCollegeofJinggangshanUniversity,Ji’an343009,China;3SportScienceCollegeofBeijingSportUniversity,Beijing100084,China.E-mail:wangry@vip.sina.com)

AIM: The effect of acupuncture on mitophagy-related protein expression in skeletal muscle of rats after heavy-load exercise was investigated to explore the role of acupuncture in the repairment of exercise-induced skeletal muscle damage.METHODSMale adult Sprague-Dawley rats (n=128) were randomly divided into 4 groups: control (C,n=8) group, exercise (E,n=40) group, acupuncture (A,n=40) group, and exercise and acupuncture (EA,n=40) group. The rats in E group and EA group performed an eccentric exercise, and the rats in A group and EA group immediately after exercise

acupuncture treatment. The rats in the latter 3 groups were further divided into 0 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h sub-groups (n=8), and soleus muscle was collected at each time point. The transmission electron microscopy was used to observe the ultrastructural changes of the mitochondria in skeletal muscle. The content of citrate synthase (CS) was measured by ELISA. The protein expression of skeletal muscle PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1), parkin and microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) was determined by Western blot.RESULTSAfter the heavy-load exercise, the mitochondria swelled and accumulated under cell membrane. The number of mitophagosomes was increased， and the content of CS was significantly decreased (P<0.05). The expression of PINK1, parkin and LC3 was significantly elevated (P<0.05). However, the acupuncture intervention after exercise promoted the recovery of mitochondrial ultrastructure, attenuated mitophagolysosome formation, maintained CS content and down-regulated the expression of PINK1, parkin and LC3 (P<0.05).CONCLUSIONHeavy-load exercise causes the damages of mitochondrial structure and function in the skeletal muscle and activates PINK1/parkin pathway to induce excessive occurrence of mitophagy. Acupuncture intervention after exercise is able to alleviate the damage of mitochondria in the skeletal muscle through decreasing the expression of mitochondrial outer membrane protein PINK1, reducing the recruitment of downstream cytoplasmic protein parkin, thereby affecting the combination of LC3 and mitochondria to inhibit the overactivation of mitophagy.

Acupuncture; Heavy-load exercise; Skeletal muscle; Mitophagy; PTEN-induced putative kinase 1; Parkin protein

1000- 4718(2017)11- 2038- 09

2017- 05- 10

2017- 07- 10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31471133)；國(guó)家體育總局運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(No. CX17B04)；成都體育學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(No. 17YJ04)；成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康研究所創(chuàng)新課題(No. CX17C02)

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R873; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.019